Name: isolation of adult spinal cord nuclei for massively parallel single-nucleus rna sequencing
Uploaded: 2018-10-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing at JoVE.com

Diese Arbeit wurde unterstützt durch das intramurale Programm der NINDS (1 ZIA NS003153 02) und NIDCD (1 ZIA DC000059 18). Wir danken L. Li und CI Dobrott für ihre technische Unterstützung und hilfreichen Diskussionen und C. Käthe für die Überprüfung der Handschrift.

Alle tierische Arbeit wurde nach einem Protokoll genehmigt von der National Institute of Neurological Disorders and Stroke Animal Care und Use Committee durchgeführt. Ausgewogene Proben von männlichen und weiblichen ICR/CD-1 Wildtyp Mäusen, zwischen 8 und 12 Wochen alt, wurden für alle Experimente verwendet. Mäuse sollten in Übereinstimmung mit lokalen institutionellen Animal Care und Use Committee Richtlinien behandelt werden.
1. Vorbereitung von Materialien und Puffer
<ol><li>Bereite...

<ol>
	<li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+experience-dependent+transcriptomic+states+in+the+mouse+visual+cortex.">Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).</li><li>Hu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+Cell-Type+Composition+and+Activity-Dependent+Transcriptional+State+in+Mammalian+Brains+by+Massively+Parallel+Single-Nucleus+RNA-Seq.">Dissecting Cell-Type Composition and Activity-Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq.</a> Molecular Cell. 68 (5), 1006-1015 (2017).</li><li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+Activated+Cell+Populations+Using+Single-Cell+RNA-Seq.">Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li><li>Sathyamurthy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+Parallel+Single+Nucleus+Transcriptional+Profiling+Defines+Spinal+Cord+Neurons+and+Their+Activity+during+Behavior.">Massively Parallel Single Nucleus Transcriptional Profiling Defines Spinal Cord Neurons and Their Activity during Behavior.</a> Cell Reports. 22 (8), 2216-2225 (2018).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell.">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).</li><li>Campbell, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+census+of+arcuate+hypothalamus+and+median+eminence+cell+types.">A molecular census of arcuate hypothalamus and median eminence cell types.</a> Nature Neuroscience. 20 (3), 484-496 (2017).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+Reveals+Hypothalamic+Cell+Diversity.">Single-Cell RNA-Seq Reveals Hypothalamic Cell Diversity.</a> Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).</li><li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-cell+RNA-seq+for+marker-free+decomposition+of+tissues+into+cell+types.">Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types.</a> Science. 343 (6172), 776-779 (2014).</li><li>Li, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatosensory+neuron+types+identified+by+high-coverage+single-cell+RNA-sequencing+and+functional+heterogeneity.">Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity.</a> Cell Research. 26 (8), 967 (2016).</li><li>Shin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+with+Waterfall+Reveals+Molecular+Cascades+underlying+Adult+Neurogenesis.">Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis.</a> Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics.">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).</li><li>Usoskin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+classification+of+sensory+neuron+types+by+large-scale+single-cell+RNA+sequencing.">Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing.</a> Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).</li><li>Villani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+new+types+of+human+blood+dendritic+cells,+monocytes,+and+progenitors.">Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors.</a> Science. 356 (6335), (2017).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+structure.+Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).</li><li>Lacar, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+RNA-seq+of+single+neurons+reveals+molecular+signatures+of+activation.">Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation.</a> Nature Communications. 7, 11022 (2016).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain.">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li><li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-sequencing+from+single+nuclei.">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li><li>Krishnaswami, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+single+nuclei+for+RNA-seq+to+capture+the+transcriptome+of+postmortem+neurons.">Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons.</a> Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).</li><li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+nuclei+isolation+from+human+postmortem+brain+tissue.">Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).</li><li>Bergmann, O., Jovinge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+cardiomyocyte+nuclei+from+post-mortem+tissue.">Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Nohara, K., Chen, Z., Yoo, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Filtration-based+Method+of+Preparing+High-quality+Nuclei+from+Cross-linked+Skeletal+Muscle+for+Chromatin+Immunoprecipitation.">A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).</li><li>Halder, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+changes+in+plasticity+genes+accompany+the+formation+and+maintenance+of+memory.">DNA methylation changes in plasticity genes accompany the formation and maintenance of memory.</a> Nature Neuroscience. 19 (1), 102-110 (2016).</li><li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-nucleus+RNA-seq+with+DroNc-seq.">Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq.</a> Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).</li><li>. Sample Preparation Demonstrated Protocols: Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing</a> (2018)</li><li>10X Genomics. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single Cell 3' Reagent Kits v2 User Guide. , (2018).</li><li>Fu, Y., Rusznak, Z., Herculano-Houzel, S., Watson, C., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+composition+characterizing+postnatal+development+and+maturation+of+the+mouse+brain+and+spinal+cord.">Cellular composition characterizing postnatal development and maturation of the mouse brain and spinal cord.</a> Brain Structure and Function. 218 (5), 1337-1354 (2013).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+strategy+for+single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+confirms+accuracy+in+predicted+cell-type+expression+from+nuclear+RNA.">A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6031 (2017).</li><li>Bakken, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equivalent+high-resolution+identification+of+neuronal+cell+types+with+single-nucleus+and+single-cell+RNA-sequencing.">Equivalent high-resolution identification of neuronal cell types with single-nucleus and single-cell RNA-sequencing.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Div-Seq:+Single-nucleus+RNA-Seq+reveals+dynamics+of+rare+adult+newborn+neurons.">Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons.</a> Science. 353 (6302), 925-928 (2016).</li></ol>

