Name: isolation of adult spinal cord nuclei for massively parallel single-nucleus rna sequencing
Uploaded: 2018-10-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על-ידי התוכנית מגזר של NINDS (1 זיא NS003153 02), NIDCD (1 זיא DC000059 18). אנו מודים ל' Li Dobrott מודיע על תמיכתם הטכניים דיונים מועילים ו ס Kathe לסקירה של כתב היד.

כל בעלי החיים העבודה בוצעה לפי פרוטוקול שאושרו על ידי המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות, שבץ טיפול בעלי חיים ועל שימוש הוועדה. מאוזן דגימות של זכר ונקבה ICR/CD-1 פראי-סוג עכברים, בין 8 ו- 12 שבועות הישן, שימשו עבור כל הניסויים. עכברים צריך להיות מטופל על פי הנחיות אכפת לי חיה המוסדית והוועדה לשימ...

<ol>
	<li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+experience-dependent+transcriptomic+states+in+the+mouse+visual+cortex.">Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).</li><li>Hu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+Cell-Type+Composition+and+Activity-Dependent+Transcriptional+State+in+Mammalian+Brains+by+Massively+Parallel+Single-Nucleus+RNA-Seq.">Dissecting Cell-Type Composition and Activity-Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq.</a> Molecular Cell. 68 (5), 1006-1015 (2017).</li><li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+Activated+Cell+Populations+Using+Single-Cell+RNA-Seq.">Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li><li>Sathyamurthy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+Parallel+Single+Nucleus+Transcriptional+Profiling+Defines+Spinal+Cord+Neurons+and+Their+Activity+during+Behavior.">Massively Parallel Single Nucleus Transcriptional Profiling Defines Spinal Cord Neurons and Their Activity during Behavior.</a> Cell Reports. 22 (8), 2216-2225 (2018).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell.">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).</li><li>Campbell, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+census+of+arcuate+hypothalamus+and+median+eminence+cell+types.">A molecular census of arcuate hypothalamus and median eminence cell types.</a> Nature Neuroscience. 20 (3), 484-496 (2017).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+Reveals+Hypothalamic+Cell+Diversity.">Single-Cell RNA-Seq Reveals Hypothalamic Cell Diversity.</a> Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).</li><li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-cell+RNA-seq+for+marker-free+decomposition+of+tissues+into+cell+types.">Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types.</a> Science. 343 (6172), 776-779 (2014).</li><li>Li, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatosensory+neuron+types+identified+by+high-coverage+single-cell+RNA-sequencing+and+functional+heterogeneity.">Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity.</a> Cell Research. 26 (8), 967 (2016).</li><li>Shin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+with+Waterfall+Reveals+Molecular+Cascades+underlying+Adult+Neurogenesis.">Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis.</a> Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics.">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).</li><li>Usoskin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+classification+of+sensory+neuron+types+by+large-scale+single-cell+RNA+sequencing.">Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing.</a> Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).</li><li>Villani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+new+types+of+human+blood+dendritic+cells,+monocytes,+and+progenitors.">Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors.</a> Science. 356 (6335), (2017).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+structure.+Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).</li><li>Lacar, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+RNA-seq+of+single+neurons+reveals+molecular+signatures+of+activation.">Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation.</a> Nature Communications. 7, 11022 (2016).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain.">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li><li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-sequencing+from+single+nuclei.">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li><li>Krishnaswami, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+single+nuclei+for+RNA-seq+to+capture+the+transcriptome+of+postmortem+neurons.">Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons.</a> Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).</li><li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+nuclei+isolation+from+human+postmortem+brain+tissue.">Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).</li><li>Bergmann, O., Jovinge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+cardiomyocyte+nuclei+from+post-mortem+tissue.">Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Nohara, K., Chen, Z., Yoo, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Filtration-based+Method+of+Preparing+High-quality+Nuclei+from+Cross-linked+Skeletal+Muscle+for+Chromatin+Immunoprecipitation.">A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).</li><li>Halder, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+changes+in+plasticity+genes+accompany+the+formation+and+maintenance+of+memory.">DNA methylation changes in plasticity genes accompany the formation and maintenance of memory.</a> Nature Neuroscience. 19 (1), 102-110 (2016).</li><li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-nucleus+RNA-seq+with+DroNc-seq.">Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq.</a> Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).</li><li>. Sample Preparation Demonstrated Protocols: Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing</a> (2018)</li><li>10X Genomics. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single Cell 3' Reagent Kits v2 User Guide. , (2018).</li><li>Fu, Y., Rusznak, Z., Herculano-Houzel, S., Watson, C., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+composition+characterizing+postnatal+development+and+maturation+of+the+mouse+brain+and+spinal+cord.">Cellular composition characterizing postnatal development and maturation of the mouse brain and spinal cord.</a> Brain Structure and Function. 218 (5), 1337-1354 (2013).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+strategy+for+single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+confirms+accuracy+in+predicted+cell-type+expression+from+nuclear+RNA.">A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6031 (2017).</li><li>Bakken, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equivalent+high-resolution+identification+of+neuronal+cell+types+with+single-nucleus+and+single-cell+RNA-sequencing.">Equivalent high-resolution identification of neuronal cell types with single-nucleus and single-cell RNA-sequencing.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Div-Seq:+Single-nucleus+RNA-Seq+reveals+dynamics+of+rare+adult+newborn+neurons.">Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons.</a> Science. 353 (6302), 925-928 (2016).</li></ol>

