Name: isolation of adult spinal cord nuclei for massively parallel single-nucleus rna sequencing
Uploaded: 2018-10-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af programmet murene af NINDS (1 ZIA NS003153 02) og NIDCD (1 ZIA DC000059 18). Vi takker L. Li og kt Dobrott for deres tekniske support og nyttige diskussioner og C. Kathe for gennemgang af håndskriftet.

Alle dyr arbejde blev udført i overensstemmelse med en protokol, der er godkendt af det nationale Institut for neurologiske forstyrrelser og slagtilfælde Animal Care og brug udvalg. Afbalanceret prøver af mandlige og kvindelige ICR/CD-1 wild-type mus, mellem 8 og 12 uger gamle, blev brugt til alle eksperimenter. Mus skal håndteres i overensstemmelse med lokale retningslinjer for institutionelle Animal Care og brug udvalget.
1. forberedelse af materialer og buffere
<ol><li>Forberede alle ...

<ol>
	<li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+experience-dependent+transcriptomic+states+in+the+mouse+visual+cortex.">Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).</li><li>Hu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+Cell-Type+Composition+and+Activity-Dependent+Transcriptional+State+in+Mammalian+Brains+by+Massively+Parallel+Single-Nucleus+RNA-Seq.">Dissecting Cell-Type Composition and Activity-Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq.</a> Molecular Cell. 68 (5), 1006-1015 (2017).</li><li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+Activated+Cell+Populations+Using+Single-Cell+RNA-Seq.">Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li><li>Sathyamurthy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+Parallel+Single+Nucleus+Transcriptional+Profiling+Defines+Spinal+Cord+Neurons+and+Their+Activity+during+Behavior.">Massively Parallel Single Nucleus Transcriptional Profiling Defines Spinal Cord Neurons and Their Activity during Behavior.</a> Cell Reports. 22 (8), 2216-2225 (2018).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell.">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).</li><li>Campbell, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+census+of+arcuate+hypothalamus+and+median+eminence+cell+types.">A molecular census of arcuate hypothalamus and median eminence cell types.</a> Nature Neuroscience. 20 (3), 484-496 (2017).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+Reveals+Hypothalamic+Cell+Diversity.">Single-Cell RNA-Seq Reveals Hypothalamic Cell Diversity.</a> Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).</li><li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-cell+RNA-seq+for+marker-free+decomposition+of+tissues+into+cell+types.">Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types.</a> Science. 343 (6172), 776-779 (2014).</li><li>Li, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatosensory+neuron+types+identified+by+high-coverage+single-cell+RNA-sequencing+and+functional+heterogeneity.">Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity.</a> Cell Research. 26 (8), 967 (2016).</li><li>Shin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+with+Waterfall+Reveals+Molecular+Cascades+underlying+Adult+Neurogenesis.">Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis.</a> Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics.">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).</li><li>Usoskin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+classification+of+sensory+neuron+types+by+large-scale+single-cell+RNA+sequencing.">Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing.</a> Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).</li><li>Villani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+new+types+of+human+blood+dendritic+cells,+monocytes,+and+progenitors.">Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors.</a> Science. 356 (6335), (2017).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+structure.+Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).</li><li>Lacar, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+RNA-seq+of+single+neurons+reveals+molecular+signatures+of+activation.">Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation.</a> Nature Communications. 7, 11022 (2016).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain.">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li><li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-sequencing+from+single+nuclei.">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li><li>Krishnaswami, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+single+nuclei+for+RNA-seq+to+capture+the+transcriptome+of+postmortem+neurons.">Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons.</a> Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).</li><li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+nuclei+isolation+from+human+postmortem+brain+tissue.">Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).</li><li>Bergmann, O., Jovinge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+cardiomyocyte+nuclei+from+post-mortem+tissue.">Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Nohara, K., Chen, Z., Yoo, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Filtration-based+Method+of+Preparing+High-quality+Nuclei+from+Cross-linked+Skeletal+Muscle+for+Chromatin+Immunoprecipitation.">A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).</li><li>Halder, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+changes+in+plasticity+genes+accompany+the+formation+and+maintenance+of+memory.">DNA methylation changes in plasticity genes accompany the formation and maintenance of memory.</a> Nature Neuroscience. 19 (1), 102-110 (2016).</li><li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-nucleus+RNA-seq+with+DroNc-seq.">Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq.</a> Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).</li><li>. Sample Preparation Demonstrated Protocols: Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing</a> (2018)</li><li>10X Genomics. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single Cell 3' Reagent Kits v2 User Guide. , (2018).</li><li>Fu, Y., Rusznak, Z., Herculano-Houzel, S., Watson, C., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+composition+characterizing+postnatal+development+and+maturation+of+the+mouse+brain+and+spinal+cord.">Cellular composition characterizing postnatal development and maturation of the mouse brain and spinal cord.</a> Brain Structure and Function. 218 (5), 1337-1354 (2013).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+strategy+for+single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+confirms+accuracy+in+predicted+cell-type+expression+from+nuclear+RNA.">A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6031 (2017).</li><li>Bakken, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equivalent+high-resolution+identification+of+neuronal+cell+types+with+single-nucleus+and+single-cell+RNA-sequencing.">Equivalent high-resolution identification of neuronal cell types with single-nucleus and single-cell RNA-sequencing.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Div-Seq:+Single-nucleus+RNA-Seq+reveals+dynamics+of+rare+adult+newborn+neurons.">Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons.</a> Science. 353 (6302), 925-928 (2016).</li></ol>