Das ultimative Ziel dieses Protokolls ist, Kerne mit qualitativ hochwertigen RNA für die nachgelagerten transkriptionelle Analyse zu isolieren. Wir angepasst SnRNA-Seq Methoden um alle Zelltypen im Rückenmark zu profilieren. Zunächst fanden wir, dass typische Zelle Dissoziation Methoden für einzelne Zelle RNA Sequenzierung, unwirksam waren, wie Rückenmark Neuronen Absterben von Zellen besonders anfällig sind. Darüber hinaus verursachen Zelle Dissoziation Methoden Ausdruck der verschiedenen Aktivitäten und Stressa...

Das Nervensystem besteht aus heterogenen Gruppen von Zellen, in denen vielfältige morphologische, Biochemische und elektrophysiologische Eigenschaften angezeigt. Während die Masse RNA Sequenzierung nützlich für die Bestimmung der Gewebe-Änderungen in der Genexpression unter verschiedenen Bedingungen wurde, schließt es die Erkennung von transcriptional Änderungen auf der Ebene der einzelnen Zelle. Jüngste Fortschritte in der einzelligen transkriptionelle Analyse konnten die Einteilung der heterogenen Zellen in funktionellen Gruppen anhand ihrer molekularen Repertoire und können auch genutzt werden, um Gruppen von Neuronen zu erkennen, die vor kurzem aktiv gewesen. 1 , 2 , 3 , 4 in den letzten zehn Jahren hat die Entwicklung der einzelnen Zelle RNA Sequenzierung (ScRNA-Seq) die Untersuchung der Genexpression in Einzelzellen, bietet einen Blick in Zelltyp Vielfalt ermöglicht. 5
Die Entstehung der skalierbare Ansätze wie massiv parallelen ScRNA-FF, lieferte Plattformen zur Sequenz heterogene Gewebe, einschließlich viele Regionen des zentralen Nervensystems. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 können jedoch einzelne Zelle Dissoziation Methoden Zelltod sowie experimentelle Veränderungen in der Genexpression führen. 16 neuere Arbeiten adaptierte Einzelzelle sequenziermethoden um Erhaltung der endogenen transcriptional Profile zu aktivieren. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 diese Strategien wurden besonders geeignet zur Erkennung von unmittelbaren frühen (IEG) Genexpression nach Sinnesreiz oder Verhalten. 3 , 4 In der Zukunft könnte diese Strategie auch verwendet werden, dynamische Veränderungen in den Geweben bei Krankheitszuständen oder in Reaktion auf stress zu studieren. Dieser Methoden einzelne Kern RNA Sequenzierung (SnRNA-Seq) ist ein vielversprechender Ansatz, das beinhaltet keine Stress auslösende Zelle Dissoziation und kann verwendet werden, schwierig, Gewebe (z. B. das Rückenmark) zu distanzieren, sowie gefrorene Gewebe. 4 , 17 , 18 , 19 Adapted von früheren Kerne Isolierung Methoden nutzt20,21,22,23,25 SnRNA-Seq in der Regel schnelle Gewebe Störungen und Zelle lyse unter kalten Bedingungen, Zentrifugierung und Trennung der Kerne von zelltrümmer. 4 Kerne für die nachgelagerte Sequenzierung der nächsten Generation auf mehreren Plattformen in mikrofluidischen Tröpfchen Kapselung absperrbar. 4 , 7 , 24 , 25 diese Methode ermöglicht einen Überblick über die transkriptionelle Aktivität aus Tausenden von Zellen zu einem bestimmten Zeitpunkt.
Es gibt mehrere Strategien für die Freigabe von Kernen von Zellen vor Isolation und Sequenzierung, jede mit ihren eigenen vor- und Nachteile. Hier beschreiben wir vergleichen zwei Protokolle zur Isolierung von Kernen aus dem Erwachsenen Rückenmark für die nachgelagerten massiv parallelen SnRNA-Seq ermöglichen: Waschmittel-mechanische Lyse und hypotone-mechanische Lyse. Waschmittel-mechanische Lyse liefert komplette Gewebe Störungen und eine endgültige Mehrertrag von Kernen. Hypotone Maschinenbau-Lyse enthält eine steuerbare Maß an Gewebe Störungen, bietet eine Möglichkeit für die Auswahl ein Gleichgewicht zwischen der Menge und Reinheit der letzten nuklearen Ausbeute. Diese Ansätze bieten vergleichbare RNA-Ausbeute, ermittelte Anzahl von Genen pro Kern und Zelltyp profiling und können auch beide verwendet werden erfolgreich für SnRNA-Seq.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15503-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES (pH = 8.0)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgAc</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1028-10X1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA (pH = 8.0)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-46034CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10197777001</td>
