Name: isolation of adult spinal cord nuclei for massively parallel single-nucleus rna sequencing
Uploaded: 2018-10-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de intramurale programma van NINDS (1 ZIA NS003153 02) en NIDCD (1 ZIA DC000059 18). Wij danken L. Li en C.I. Dobrott voor hun technische ondersteuning en nuttige discussies en C. Kathe voor de herziening van het manuscript.

Alle dierlijke werk werd uitgevoerd overeenkomstig een protocol goedgekeurd door het National Institute of Neurological Disorders beroerte Animal Care en gebruik Comité. Evenwichtig monsters van mannelijke en vrouwelijke ICR/CD-1 wild-type muizen, tussen 8 en 12 weken oud, werden gebruikt voor alle experimenten. Muizen moeten worden behandeld in overeenstemming met lokale institutionele Animal Care en gebruik Comité richtsnoeren.
1. voorbereiding van de materialen en Buffers
<ol><li>Bereid...

<ol>
	<li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+experience-dependent+transcriptomic+states+in+the+mouse+visual+cortex.">Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).</li><li>Hu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+Cell-Type+Composition+and+Activity-Dependent+Transcriptional+State+in+Mammalian+Brains+by+Massively+Parallel+Single-Nucleus+RNA-Seq.">Dissecting Cell-Type Composition and Activity-Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq.</a> Molecular Cell. 68 (5), 1006-1015 (2017).</li><li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+Activated+Cell+Populations+Using+Single-Cell+RNA-Seq.">Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li><li>Sathyamurthy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+Parallel+Single+Nucleus+Transcriptional+Profiling+Defines+Spinal+Cord+Neurons+and+Their+Activity+during+Behavior.">Massively Parallel Single Nucleus Transcriptional Profiling Defines Spinal Cord Neurons and Their Activity during Behavior.</a> Cell Reports. 22 (8), 2216-2225 (2018).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell.">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).</li><li>Campbell, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+census+of+arcuate+hypothalamus+and+median+eminence+cell+types.">A molecular census of arcuate hypothalamus and median eminence cell types.</a> Nature Neuroscience. 20 (3), 484-496 (2017).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+Reveals+Hypothalamic+Cell+Diversity.">Single-Cell RNA-Seq Reveals Hypothalamic Cell Diversity.</a> Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).</li><li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-cell+RNA-seq+for+marker-free+decomposition+of+tissues+into+cell+types.">Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types.</a> Science. 343 (6172), 776-779 (2014).</li><li>Li, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatosensory+neuron+types+identified+by+high-coverage+single-cell+RNA-sequencing+and+functional+heterogeneity.">Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity.</a> Cell Research. 26 (8), 967 (2016).</li><li>Shin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+with+Waterfall+Reveals+Molecular+Cascades+underlying+Adult+Neurogenesis.">Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis.</a> Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics.">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).</li><li>Usoskin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+classification+of+sensory+neuron+types+by+large-scale+single-cell+RNA+sequencing.">Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing.</a> Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).</li><li>Villani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+new+types+of+human+blood+dendritic+cells,+monocytes,+and+progenitors.">Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors.</a> Science. 356 (6335), (2017).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+structure.+Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).</li><li>Lacar, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+RNA-seq+of+single+neurons+reveals+molecular+signatures+of+activation.">Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation.</a> Nature Communications. 7, 11022 (2016).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain.">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li><li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-sequencing+from+single+nuclei.">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li><li>Krishnaswami, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+single+nuclei+for+RNA-seq+to+capture+the+transcriptome+of+postmortem+neurons.">Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons.</a> Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).</li><li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+nuclei+isolation+from+human+postmortem+brain+tissue.">Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).</li><li>Bergmann, O., Jovinge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+cardiomyocyte+nuclei+from+post-mortem+tissue.">Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Nohara, K., Chen, Z., Yoo, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Filtration-based+Method+of+Preparing+High-quality+Nuclei+from+Cross-linked+Skeletal+Muscle+for+Chromatin+Immunoprecipitation.">A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).</li><li>Halder, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+changes+in+plasticity+genes+accompany+the+formation+and+maintenance+of+memory.">DNA methylation changes in plasticity genes accompany the formation and maintenance of memory.</a> Nature Neuroscience. 19 (1), 102-110 (2016).</li><li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-nucleus+RNA-seq+with+DroNc-seq.">Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq.</a> Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).</li><li>. Sample Preparation Demonstrated Protocols: Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing</a> (2018)</li><li>10X Genomics. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single Cell 3' Reagent Kits v2 User Guide. , (2018).</li><li>Fu, Y., Rusznak, Z., Herculano-Houzel, S., Watson, C., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+composition+characterizing+postnatal+development+and+maturation+of+the+mouse+brain+and+spinal+cord.">Cellular composition characterizing postnatal development and maturation of the mouse brain and spinal cord.</a> Brain Structure and Function. 218 (5), 1337-1354 (2013).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+strategy+for+single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+confirms+accuracy+in+predicted+cell-type+expression+from+nuclear+RNA.">A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6031 (2017).</li><li>Bakken, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equivalent+high-resolution+identification+of+neuronal+cell+types+with+single-nucleus+and+single-cell+RNA-sequencing.">Equivalent high-resolution identification of neuronal cell types with single-nucleus and single-cell RNA-sequencing.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Div-Seq:+Single-nucleus+RNA-Seq+reveals+dynamics+of+rare+adult+newborn+neurons.">Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons.</a> Science. 353 (6302), 925-928 (2016).</li></ol>