Det ultimative mål for denne protokol er at isolere kerner indeholder høj kvalitet RNA for downstream transcriptional analyse. Vi tilpasset snRNA-Seq metoder for at profilere alle celletyper i rygmarven. I første omgang, fandt vi, at typiske celle dissociation metoder var ineffektive for enkelt celle RNA sekventering, da rygmarven neuroner er særligt sårbare over for celledød. Derudover inducerer celle dissociation metoder udtryk af forskellige aktiviteter - og stress-respons gener af op til flere hundredfold. <sup...

Nervesystemet består af heterogene grupper af celler, der viser en bred vifte af morfologiske, biokemiske og elektrofysiologiske egenskaber. Mens hovedparten RNA sekventering har været nyttig til bestemmelse af væv-wide ændringer i genekspression under forskellige betingelser, det er til hinder påvisning af transcriptional ændringer på én celle-niveau. Seneste fremskridt inden for en enkelt celle transcriptional analyse har aktiveret klassificering af heterogene celler i funktionelle grupper baseret på deres molekylære repertoire og endda være gearede til at opdage sæt af neuroner, der havde været aktive for nylig. 1 , 2 , 3 , 4 i de sidste ti år, udviklingen af enkelt celle RNA sekventering (scRNA-FF.) har aktiveret studier af genekspression i individuelle celler, hvorfra der er udsigt til celletype mangfoldighed. 5
Fremkomsten af skalerbare metoder såsom massivt parallel scRNA-FF., har givet platforme til sekvens heterogen væv, herunder mange områder i det centrale nervesystem. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 men enkelt celle dissociation metoder kan føre til celledød samt eksperimentelle ændringer i genekspression. 16 seneste arbejde har tilpasset enkelt celle sekventering metoder for at aktivere bevarelse af endogene transcriptional profiler. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 disse strategier har været særligt velegnet til påvisning af umiddelbar tidlig gen (IEG) udtryk efter sensorisk stimulus eller adfærd. 3 , 4 i fremtiden, denne strategi kunne også bruges til at studere dynamiske ændringer i væv i sygdomstilstande eller som reaktion på stress. Af disse metoder, enkelt kerne RNA sekventering (snRNA-FF.) er en lovende tilgang, der involverer ikke stress-fremkaldende celle dissociation og kan bruges på svært at adskille væv (såsom rygmarv), såvel som frosne væv. 4 , 17 , 18 , 19 Adapted fra tidligere kerner isolation metoder,20,21,22,23,25 snRNA-Seq typisk udnytter hurtige væv forstyrrelser og celle lysis under kolde forhold, centrifugering og adskillelsen af kerner fra celleaffald. 4 kerner kan isoleres til den downstream næste generations sekvensering på flere mikrofluid droplet indkapsling platforme. 4 , 7 , 24 , 25 denne metode giver mulighed for et øjebliksbillede af det transkriptionel aktivitet af tusindvis af celler på et tidspunkt.
Der er flere strategier for at frigive kerner fra celler før isolation og sekventering, hver med deres egne fordele og ulemper. Her, vi beskrive og sammenligne to protokoller for at aktivere isolering af kerner fra voksen rygmarven til den downstream massivt parallel snRNA-Seq: vaskemiddel-mekaniske lysis og hypotonic-mekaniske lysering. Vaskemiddel-mekaniske lysis giver komplet væv forstyrrelser og en højere endelige udbytte af kerner. Hypotonic mekanisk-lysis omfatter en kontrollerbar grad af afbrydelse af væv, give mulighed for at vælge en balance mellem mængde og renhed af det endelige nukleare udbytte. Disse metoder giver tilsvarende RNA udbytte, fundne antal gener per kerne, og celletype profilering og også kan begge bruges med succes til snRNA-FF.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15503-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES (pH = 8.0)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgAc</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1028-10X1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA (pH = 8.0)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-46034CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10197777001</td>
