Name: isolation of adult spinal cord nuclei for massively parallel single-nucleus rna sequencing
Uploaded: 2018-10-12T14:30:00
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Ce travail a été soutenu par le programme intramural de NINDS (1 ZIA NS003153 02) et NIDCD (1 ZIA DC000059 18). Nous remercions L. Li et C.I. Dobrott pour leur soutien technique et des discussions utiles et Kathe C. pour l’examen du manuscrit.

Tous les animaux travaux ont été réalisés conformément à un protocole approuvé National Institute of Neurological Disorders and Stroke animalier et Comité d’urbanisme. Équilibré des échantillons des souris mâles et femelles ICR/CD-1 sauvage, entre 8 et 12 semaines vieux, ont été utilisés pour toutes les expériences. Souris doivent être traités selon les directives locales institutionnelles animalier et Comité d’urbanisme.
1. préparation des matériaux et des tampons
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	<li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+experience-dependent+transcriptomic+states+in+the+mouse+visual+cortex.">Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).</li><li>Hu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+Cell-Type+Composition+and+Activity-Dependent+Transcriptional+State+in+Mammalian+Brains+by+Massively+Parallel+Single-Nucleus+RNA-Seq.">Dissecting Cell-Type Composition and Activity-Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq.</a> Molecular Cell. 68 (5), 1006-1015 (2017).</li><li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+Activated+Cell+Populations+Using+Single-Cell+RNA-Seq.">Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li><li>Sathyamurthy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+Parallel+Single+Nucleus+Transcriptional+Profiling+Defines+Spinal+Cord+Neurons+and+Their+Activity+during+Behavior.">Massively Parallel Single Nucleus Transcriptional Profiling Defines Spinal Cord Neurons and Their Activity during Behavior.</a> Cell Reports. 22 (8), 2216-2225 (2018).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell.">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).</li><li>Campbell, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+census+of+arcuate+hypothalamus+and+median+eminence+cell+types.">A molecular census of arcuate hypothalamus and median eminence cell types.</a> Nature Neuroscience. 20 (3), 484-496 (2017).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+Reveals+Hypothalamic+Cell+Diversity.">Single-Cell RNA-Seq Reveals Hypothalamic Cell Diversity.</a> Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).</li><li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-cell+RNA-seq+for+marker-free+decomposition+of+tissues+into+cell+types.">Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types.</a> Science. 343 (6172), 776-779 (2014).</li><li>Li, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatosensory+neuron+types+identified+by+high-coverage+single-cell+RNA-sequencing+and+functional+heterogeneity.">Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity.</a> Cell Research. 26 (8), 967 (2016).</li><li>Shin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+with+Waterfall+Reveals+Molecular+Cascades+underlying+Adult+Neurogenesis.">Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis.</a> Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics.">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).</li><li>Usoskin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+classification+of+sensory+neuron+types+by+large-scale+single-cell+RNA+sequencing.">Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing.</a> Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).</li><li>Villani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+new+types+of+human+blood+dendritic+cells,+monocytes,+and+progenitors.">Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors.</a> Science. 356 (6335), (2017).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+structure.+Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).</li><li>Lacar, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+RNA-seq+of+single+neurons+reveals+molecular+signatures+of+activation.">Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation.</a> Nature Communications. 7, 11022 (2016).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain.">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li><li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-sequencing+from+single+nuclei.">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li><li>Krishnaswami, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+single+nuclei+for+RNA-seq+to+capture+the+transcriptome+of+postmortem+neurons.">Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons.</a> Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).</li><li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+nuclei+isolation+from+human+postmortem+brain+tissue.">Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).</li><li>Bergmann, O., Jovinge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+cardiomyocyte+nuclei+from+post-mortem+tissue.">Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Nohara, K., Chen, Z., Yoo, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Filtration-based+Method+of+Preparing+High-quality+Nuclei+from+Cross-linked+Skeletal+Muscle+for+Chromatin+Immunoprecipitation.">A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).</li><li>Halder, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+changes+in+plasticity+genes+accompany+the+formation+and+maintenance+of+memory.">DNA methylation changes in plasticity genes accompany the formation and maintenance of memory.</a> Nature Neuroscience. 19 (1), 102-110 (2016).</li><li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-nucleus+RNA-seq+with+DroNc-seq.">Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq.</a> Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).</li><li>. Sample Preparation Demonstrated Protocols: Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing</a> (2018)</li><li>10X Genomics. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single Cell 3' Reagent Kits v2 User Guide. , (2018).</li><li>Fu, Y., Rusznak, Z., Herculano-Houzel, S., Watson, C., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+composition+characterizing+postnatal+development+and+maturation+of+the+mouse+brain+and+spinal+cord.">Cellular composition characterizing postnatal development and maturation of the mouse brain and spinal cord.</a> Brain Structure and Function. 218 (5), 1337-1354 (2013).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+strategy+for+single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+confirms+accuracy+in+predicted+cell-type+expression+from+nuclear+RNA.">A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6031 (2017).</li><li>Bakken, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equivalent+high-resolution+identification+of+neuronal+cell+types+with+single-nucleus+and+single-cell+RNA-sequencing.">Equivalent high-resolution identification of neuronal cell types with single-nucleus and single-cell RNA-sequencing.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Div-Seq:+Single-nucleus+RNA-Seq+reveals+dynamics+of+rare+adult+newborn+neurons.">Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons.</a> Science. 353 (6302), 925-928 (2016).</li></ol>