Het uiteindelijke doel van dit protocol is te isoleren van de kernen met kwalitatief hoogwaardige RNA voor downstream transcriptionele analyse. We snRNA-Seq methoden aangepast om alle van de celtypes in het ruggenmerg profile. Aanvankelijk vonden we dat typische cel dissociatie methoden ineffectief voor eencellige RNA sequencing, waren zoals ruggenmerg neuronen bijzonder kwetsbaar voor de dood van de cel zijn. Bovendien veroorzaken cel dissociatie methoden expressie van genen die diverse activiteiten - en stressrespons d...

Het zenuwstelsel bestaat uit heterogene groepen van cellen die een veelzijdige elektrofysiologische, morfologische en biochemische eigenschappen worden weergegeven. Terwijl de bulk RNA sequencing is nuttig voor het bepalen van weefsel bestrijkende veranderingen in de genexpressie onder verschillende omstandigheden, het verzet zich tegen de detectie van transcriptionele veranderingen op het niveau van één cel. Recente vooruitgang in de eencellige transcriptionele analyse de indeling van heterogene cellen in functionele groepen op basis van hun moleculaire repertoire hebt ingeschakeld en zelfs kunnen worden benut voor het detecteren van sets van neuronen die had onlangs actief geweest. 1 , 2 , 3 , 4 de afgelopen tien jaar heeft de ontwikkeling van eencellige RNA sequencing (scRNA-Seq) de studie van genexpressie in afzonderlijke cellen, die een mening wordt celtype diversiteit. 5
De opkomst van schaalbare benaderingen zoals Seq-massively parallel scRNA, heeft verstrekt platformen op volgorde heterogene weefsels, met inbegrip van vele regio's in het centrale zenuwstelsel. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 echter eencellige dissociatie methoden kunnen leiden tot de dood van de cel, evenals de experimentele wijzigingen in genexpressie. 16 recent werk heeft aangepast methodes van eencellige sequencing zodat behoud van endogene transcriptionele profielen. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 deze strategieën zijn bijzonder geschikt voor het opsporen van onmiddellijke vroege (IEG) genexpressie na zintuiglijke prikkel of gedrag. 3 , 4 In de toekomst deze strategie kan ook worden gebruikt om dynamische veranderingen in weefsels in ziekte staten of in reactie op spanning te bestuderen. Van deze methoden, één kern RNA sequencing (snRNA-Seq) is een veelbelovende aanpak die geen stress-inducerende cel dissociatie en kan gebruikt worden op de moeilijk te distantiëren van weefsel (zoals het ruggenmerg), evenals bevroren weefsel. 4 , 17 , 18 , 19 aangepast uit de vorige kernen isolatie methoden,20,21,22,23,25 snRNA-Seq meestal maakt gebruik van verstoring van de snelle weefsel en cel Lysis onder koude omstandigheden, centrifugeren en scheiding van de kernen van cellulaire puin. 4 kernen kunnen worden geïsoleerd voor de downstream sequencing van de volgende generatie op meerdere microfluidic druppel inkapseling platformen. 4 , 7 , 24 , 25 deze methode zorgt voor een momentopname van de transcriptionele activiteit van duizenden cellen op een moment.
Er zijn meerdere strategieën voor het vrijgeven van de kernen van cellen voor isolatie en sequencing, elk met hun eigen voor- en nadelen. Hier, we beschrijven en vergelijken van twee protocollen om te schakelen van de isolatie van de kernen van de volwassen ruggenmerg voor de downstream massively parallel snRNA-Seq: wasmiddel-mechanische lysis en hypotone-mechanische lysis. Wasmiddel-mechanische lysis biedt volledige weefsel verstoring en een hogere uiteindelijke opbrengst van kernen. Hypotone mechanische-lysis omvat een beheersbare mate van verstoring van de weefsel, een mogelijkheid voor het selecteren van een evenwicht tussen de hoeveelheid en de zuiverheid van het definitieve nucleaire rendement bieden. Deze benaderingen bieden vergelijkbare RNA opbrengst, gedetecteerde aantal genen per celkern, en celtype profilering en ook kunnen zowel worden gebruikt met succes voor snRNA-Seq.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15503-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES (pH = 8.0)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgAc</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1028-10X1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA (pH = 8.0)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-46034CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10197777001</td>