			<td>Add DTT just prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Crystalgen</td>
			<td>221-238-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl (pH = 7.4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T2194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>59222C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate-A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A12475-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Crystalgen</td>
			<td>221-133-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.04% BSA</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 U/&#956;L RNAse Inhibitor</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>30281-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oak Ridge Centrifuge Tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3118-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Tissue Dounce (2 ml)</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>885303-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass large clearance pestle</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>885301-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass small clearance pestle</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>885302-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3737001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispersing tool (S 10 N &#8211; 5G)</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3304000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers, 30 &#956;m</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>1000799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XTR Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75003698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterological Pipettes: 5 ml, 10 ml</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>EF16034F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemgenes Barcoding Beads</td>
			<td>Chemgenes</td>
			<td>Macosko-2011-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 &#956;m)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo Astrios Cell Sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B25982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>120262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#8217; Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>120267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish (60 x 15 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of adult spinal cord nuclei for massively parallel single-nucleus rna sequencing

Sondering en enkelt celle genekspression muliggør identifikation af celletype og celle stat. Encellede RNA sekventering fremstod som et effektivt redskab til at studere transcriptional profiler af celler, især i heterogen væv som det centrale nervesystem. Dog kan dissociation metoder kræves til enkelt celle sekvensering føre til eksperimentelle ændringer i gen expression og celle død. Desuden, disse metoder er generelt begrænset til frisk væv, hvilket begrænser undersøgelser på arkivering og bio-bank materiale. Enkelt kerne RNA sekventering (snRNA-FF.) er et attraktivt alternativ for transcriptional studier, givet at det præcist identificerer celletyper, tillader undersøgelse af væv, der er frosne eller vanskeligt at adskille, og reducerer dissociation-induceret transskription. Her præsenterer vi en høj overførselshastighed protokol for hurtige isolering af kerner til downstream snRNA-FF. Denne metode gør det muligt for isolation af kerner fra frisk eller frossen rygmarven prøver og kan kombineres med to massivt parallel droplet indkapsling platforme.