Le but ultime de ce protocole est d’isoler les noyaux contenant ARN de haute qualité pour l’analyse transcriptionnelle en aval. Nous avons adapté le snRNA-Seq méthodes afin de profil de tous les types de cellules dans la moelle épinière. Au départ, nous avons constaté que les méthodes de dissociation cellulaire typique étaient inefficaces de séquençage d’unicellulaire RNA, comme les neurones de la moelle épinière sont particulièrement vulnérables à la mort cellulaire. En outre, méthodes de dissocia...

Le système nerveux est composé de groupes hétérogènes de cellules qui présentent une grande diversité de propriétés morphologiques, biochimiques et électrophysiologiques. Alors que le séquençage de RNA en vrac a été utile pour déterminer les modifications à l’échelle tissulaire dans l’expression de gène dans des conditions différentes, il s’oppose à la détection de changements transcriptionnelles au niveau unicellulaire. Les progrès récents dans l’analyse transcriptionnelle unicellulaires ont permis la classification des cellules hétérogènes en groupes fonctionnels basé sur leur répertoire moléculaire et peuvent même être exploités pour détecter les ensembles de neurones qui avaient été récemment actifs. 1 , 2 , 3 , 4 au cours des dix dernières années, le développement de l’ARN unicellulaire séquençage (scRNA-Seq) a permis l’étude de l’expression des gènes dans des cellules individuelles, offrant ainsi une vue de la diversité type de cellule. 5
L’émergence d’approches évolutives telles que massivement parallèle scRNA-Seq, a fourni des plates-formes de tissus hétérogènes de séquence, dont de nombreuses régions du système nerveux central. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 Toutefois, méthodes de dissociation unicellulaire peuvent conduire à la mort cellulaire, mais aussi les changements expérimentaux dans l’expression des gènes. 16 travaux récents a adapté des méthodes de séquençage unicellulaire pour permettre la préservation des profils de transcriptionnelles endogènes. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 ces stratégies ont été particulièrement adaptés pour la détection de l’expression des gènes (IEG) début immédiat après le stimulus sensoriel ou comportement. 3 , 4 dans le futur, cette stratégie pourrait également servir à étudier les changements dynamiques dans les tissus dans les états pathologiques ou en réponse au stress. De ces méthodes, séquençage seul noyau RNA (snRNA-Seq) est une approche prometteuse qui n’implique pas de stress induisant la dissociation cellulaire et peut être utilisée sur difficile de dissocier les tissus (par exemple, la moelle épinière), mais aussi gelé des tissus. 4 , 17 , 18 , 19 adapté des précédentes méthodes d’isolement de noyaux,20,21,22,23,25 snRNA-Seq utilise généralement cellulaire et interruption rapide des tissus lyse dans des conditions froides, centrifugation et séparation des noyaux de débris cellulaires. 4 noyaux peuvent être isolés pour le séquençage de nouvelle génération en aval sur plusieurs plateformes d’encapsulation de gouttelettes microfluidiques. 4 , 7 , 24 , 25 cette méthode permet une capture instantanée de l’activité transcriptionnelle de milliers de cellules à un moment dans le temps.
Il existe plusieurs stratégies pour libérer les noyaux des cellules avant d’isolement et de séquençage, chacun avec leurs propres avantages et inconvénients. Nous décrivons ici et comparer deux protocoles pour permettre l’isolement des noyaux de la moelle épinière adulte pour la snRNA-Seq massivement parallèle en aval : détergent-mechanical lyse et lyse hypotonique-mécanique. Détergent-mechanical lyse fournit la désorganisation complète de tissus et un meilleur rendement final des noyaux. Mécanique-lyse hypotonique comprend une certaine désorganisation du tissu, offrant la possibilité de sélectionner un équilibre entre la quantité et la pureté de la dernière puissance nucléaire contrôlable. Ces approches fournissent le rendement comparable de RNA, détecté un nombre de gènes par noyau et le profilage de type cellulaire et aussi peuvent être utilisés avec succès pour snRNA-suiv.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15503-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES (pH = 8.0)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgAc</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1028-10X1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA (pH = 8.0)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-46034CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10197777001</td>
			<td>Add DTT just prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Crystalgen</td>
			<td>221-238-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl (pH = 7.4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T2194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>59222C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate-A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A12475-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Crystalgen</td>
			<td>221-133-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.04% BSA</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 U/&#956;L RNAse Inhibitor</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>30281-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oak Ridge Centrifuge Tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3118-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Tissue Dounce (2 ml)</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>885303-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass large clearance pestle</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>885301-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass small clearance pestle</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>885302-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3737001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispersing tool (S 10 N &#8211; 5G)</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3304000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers, 30 &#956;m</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>1000799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XTR Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75003698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterological Pipettes: 5 ml, 10 ml</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>EF16034F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemgenes Barcoding Beads</td>
			<td>Chemgenes</td>
			<td>Macosko-2011-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 &#956;m)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo Astrios Cell Sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B25982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>120262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#8217; Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>120267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish (60 x 15 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of adult spinal cord nuclei for massively parallel single-nucleus rna sequencing