			<td>Add DTT just prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Crystalgen</td>
			<td>221-238-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl (pH = 7.4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T2194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>59222C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate-A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A12475-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Crystalgen</td>
			<td>221-133-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.04% BSA</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 U/&#956;L RNAse Inhibitor</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>30281-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oak Ridge Centrifuge Tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3118-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Tissue Dounce (2 ml)</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>885303-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass large clearance pestle</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>885301-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass small clearance pestle</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>885302-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3737001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispersing tool (S 10 N &#8211; 5G)</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3304000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers, 30 &#956;m</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>1000799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XTR Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75003698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterological Pipettes: 5 ml, 10 ml</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>EF16034F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemgenes Barcoding Beads</td>
			<td>Chemgenes</td>
			<td>Macosko-2011-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 &#956;m)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo Astrios Cell Sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B25982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>120262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#8217; Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>120267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish (60 x 15 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of adult spinal cord nuclei for massively parallel single-nucleus rna sequencing

Een afzonderlijke cel genexpressie indringende maakt de identificatie van celtype en cel staat. Eencellige RNA sequencing heeft ontpopt als een krachtig hulpmiddel voor de studie van transcriptionele profielen van cellen, met name in heterogene weefsels zoals het centrale zenuwstelsel. Echter, dissociatie methoden die nodig zijn voor het eencellige rangschikken kunnen leiden tot experimentele wijzigingen in de gen-expressie en cel dood. Bovendien, deze methoden zijn over het algemeen beperkt aan verse weefsel, waarbinnen de studies over de archivering en bio-bank materiaal te beperken. Enkele kern RNA sequencing (snRNA-Seq) is een aantrekkelijk alternatief voor transcriptionele studies, gezien het feit dat het nauwkeurig identificeert celtypes, vergunningen van de studie van weefsel dat is bevroren of moeilijk te distantiëren, en vermindert dissociatie-geïnduceerde transcriptie. Hier presenteren we een protocol hoge gegevensdoorvoer voor snelle Isolatievan kernen voor downstream snRNA-Seq. Deze methode maakt Isolatievan kernen van vers of bevroren ruggenmerg monsters en kan gecombineerd worden met twee massaal parallelle druppel inkapseling platforms.