			<td>Add DTT just prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Crystalgen</td>
			<td>221-238-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl (pH = 7.4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T2194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>59222C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate-A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A12475-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Crystalgen</td>
			<td>221-133-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.04% BSA</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 U/&#956;L RNAse Inhibitor</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>30281-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oak Ridge Centrifuge Tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3118-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Tissue Dounce (2 ml)</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>885303-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass large clearance pestle</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>885301-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass small clearance pestle</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>885302-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3737001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispersing tool (S 10 N &#8211; 5G)</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3304000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers, 30 &#956;m</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>1000799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XTR Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75003698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterological Pipettes: 5 ml, 10 ml</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>EF16034F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemgenes Barcoding Beads</td>
			<td>Chemgenes</td>
			<td>Macosko-2011-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 &#956;m)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo Astrios Cell Sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B25982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>120262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#8217; Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>120267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish (60 x 15 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of adult spinal cord nuclei for massively parallel single-nucleus rna sequencing

Eine einzelne Zelle Genexpression sondieren ermöglicht die Identifizierung von Zelltyp und Zellstatus. Einzelne Zelle RNA Sequenzierung ist ein leistungsfähiges Werkzeug für das Studium transcriptional Profile der Zellen, vor allem in heterogenen Geweben wie das zentrale Nervensystem entstanden. Dissoziation-Methoden, die für die einzelne Zelle Sequenzierung erforderlich können jedoch auf experimentelle Veränderungen in der Gen-Ausdruck und Zelle Tod führen. Darüber hinaus sind diese Methoden in der Regel auf frischem Gewebe, wodurch Studien zur Archivierung und Bio-Bank Material beschränkt. Einzigen Kern RNA Sequenzierung (SnRNA-Seq) ist eine attraktive Alternative für transkriptionelle Studien, da es genau identifiziert Zelltypen, erlaubt die Untersuchung von Gewebe, das gefrorene oder schwer zu distanzieren, und reduziert die Dissoziation-induzierte die Transkription. Hier präsentieren wir Ihnen eine Hochdurchsatz-Protokoll für schnelle Lokalisierung der Kerne für nachgeschaltete SnRNA-Seq. Diese Methode ermöglicht die Trennung der Kerne von frischen oder gefrorenen Rückenmark Proben und kann mit zwei parallelen Tröpfchen Kapselung Plattformen kombiniert werden.