Her, udført vi isolering af kerner fra voksne mus lumbal rygmarven til downstream massivt parallel RNA sekvensering. Protokollen involveret tre hovedkomponenter: væv forstyrrelser og cellulære lysis, homogenisering og saccharose tæthed centrifugering (figur 1). Inden for sekunder viste vaskemiddel-mekaniske lysis en rå kerner forberedelse med et stort antal kerner samt cellulære og væv vragrester (figur 2Atabel 2</...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing at JoVE.com

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Vi præsenterer her, en protokol for at hurtigt isolere høj kvalitet kerner fra frisk eller frossen væv til downstream massivt parallel RNA sekvensering. Vi medtager vaskemiddel-mekaniske og hypotonic-mekaniske væv forstyrrelser og celle lysis muligheder, som begge kan bruges til isolering af kerner.

Isolering af voksen rygmarven kerner for massivt Parallel Single-kernen RNA sekventering

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Single-celle RNA sekventering er et effektivt værktøj til at studere transskriptionelle profiler af celler, især i heterogene væv, såsom centralnervesystemet. Denne protokol indeholder en metode til isolering af kerner til enkeltkerne-RNA-sekvensering. Ved at bruge kerner i stedet for celler, denne metode kan anvendes på vanskeligt at dissociere væv, samt frosne væv.Desuden kan denne metode anvendes til at undersøge celletypespecifikke ændringer i celler efter sygdom eller skade. Begynd denne procedure med mus dødshjælp, som beskrevet i tekstprotokollen. Dernæst lave et snit langs længden af kroppen til at udsætte de indre organer.Udspnå musen ved at trække de indre organer ud af kropshulen ved hjælp af sniver. Brug ikke papirservietter til at rengøre området eller fjerne organer, da dette kan medføre forurenende stoffer. Brug en saks, skære vertebrale kolonne mellem L2 og L3 ryghvirvler.For at skubbe rygmarven, passer en tre milliliter sprøjte, der indeholder iskold PBS med en 25 gauge 1/4 tommer nål. Placer spidsen af nålen i rygsøjlens sakrale ende. Brug to fingre til at klemme ryghvirvlerne for at skabe en stram forsegling omkring spidsen af nålen, og tryk ned på stemplet for at skubbe rygmarven rostrally.Læg rygmarven i en petriskål med iskold PBS. Hvis kun lændedelen af ledningen er påkrævet, trimme væk sakrale og thorax dele af rygmarven. På dette tidspunkt fryses vævet og opbevares ved minus 80 grader Celsius, eller der anvendes straks til enten vaskemiddelmekaniske cellelyse som beskrevet her eller hypotoniske mekaniske lysis som beskrevet i tekstprotokollen.For at bestemme vaskemiddel mekaniske celle lysis, placere lænde rygmarven i en forkølet Dounce homogenis og tilsæt 500 mikroliter af forkølede vaskemiddel lysis buffer. Dounce med fem slag af den løse støder, A, og derefter fem til 10 slag af den stramme støder, B.Undgå at løfte homogenis uden for lysis opløsning i mellem slagtilfælde, og undgå at indføre bobler. Nu placere en 40 mikron si over en pre-kølet 50 milliliter konisk rør og pre-våd med en milliliter lav saccharose buffer.Der tilsættes en milliliter lav saccharosebuffer til Dounce-homogenisen, der indeholder de rå kerner i lysisbufferen, og bland forsigtigt ved pipettering to til tre gange. Pass den rå kerner prep over 40-mikron si, i den forkølede 50 milliliter konisk rør. Der overføres yderligere en milliliter lav saccharosebuffer over 40 mikronsien, hvilket bringer det endelige volumen til tre milliliter af lysisbufferens lave saccharosebuffer og 500 mikroliter.Gentag disse trin, hvis du kombinerer flere ledninger, køling i samme koniske rør. Derefter centrifuge prøven ved 3200 gange G i 10 minutter ved fire grader Celsius. Når centrifugering er færdig, dekantere supernatant.Vi suspenderer paletten ved hjælp af tre milliliter lav saccharose buffer. Svir forsigtigt for at fjerne pellet fra væggen for at lette resuspension. Efter at have ladet prøven sidde på is i to