המטרה הסופית של פרוטוקול זה נועד לבודד גרעין המכיל באיכות גבוהה RNA לניתוח תעתיק במורד הזרם. התאמנו snRNA-Seq שיטות על מנת פרופיל כל סוגי תאים בחוט השדרה. בתחילה, מצאנו כי תא אופייני דיסוציאציה שיטות היו יעילים עבור תא בודד RNA רצף, כמו חוט השדרה נוירונים פגיעים במיוחד מוות של תאים. יתר על כן, תא די?...

מערכת העצבים מורכבת heterogenous קבוצות של תאים המציגים מערך מגוון של מאפיינים מורפולוגיים, ביוכימי, אלקטרופיזיולוגיות. בעוד רצף ה-RNA בצובר כבר שימושי לקביעת רקמות שינויים בביטוי הגנים בתנאים שונים, זה מונע זיהוי שינויים תעתיק ברמת תא בודד. התפתחויות אחרונות בניתוח גנים ברמת השעתוק בתא יחיד אפשרו את הסיווג של תאים heterogenous לקבוצות פונקציונליות בהתאם שלהם רפרטואר מולקולרית, אפילו ניתן למנף כדי לזהות קבוצות של נוירונים שהיו פעילים לאחרונה. 1 , 2 , 3 , 4 בעשר השנים האחרונות, הפיתוח של RNA לתא בודד רצף (scRNA-Seq) אפשרה המחקר של ביטוי גנים בתאים בודדים, ומספק תצוגה לתוך התא-סוג גיוון. 5
הופעתה של גישות מדרגי כגון scRNA-Seq בנפט מקבילים, סיפקה פלטפורמות לרקמות הטרוגנית רצף, כולל אזורים רבים של מערכת העצבים המרכזית. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 . עם זאת, תא בודד דיסוציאציה שיטות יכול להוביל מות תאים, כמו גם ניסיוני שינויים בביטוי הגנים. 16 עבודה יש להתאים לתא בודד שיטות עריכה ברצף כדי לאפשר שימור פרופילים תעתיק אנדוגני. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 אסטרטגיות אלו היו מתאים במיוחד עבור זיהוי מיידי ביטוי גנים (הרגל) מוקדם בעקבות גירוי חושי או התנהגות. 3 , 4 בעתיד, אסטרטגיה זו יכולה לשמש גם ללמוד שינויים דינמיים ברקמות מצבי מחלה או בתגובה ללחץ. השיטות האלה, רצף יחיד הגרעין RNA (snRNA-Seq) היא גישה מבטיח שלא מצריכה בתדר מתח התא דיסוציאציה, ניתן להשתמש קשה לנתק רקמה (כגון חוט השדרה), כמו גם קפוא רקמות. 4 , 17 , 18 , 19 Adapted של שיטות קודמות של בידוד גרעינים,20,21,22,23,25 snRNA-Seq... בדרך כלל מנצל רקמות מהיר הפרעה ותא פירוק תחת בתנאי קור, צנטריפוגה, הפרדת הגרעינים מפני פסולת הסלולר. 4 הגרעינים ניתן לבודד עבור רצף הדור הבא במורד הזרם על פלטפורמות מרובות של כימוס droplet microfluidic. 4 , 7 , 24 , 25 בשיטה זו מאפשר תמונה של הפעילות תעתיק של אלפי תאים בכל רגע בזמן.
ישנן מספר אסטרטגיות עבור שחרור גרעינים מתאי לפני בידוד ורצף, כל אחת עם יתרונות וחסרונות משלהם. כאן, אנו מתארים ולהשוות בין שני פרוטוקולים כדי לאפשר בידוד של גרעינים של חוט השדרה למבוגרים עבור הזרם בנפט מקבילים snRNA-Seq: פירוק מכני דטרגנט והמסה היפוטוניק-מכניים. פירוק מכני דטרגנט מספק רקמות מלאה הפרעה תשואה הסופי גבוה יותר של גרעין האטום. היפוטוניק מכני-פירוק כולל תואר לשליטה של שיבוש רקמות, מתן הזדמנות עבור בחירת איזון בין כמות טוהר התשואה הגרעינית הסופית. גישות אלה לספק תשואה RNA דומות, שזוהו מספר גנים לכל גרעין, תא-סוג פרופיל, יכול גם לשמש גם בהצלחה snRNA-תת סעיף.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15503-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES (pH = 8.0)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgAc</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1028-10X1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA (pH = 8.0)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-46034CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10197777001</td>
			<td>Add DTT just prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Crystalgen</td>