Hier haben wir Isolierung der Kerne aus dem Erwachsenen Maus Lendenwirbelsäule Rückenmark für nachgeschaltete massiv parallelen RNA Sequenzierung durchgeführt. Das Protokoll beteiligten drei Hauptkomponenten: Gewebe Störungen und zellulären Lyse, Homogenisierung und Saccharose Dichte Zentrifugation (Abbildung 1). Innerhalb von Sekunden ergab die Waschmittel-mechanische Lyse eine grobe Kerne Vorbereitung mit einer großen Anzahl von Kernen sowie Mobilfun...

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Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um schnell qualitativ hochwertige Kerne aus dem frischen oder gefrorenen Gewebe für die nachgelagerten massiv parallelen RNA Sequenzierung zu isolieren. Wir enthalten Waschmittel-mechanische und hypotone-mechanische Gewebe Störung und Zelle Lyse Optionen, die für die Isolierung von Kernen verwendet werden können.

Isolierung von Erwachsenen Rückenmark Kerne für massiv parallele Single-Kern-RNA-Sequenzierung

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Die einzellige RNA-Sequenzierung ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung von Transkriptionsprofilen von Zellen, insbesondere im heterogenen Gewebe, wie dem zentralen Nervensystem. Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Isolierung von Kernen für die SEQUENZierung von RNA mit einem Kern. Durch die Verwendung von Kernen anstelle von Zellen kann diese Methode auf schwer zu dissoziierendes Gewebe sowie auf gefrorenes Gewebe angewendet werden.Darüber hinaus kann diese Methode angewendet werden, um zelltypspezifische Veränderungen in Zellen nach Krankheit oder Verletzung zu untersuchen. Beginnen Sie dieses Verfahren mit mauseulärlicheM, wie im Textprotokoll beschrieben. Als nächstes machen Sie einen Schnitt entlang der Länge des Körpers, um die inneren Organe freizulegen.Entfernen Sie die Maus, indem Sie die inneren Organe aus der Körperhöhle mit Zangen ziehen. Verwenden Sie keine Papiertücher, um den Bereich zu reinigen oder Organe zu entfernen, da dies Verunreinigungen mit sich bringen kann. Schneiden Sie mit einer Schere die Wirbelsäule zwischen den Wirbelsäulen L2 und L3.Um das Rückenmark auszuwerfen, passen Sie eine Drei-Milliliter-Spritze mit eiskaltem PBS mit einer 25 Gauge 1/4 Zoll Nadel an. Legen Sie die Spitze der Nadel in das sakrale Ende der Wirbelsäule. Verwenden Sie zwei Finger, um die Wirbel zu kneifen, um eine enge Dichtung um die Spitze der Nadel zu schaffen, und drücken Sie auf den Kolben, um das Rückenmark rostral auszuwerfen.Das Rückenmark in eine Petrischale mit eiskaltem PBS geben. Wenn nur der Lendenteil des Bandes erforderlich ist, trimmen Sie die sakralen und brustbrustigen Teile des Rückenmarks weg. An dieser Stelle, einfrieren Sie das Gewebe und speichern bei minus 80 Grad Celsius, oder sofort für Waschmittel mechanische Zelllyse, wie hier beschrieben, oder hypotonische mechanische Lyse, wie im Textprotokoll beschrieben.Um die mechanische Zelllyse des Waschmittels zu bestimmen, legen Sie das Lendenrückenmark in einen vorgekühlten Dounce-Homogenisator und fügen Sie 500 Mikroliter vorgekühlten Waschmittellysepuffer hinzu. Mit fünf Schlägen des lockeren Stößes A und dann fünf bis zehn Striche des engen Stößes, B.Vermeiden Sie das Heben des Homogenisators außerhalb der Lyselösung zwischen den Strichen, und vermeiden Sie das Einführen von Blasen. Legen Sie nun ein 40-Mikron-Sieb über ein vorgekühltes 50-Milliliter-Konusrohr und vornass mit einem Milliliter niedrigem Saccharosepuffer.Fügen Sie dem Dounce-Homogenisator, der die Rohkerne im Lysepuffer enthält, einen Milliliter niedrigen Saccharosepuffer strotzen und sanft mischen, indem Sie zwei- bis dreimal pipetieren. Übergeben Sie die rohen Kerne Über das 40-Mikron-Sieb