Sondant l’expression des gènes de la cellule individuelle permet l’identification du type de cellule et de l’état de la cellule. Séquençage de RNA unicellulaire a émergé comme un outil puissant pour l’étude des profils de transcriptional des cellules, en particulier dans les tissus hétérogènes tels que le système nerveux central. Cependant, méthodes de dissociation requis pour l’ordonnancement de la cellule unique peuvent conduire à des changements expérimentaux dans la gène expression et la mort cellulaire. En outre, ces méthodes sont généralement limités aux tissus frais, limitant ainsi les études sur les archives et le matériel de bio-Banque. Séquençage seul noyau RNA (snRNA-Seq) est une alternative attrayante pour études transcriptionnels, étant donné qu’il identifie les types de cellules, permet l’étude des tissus congelés ou difficile de dissocier, avec précision et réduit la dissociation induite par le transcription. Nous présentons ici un protocole haut débit pour l’isolement rapide de noyaux pour aval snRNA-suiv. Cette méthode permet l’isolement des noyaux des échantillons frais ou congelés de la moelle épinière et peut être combinée avec deux plates-formes d’encapsulation de gouttelettes massivement parallèle.

Ici, nous avons réalisé isolement des noyaux de la moelle lombaire de souris adultes en aval séquençage massivement parallèle de RNA. Le protocole implique trois éléments principaux : tissu perturbation et cellulaire lyse, homogénéisation et saccharose densité par centrifugation (Figure 1). Dans les secondes, la lyse de détergent-mécanique a donné une préparation de noyaux bruts avec un grand nombre de noyaux ainsi que des débris cellulaires e...

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Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Nous présentons ici un protocole afin d’isoler rapidement les noyaux de la haute qualité des tissus frais ou congelés pour aval séquençage massivement parallèle de RNA. Nous incluons détergent-mécanique et hypotonique-mécanique des tissus désorganisation cellulaire lyse options et, qui peuvent être utilisés pour l’isolement des noyaux.

Isolement des noyaux d’adultes de la moelle épinière pour séquençage massivement parallèle ARN simple-noyau