			<td>221-238-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl (pH = 7.4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T2194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>59222C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate-A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A12475-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Crystalgen</td>
			<td>221-133-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.04% BSA</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 U/&#956;L RNAse Inhibitor</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>30281-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oak Ridge Centrifuge Tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3118-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Tissue Dounce (2 ml)</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>885303-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass large clearance pestle</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>885301-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass small clearance pestle</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>885302-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3737001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispersing tool (S 10 N &#8211; 5G)</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3304000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers, 30 &#956;m</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>1000799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XTR Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75003698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterological Pipettes: 5 ml, 10 ml</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>EF16034F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemgenes Barcoding Beads</td>
			<td>Chemgenes</td>
			<td>Macosko-2011-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 &#956;m)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo Astrios Cell Sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B25982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>120262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#8217; Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>120267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish (60 x 15 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of adult spinal cord nuclei for massively parallel single-nucleus rna sequencing

חיטוט ביטוי גנים של תא בודד מאפשר זיהוי סוג התא, התא המדינה. רצפי RNA בתא יחיד התפתחה כלי רב עוצמה עבור הלומדים פרופילים תעתיק של תאים, בעיקר ברקמות הטרוגנית כגון מערכת העצבים המרכזית. עם זאת, שיטות דיסוציאציה הדרושים עבור רצף תא בודד יכול להוביל שינויים ניסיוני במוות תא וביטוי גנים. יתר על כן, שיטות אלה מוגבלים בדרך כלל רקמת טריים, ובכך יגביל מחקרים על ארכיון וחומר ביו-bank. רצף יחיד הגרעין RNA (snRNA-Seq) הוא חלופה ללימודים תעתיק, נתון מדויק זה מזהה סוגי תאים, מאפשר המחקר של רקמות קפוא או קשה לנתק, ומפחית דיסוציאציה-induced תמלול. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול תפוקה גבוהה עבור בידוד מהיר של גרעינים על הזרם snRNA-תת סעיף. שיטה זו מאפשרת בידוד של גרעינים מדגימות חוט השדרה טרי או קפוא, יכול להיות משולב עם שתי פלטפורמות כימוס droplet בנפט מקבילים.