in das vorgekühlte 50-Milliliter-Konische Rohr. Geben Sie einen zusätzlichen einen Milliliter niedrigen Saccharosepuffer über das 40 Mikron Sieb, so dass das Endvolumen auf drei Milliliter des niedrigen Saccharosepuffers und 500 Mikroliter des Lysepuffers.Wiederholen Sie diese Schritte, wenn Sie mehrere Kabel kombinieren und im selben konischen Rohr abkühlen. Zentrifugieren Sie die Probe dann bei 3200 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Sobald die Zentrifugation abgeschlossen ist, dekantieren Sie den Überstand.Wir unterbrechen die Palette mit drei Millilitern niedrigem Saccharosepuffer. Wirbeln Sie vorsichtig, um das Pellet von der Wand zu entfernen, um die Resuspension zu erleichtern. Nachdem Sie die Probe zwei Minuten auf dem Eis sitzen lassen, übertragen Sie die Suspension auf eine Oak Ridge-Röhre.Mit dem Homogenisator beim Einsen, homogenisieren Sie die Kerne in niedrigen Saccharosepuffer für 15 bis 30 Sekunden, halten Sie die Probe auf Eis. Verwenden Sie dann eine serologische Pipette, um 12,5 Milliliter Dichte-Saccharose-Puffer unter dem niedrigen Saccharosepuffer homogenisieren zu schichten, wobei darauf zu achten ist, dass keine Blase entsteht, die die Dichteschichten stört. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 3200 mal G, für 20 Minuten bei vier Grad Celsius.Sobald die Zentrifugation abgeschlossen ist, dekanieren Sie den Überstand sofort in einer flickenden Bewegung. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, das Oak Ridge Rohr sofort aus der Zentrifuge zu entfernen und den Überstand schnell zu dekantieren. Mit 100 Mikrolitern bis zu einem Milliliter Resuspensionslösung setzen wir die an der Wand verbliebenen Kerne aus.Vermeiden Sie das Myelin Stirnrunzeln, die mit dem Waschmittel-basierte Vorbereitung bleibt. Wenn diese Schritte nicht schnell ausgeführt werden, kann dies zu einer Kernvorbereitung mit überschüssigem Zellabfall oder Myelin führen, das die nachgeschaltete RNA-Sequenzierung mit einem Kern behindern kann. Filtern Sie die Kerne durch ein 30 bis 35 Mikron Poren-Ssieb und sammeln Sie in einem vorgekühlten Rohr.Bestimmen Sie die Kernausbeute, indem Sie ein Hämozytometer verwenden, um Kerne unter einem 10-x-Objektiv zu zählen, bevor Sie zur Sequenzierung der RNA mit einem Kern verfahren, wie im Textprotokoll beschrieben. Helle Feld- und Epifluoreszenzbilder von Kernen, isoliert mit dem mechanischen Lyseprotokoll des Waschmittels, werden bei 10 x dargestellt. Diese Kerne werden unvoreingenommen isoliert, was die Untersuchung endogener Genexpressionsprofile auf der Ebene einer einzelnen Zelle ermöglicht.Hier ist ein repräsentatives tSNE-Diagramm der Single-Nucleus-RNA-Sequenzierung aus einem Mauslenrückenmitmarksunterrücken mit einer massiv parallelen Tröpfchenverkapselungsplattform. Aus frischem oder gefrorenem Gewebe isolierte Kerne können sowohl auf kommerziellen als auch auf akademischen Plattformen für die Sequenzierung verwendet werden. Diese Technik ermöglicht es Forschern, Transkriptionsprofile auf einzelzelliger Ebene zu untersuchen, indem schwer zu dissoziierte Gewebe wie das Rückenmark oder sogar gefrorenes Gewebe, wie Biobankmaterial, verwendet werden.Beim Versuch dieses Verfahrens, Es ist wichtig, die Zeit zwischen Euthanasie und Zelllyse zu reduzieren. Darüber hinaus ist es wichtig, Blasen zu minimieren, die in Lösungen von der zellulären Lyse bis zur Resuspension eingeführt werden, und Haustierkerne mit Vorsicht zu kaufen. Nach diesem Verfahren können Kerne für alternative Anwendungen, wie z. B. die Facs-Sortierung, verwendet werden, um bestimmte Zelltypen zu isolieren.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Forschung

Neurowissenschaften

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