Hier, wij isolatie van kernen van de lumbale ruggemerg van volwassen muis voor downstream massaal parallelle RNA sequencing uitgevoerd. Het protocol betrokken drie hoofdonderdelen: weefsel verstoring en cellulaire lysis en homogenisering sacharose dichtheid centrifugeren (Figuur 1). Binnen seconden leverde het wasmiddel-mechanische lysis een ruwe kernen preparaat met een groot aantal kernen, alsmede op cellulair en weefsel puin (figuur 2A...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing at JoVE.com

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Hier presenteren we een protocol om snel isoleren kwalitatief hoogwaardige kernen uit de verse of bevroren weefsel voor downstream massaal parallelle RNA sequencing. Wij omvatten wasmiddel-mechanische en hypotone-mechanische weefsel verstoring en cel lysis van de opties, die beide kunnen worden gebruikt voor isolatie van kernen.

Isolatie van volwassen ruggenmerg kernen voor Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Single-cell RNA sequencing is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van transcriptieprofielen van cellen, met name in heterogeen weefsel, zoals het centrale zenuwstelsel. Dit protocol biedt een methode voor het isoleren van kernen voor single-nucleus RNA sequencing. Door het gebruik van kernen in plaats van cellen, kan deze methode worden toegepast op moeilijk te scheiden weefsels, evenals bevroren weefsel.Bovendien kan deze methode worden toegepast om celtypespecifieke veranderingen in cellen na ziekte of letsel te bestuderen. Begin deze procedure met muis euthanasie, zoals beschreven in het tekstprotocol. Maak vervolgens een incisie langs de lengte van het lichaam om de binnenorganen bloot te leggen.Ontmanten de muis door het trekken van de binnenste organen uit de lichaamsholte met behulp van tangen. Gebruik geen papieren handdoeken om het gebied schoon te maken of om organen te verwijderen, omdat dit verontreinigingen kan introduceren. Snijd met een schaar de wervelkolom tussen de L2- en L3-rugwervels.Om het ruggenmerg uit te werpen, past een drie milliliter spuit met ijskoude PBS met een 25 meter 1/4 inch naald. Plaats de punt van de naald in het sacrale uiteinde van de wervelkolom. Gebruik twee vingers om de wervels knijpen om een strakke afdichting rond het puntje van de naald te creëren, en druk op de zuiger om het ruggenmerg rostrally uitwerpen.Plaats het ruggenmerg in een petrischaaltje met ijskoude PBS. Als alleen het lendengedeelte van het koord nodig is, trim dan de sacrale en thoracale gedeelten van het ruggenmerg weg. Op dit punt, bevries het weefsel en bewaar op min 80 graden Celsius, of onmiddellijk te gebruiken voor een wasmiddel mechanische cel lysis zoals hier beschreven, of hypotonische mechanische lysis zoals beschreven in het tekstprotocol.Om wasmiddelmechanische cellyse te bepalen, plaatst u het lumbale ruggenmerg in een voorgekoelde Dounce-homogenisator en voegt u 500 microliters voorgekoelde wasmiddellysebuffer toe. Dounce met vijf slagen van de losse stamper, A, en vervolgens vijf tot 10 slagen van de strakke stamper, B.Vermijd het opheffen van de homogenisator buiten de lyse oplossing tussen slagen, en vermijd de invoering van bellen. Nu, plaats een 40 micron zeef over een voorgekoelde 50 milliliter conische buis en voorwet met een milliliter lage sacharose buffer.Voeg een milliliter lage sacharosebuffer toe aan de Dounce-homogenisator die de ruwe kernen in de lysebuffer bevat, en meng voorzichtig door twee tot drie keer te pipetten. Geef de ruwe kernen prep over de 40-micron zeef, in de voorgekoelde 50 milliliter conische buis. Geef een extra een milliliter lage sacharose buffer over de 40 micron zeef, waardoor het uiteindelijke volume tot drie milliliter van de lage sacharose buffer en 500 microliters van de lyse buffer.Herhaal deze stappen als u meerdere snoeren combineert, koeling in dezelfde conische buis. Dan, centrifuge het monster op 3200 keer G gedurende 10 minuten op vier graden Celsius. Zodra de centrifugatie is voltooid, decanteren de supernatant.We schorten het palet op met behulp van drie milliliter lage sacharose buffer. Draai voorzichtig om de pellet van de muur te verwijderen om de resuspensie te vergemakkelijken. Nadat u het monster twee minuten op ijs hebt laten zitten, brengt u de suspensie over naar een Oak Ridge-buis.Met behulp