כאן, נוכל לבצע בידוד של גרעינים חוט השדרה המותני מבוגר העכבר עבור רצפי RNA בנפט מקבילים במורד הזרם. הפרוטוקול מעורבים שלושה מרכיבים מרכזיים: רקמת הפרעה וסלולר פירוק המגון, סוכרוז צפיפות צנטריפוגה (איור 1). תוך שניות, הניב פירוק מכני דטרגנט הכנה גרעינים גולמי...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing at JoVE.com

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד במהירות את הגרעינים באיכות גבוהה מן הרקמה טרי או קפוא עבור רצפי RNA בנפט מקבילים במורד הזרם. אנו כוללים רקמת חומרי ניקוי-מכניים, היפוטוניק-מכניים הפרעה ותא פירוק אפשרויות, אשר שניהם יכול לשמש עבור בידוד של גרעין האטום.

בידוד של חוט השדרה למבוגרים גרעינים עבור רצפי RNA חד-גרעין בנפט מקבילים

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

רצף RNA חד-תאי הוא כלי רב עוצמה לחקר פרופילי שעתוק של תאים, במיוחד ברקמה הטרוגנית, כגון מערכת העצבים המרכזית. פרוטוקול זה מספק שיטה לבודד גרעינים עבור רצף RNA בגרעין יחיד. באמצעות גרעינים במקום תאים, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על רקמות קשות לניתוק, כמו גם רקמה קפואה.יתר על כן, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על לימוד שינויים ספציפיים לסוג התא בתאים בעקבות מחלה או פציעה. התחל הליך זה עם המתת חסד של העכבר, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, לבצע חתך לאורך הגוף כדי לחשוף את האיברים הפנימיים.להוציא את העכבר על ידי משיכת האיברים הפנימיים מן חלל הגוף באמצעות מדפים. אין להשתמש במגבות נייר כדי לנקות את האזור או כדי להסיר איברים, שכן הדבר עלול לגרום למדבקים. בעזרת מספריים, חותכים את עמוד החוליות בין חוליות עמוד השדרה L2 ו-L3.כדי להוציא את חוט השדרה, להתאים מזרק שלושה מיליליטר המכיל PBS קר כקרח עם מחט 25 מד 1/4 אינץ '. מניחים את קצה המחט לתוך הקצה המקראלי של עמוד החוליות. השתמש בשתי אצבעות כדי לצבוט את החוליות כדי ליצור חותם הדוק סביב קצה המחט, ולחץ על הבוכנה כדי להוציא את חוט השדרה rostrally.מניחים את חוט השדרה בצלחת פטרי עם PBS קר כקרח. אם רק החלק המותני של החוט נדרש, לקצץ את החלקים sacral ובית החזה של חוט השדרה. בשלב זה, להקפיא את הרקמה ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס, או להשתמש מיד עבור תזה תא מכני דטרגנט כמתואר כאן, או תזה מכנית היפוטונית כמתואר בפרוטוקול הטקסט.כדי לקבוע תמוגה תאית מכנית דטרגנט, מניחים את חוט השדרה המותני ב homogenizer Dounce מקורר מראש ולהוסיף 500 microliters של חיץ תמוגה דטרגנט מקורר מראש. Dounce עם חמש משיכות של העלי רופף, A, ולאחר מכן חמש עד 10 משיכות של העלי הדוק, B. הימנע להרים את homogenizer מחוץ ת פתרון תמוגה בין משיכות, ולהימנע החדרת בועות. עכשיו, מניחים מסננת 40 מיקרון מעל צינור חרוט 50 מיליליטר מקורר מראש ורטוב מראש עם מיליליטר אחד של חיץ סוכרוז נמוך.