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Le séquençage à ARN à cellules simples est un outil puissant pour étudier les profils transcriptionnels des cellules, en particulier dans les tissus hétérogènes, tels que le système nerveux central. Ce protocole fournit une méthode pour isoler les noyaux pour le séquençage de l’ARN à noyau unique. En utilisant des noyaux au lieu des cellules, cette méthode peut être appliquée aux tissus difficiles à dissocier, ainsi qu’aux tissus congelés.En outre, cette méthode peut être appliquée pour étudier les changements spécifiques au type de cellule dans les cellules à la suite d’une maladie ou d’une blessure. Commencez cette procédure par l’euthanasie de souris, telle que décrite dans le protocole de texte. Ensuite, faire une incision le long de la longueur du corps pour exposer les organes intérieurs.Éviscérer la souris en tirant les organes intérieurs de la cavité du corps à l’aide de forceps. N’utilisez pas de serviettes en papier pour nettoyer la zone ou pour enlever les organes, car cela peut introduire des contaminants. À l’aide de ciseaux, couper la colonne vertébrale entre les vertèbres vertébrales L2 et L3.Pour éjecter la moelle épinière, placez une seringue de trois millilitres contenant du PBS glacé à l’aide d’une aiguille de calibre 1/4 pouce de calibre 25. Placez la pointe de l’aiguille dans l’extrémité sacrée de la colonne vertébrale. Utilisez deux doigts pour pincer les vertèbres pour créer un joint serré autour de la pointe de l’aiguille, et appuyez sur le piston pour éjecter la moelle épinière rostrally.Placer la moelle épinière dans une boîte de Pétri avec du PBS glacé. Si seulement la partie lombaire du cordon est nécessaire, coupez les parties sacrées et thoraciques de la moelle épinière. À ce stade, congeler le tissu et stocker à moins 80 degrés Celsius, ou utiliser immédiatement pour soit la lyse cellulaire mécanique détergent comme décrit ici, ou hypotonique lyse mécanique comme décrit dans le protocole de texte.Pour déterminer la lyse cellulaire mécanique détergente, placez la moelle épinière lombaire dans un homogénéiseur Dounce pré-refroidi et ajoutez 500 microlitres de tampon de lyse de détergent pré-refroidi. Dounce avec cinq coups du pilon lâche, A, puis cinq à 10 coups du pilon serré, B.Évitez de soulever l’homogénéisateur en dehors de la solution de lyse entre les coups, et évitez d’introduire des bulles. Maintenant, placez une passoire de 40 microns sur un tube conique pré-refroidi de 50 millilitres et pré-humide avec un millilitre de tampon de saccharose faible.Ajouter un millilitre de tampon à faible saccharose à l’homogénéiseur Dounce contenant les noyaux bruts dans le tampon de lyse, et mélanger délicatement en pipetting deux à trois fois. Passez la préparation des noyaux bruts au-dessus de la passoire de 40 microns dans le tube conique pré-refroidi de 50 millilitres. Passez un tampon supplémentaire d’un millilitre de saccharose bas au-dessus de la passoire de 40 microns, ce qui porte le volume final à trois millilitres du tampon à faible saccharose et à 500 microlitres du tampon de lyse.Répétez ces étapes si vous combinez plusieurs cordons, en refroidissant dans le même tube conique. Ensuite, centrifugez l’échantillon à 3200 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Une fois la centrifugation terminée, décanter le surnatant.Nous suspendons la palette à l’aide de trois millilitres de tampon saccharose faible. Tourbillonnez doucement pour enlever la pastille du mur pour faciliter la resuspension. Après avoir laissé reposer l’échantillon sur la glace pendant deux minutes, transférez la suspension dans un tube Oak Ridge.À l’aide de l’homogénéisant au réglage d’un, homogénéiser les noyaux dans un tampon à faible saccharose pendant 15 à 30 secondes, en gardant l’échantillon sur la glace. Ensuite, utilisez une pipette sérologique pour superposer 12,5 millilitres de tampon saccharose de densité, sous l’homogénéité tampon à faible saccharose, en prenant soin de ne pas créer une bulle qui perturbe les couches de densité. Centrifuger les tubes à 3200 fois G, pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius.Une fois la centrifugation terminée, décantez immédiatement le supernatant dans un mouvement de scintillement. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’enlever immédiatement le tube Oak Ridge de la centrifugeuse, et de décanter rapidement le supernatant. En utilisant 100 microlitres à un millilitre de solution de resuspension, nous suspendons les noyaux restant sur le mur.Évitez le froncement de sourcils myélin qui reste avec la préparation à base de détergent. Si vous ne faites pas ces étapes rapidement, vous pouvez entraîner une préparation des noyaux avec un excès de débris cellulaires, ou de la myéline, ce qui peut entraver le séquençage de l’ARN à noyau unique en aval. Filtrer les noyaux à travers une passoire de taille pore de 30 à 35 microns et les recueillir dans un tube pré-refroidi.Déterminer le rendement des noyaux, à l’aide d’un hémocytomètre pour compter les noyaux dans un objectif de 10 x, avant de procéder au séquençage de l’ARN à noyau unique, tel que décrit dans le protocole de texte. Des images brillantes de champs et d’épifluorescentes de noyaux, isolées à l’aide du protocole de lyse mécanique détergent, sont montrées à 10 x. Ces noyaux sont isolés d’une manière impartiale, permettant l’étude des profils d’expression des gènes endogènes au niveau d’une seule cellule.Montré ici, est une parcelle représentative tSNE de séquençage de l’ARN à noyau unique, à partir d’une moelle épinière lombaire de souris, en utilisant une plate-forme d’encapsulation de gouttelettes massivement parallèle. Les noyaux isolés des tissus frais ou congelés peuvent être utilisés pour le séquençage sur des plateformes commerciales et académiques. Cette technique permet aux chercheurs d’explorer les profils transcriptionnels au niveau d’une seule cellule, en utilisant des tissus difficiles à dissocier, comme la moelle épinière, ou même des tissus congelés, comme le matériel biobanque.Tout en essayant cette procédure, il est important de réduire le temps entre l’euthanasie et la lyse cellulaire. En outre, il est important de minimiser les bulles introduites dans les solutions de la lyse cellulaire à la résuspension, et d’acheter des noyaux pour animaux de compagnie avec soin. Suite à cette procédure, les noyaux peuvent être utilisés pour d’autres applications, telles que le tri des facs, afin d’isoler des types de cellules spécifiques.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Recherche

Neurosciences

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