van de homogenisator bij het instellen van een, homogeniseren de kernen in lage sacharose buffer voor 15 tot 30 seconden, het houden van het monster op ijs. Gebruik vervolgens een serologische pipet om 12,5 milliliter dichtheidssucrosebuffer te leggen, onder het lage sacharosebufferhogeen, waarbij u ervoor zorgt dat er geen bel ontstaat die de dichtheidslagen verstoort. Centrifugeren de buizen op 3200 keer G, gedurende 20 minuten op vier graden Celsius.Zodra de centrifugatie is voltooid, onmiddellijk decanteren de supernatant in een flicking beweging. Tijdens een poging deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om onmiddellijk verwijderen van de Oak Ridge buis uit de centrifuge, en snel decanteren de supernatant. Met behulp van 100 microliter tot een milliliter resuspensieoplossing, schorten we de kernen op die op de muur blijven.Vermijd de myeline frons die blijft bij de wasmiddel gebaseerde voorbereiding. Als u deze stappen niet snel doet, kan dit resulteren in een preparaat van kernen met overtolligcellair puin, of myeline, dat downstream single-nucleus RNA-sequencing kan belemmeren. Filtreer de kernen door een zeef van 30 tot 35 micron porie en verzamel in een voorgekoelde buis.Bepaal de opbrengst van de kernen, met behulp van een hemocytometer om kernen onder een doelstelling van 10 x te tellen, voordat u overgaat tot RNA-sequencing met één kern, zoals beschreven in het tekstprotocol. Helder veld en epifluorescentie beelden van kernen, geïsoleerd met behulp van het wasmiddel mechanische lyse protocol, worden getoond op 10 x. Deze kernen worden op een onbevooroordeelde manier geïsoleerd, waardoor de studie van endogene genexpressieprofielen op het niveau van een enkele cel mogelijk is.Hier getoond, is een representatieve tSNE plot van single-nucleus RNA sequencing, van een muis lumbale ruggenmerg, met behulp van een massaal parallelle druppel inkapseling platform. Kernen geïsoleerd van vers of bevroren weefsel kunnen worden gebruikt voor sequencing op zowel commerciële als academische platforms. Deze techniek stelt onderzoekers in staat om transcriptieprofielen op eencellig niveau te verkennen, met behulp van moeilijk te scheiden weefsels, zoals het ruggenmerg, of zelfs bevroren weefsel, zoals biobankmateriaal.Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om de hoeveelheid tijd tussen euthanasie en cellulaire lyse te verminderen. Verder is het belangrijk om bellen geïntroduceerd in oplossingen van cellulaire lyse tot resuspensie te minimaliseren, en om petkernen met zorg te kopen. Na deze procedure kunnen kernen worden gebruikt voor alternatieve toepassingen, zoals facs sortering, om specifieke celtypen te isoleren.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Spinal Cord Elektrofysiologie II: Extracellulaire Suction Elektrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Productie van RNA voor transcriptomische analyse van muis ruggenmerg motor neuron cellichamen door laser capture microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

RNA-Seq Analyse van differentiële genexpressie in Geëlektroporeerde Chick Embryonale Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Voorbereiding van de primaire Mixed glialculturen van volwassen muis Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Hydraulische extrusie van het ruggenmerg en isolatie van achterwortelganglia in Knaagdieren

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

Spinal Cord Neurons Isolatie en Cultuur van Neonatale Muizen

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

Isolatie van regiospecifieke Microglia van één volwassen muis hersen halfrond voor diepe eencellige RNA-sequencing

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Intra-arteriële levering van neurale stamcellen aan de Rat en Mouse Brain: Toepassing op cerebrale ischemie

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Induction of Complete Transection-Type Spinal Cord Injury in Mice

Inductie van volledige transsectie-type ruggenmergletsel bij muizen

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, ...

A Minimally Invasive, Fast Spinal Cord Lateral Hemisection Technique for Modeling Open Spinal Cord Injuries in Rats

Open spinal cord injury techniques modeling laceration-like injuries are time-consuming and invasive because they involve laminectomy. This new technique ...