minutter, overføre suspensionen til en Oak Ridge rør.Ved hjælp af homogenisatoren ved indstilling af en homogeniseres kernerne i lav saccharosebuffer i 15 til 30 sekunder, hvor prøven opbevares på is. Brug derefter en serologisk pipette til lag 12,5 milliliter af densitet saccharose buffer, under den lave saccharose buffer homogenat, idet pas på ikke at skabe en boble, der forstyrrer tætheden lag. Centrifuge rørene ved 3200 gange G, i 20 minutter ved fire grader Celsius.Når centrifugering er færdig, straks dekantere supernatant i en svirpende bevægelse. Mens du forsøger denne procedure, er det vigtigt at huske at straks fjerne Oak Ridge rør fra centrifugen, og hurtigt dekantere supernatant. Ved hjælp af 100 mikroliter til en milliliter resuspension løsning, suspenderer vi kernen tilbage på væggen.Undgå myelin rynke panden, der forbliver med vaskemiddel-baserede forberedelse. Undladelse af at gøre disse trin hurtigt kan resultere i en kernepræparat med overskydende cellulære snavs, eller myelin, som kan hindre downstream enkelt-kerne RNA sekventering. Skær kernerne gennem en 30 til 35 mikron pore størrelse si og indsamle i en pre-kølet rør.Fastgør kerneudbyttet ved hjælp af et hæmocytometer for at tælle kerner under en 10 x målsætning, før du fortsætter til enkeltkernen RNA-sekvensering, som beskrevet i tekstprotokollen. Lyse felt- og epifluorescerende billeder af kerner, der er isoleret ved hjælp af den mekaniske lysisprotokol til vaskemiddel, vises ved 10 x. Disse kerner er isoleret på en upartisk måde, hvilket giver mulighed for undersøgelse af endogene genekspressionsprofiler på niveau med en enkelt celle.Vist her, er en repræsentativ tSNE plot af enkelt-kerne RNA sekventering, fra en mus lænde rygmarv, ved hjælp af en massivt parallel dråbe indkapsling platform. Kerner isoleret fra frisk eller frosset væv kan bruges til sekvensering på både kommercielle og akademiske platforme. Denne teknik gør det muligt for forskere at udforske transskriptionelle profiler på encellet niveau, ved hjælp af vanskelige at dissociere væv, såsom rygmarven, eller endda frosne væv, såsom biobank materiale.Mens du forsøger denne procedure, Det er vigtigt at reducere mængden af tid mellem dødshjælp og cellulære lysis. Desuden er det vigtigt at minimere bobler indført i løsninger fra cellulære lysis til resuspension, og at købe kæledyr kerner med omhu. Efter denne procedure kan kerner bruges til alternative anvendelser, f.eks.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Produktion af RNA til transskriptionsanalyse fra Mus Rygmarv Motor Neuron Cell Organer ved Laser Capture Microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

RNA-Seq analyse af differentiel genekspression i elektroporerede Chick embryonale Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Udarbejdelse af Primære Mixed Glia kulturer fra Voksen Mouse Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Hydraulisk Ekstrudering af rygmarven og Isolering af dorsalrodsganglier i Gnavere

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

Spinal Cord Neurons Isolation og Culture fra Neonatal Mus

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

Isolering af region-specifikke mikroglia fra en voksen mus hjerne halvkugle for dyb single-celle RNA Sequencing

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Intra-arteriel levering af neurale stamceller til rotte og mus hjernen: Ansøgning om cerebral iskæmi

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Induction of Complete Transection-Type Spinal Cord Injury in Mice

Induktion af komplet transection-type rygmarvsskade hos mus

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, ...

A Minimally Invasive, Fast Spinal Cord Lateral Hemisection Technique for Modeling Open Spinal Cord Injuries in Rats

Open spinal cord injury techniques modeling laceration-like injuries are time-consuming and invasive because they involve laminectomy. This new technique ...