מוסיפים מיליליטר אחד של מאגר סוכרוז נמוך להומוגניזר Dounce המכיל את הגרעינים הגולמיים במאגר התמוגה, ומערבבים בעדינות על ידי צינורות פעמיים עד שלוש פעמים. מעבירים את הכנת הגרעינים הגולמיים מעל מסננת ה-40 מיקרון, לצינור חרוט 50 מיליליטר מקורר מראש. להעביר מאגר סוכרוז נמוך מיליליטר נוסף מעל מסננת 40 מיקרון, להביא את הנפח הסופי לשלושה מיליליטר של חיץ סוכרוז נמוך ו 500 microliters של מאגר תיזה.חזור על שלבים אלה אם שילוב מיתרים מרובים, קירור באותו צינור חרוט. לאחר מכן, צנטריפוגה המדגם ב 3200 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. ברגע שהצנטריפוגה תושלם, תנקה את העל-טבעי.אנחנו להשעות את הצבעים באמצעות שלושה מיליליטר של חיץ סוכרוז נמוך. בעדינות מערבולת כדי להסיר את גלולה מהקיר כדי להקל על ההתכוונות. לאחר שנתנו לדגימה לשבת על קרח במשך שתי דקות, מעבירים את ההשעיה לצינור אוק רידג'.באמצעות homogenizer בהגדרה אחת, הומוגניזציה הגרעינים במאגר סוכרוז נמוך במשך 15 עד 30 שניות, שמירה על המדגם על קרח. לאחר מכן, השתמש פיפטה סרולוגית לשכבה 12.5 מיליליטר של חיץ סוכרוז צפיפות, מתחת הומוגנטי מאגר סוכרוז נמוך, דואג לא ליצור בועה שמשבשת את שכבות הצפיפות. צנטריפוגה הצינורות ב 3200 פעמים G, במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר שהצנטריפוגה הושלמה, מיד תנקה את העל-טבעי בתנועה מהבהבת. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להסיר באופן מיידי את צינור אוק רידג' מהצנטריפוגה, ולפענח במהירות את העל-טבעי. באמצעות 100 מיקרוליטרים למיליליטר אחד של פתרון ההתפלה מחדש, אנו משהים את הגרעינים שנותרו על הקיר.הימנעו מהזעף שנותר עם ההכנה המבוססת על חומר ניקוי. כישלון לעשות צעדים אלה במהירות יכול לגרום להכנת גרעינים עם פסולת הסלולר עודף, או מיאלין, אשר יכול לעכב במורד הזרם רצף RNA גרעין יחיד. מסננים את הגרעינים דרך מסננת בגודל נקבוביות של 30 עד 35 מיקרון ואוסף בצינור מקורר מראש.לקבוע את תפוקת הגרעינים, באמצעות hemocytometer לספור גרעינים תחת מטרה 10 x, לפני שתמשיך רצף RNA גרעין יחיד, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. שדה בהיר ותמונות epifluorescent של גרעינים, מבודד באמצעות פרוטוקול תמיסת מכני דטרגנט, מוצגים ב 10 x. גרעינים אלה מבודדים באופן לא משוחד, ומאפשרים חקר פרופילי ביטוי גנים אנדוגניים ברמה של תא בודד.מוצג כאן, הוא העלילה tSNE נציג של רצף RNA גרעין יחיד, מתוך חוט השדרה המותני העכבר, באמצעות פלטפורמת אנקפסולציה טיפה מקבילה מאסיבית. גרעינים מבודדים מרקמה טרייה או קפואה יכולים לשמש לתהווים בפלטפורמות מסחריות ואקדמיות. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לחקור פרופילי שעתוק ברמת התא הבודד, תוך שימוש ברקמות קשות לניתוק, כגון חוט השדרה, או אפילו רקמה קפואה, כגון חומר ביו-בנקאי.בעת ניסיון הליך זה, חשוב להפחית את משך הזמן בין המתת חסד תותבת הסלולר. יתר על כן, חשוב למזער בועות שהוכנסו לפתרונות מתזה סלולרית להתחדשות, ולקנות גרעיני חיות מחמד בזהירות. לאחר הליך זה, ניתן להשתמש בגרעין עבור יישומים חלופיים, כגון מיון facs, כדי לבודד סוגי תאים ספציפיים.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

חוט השדרה Electrophysiology II: ייצור תאי אלקטרודה יניקה

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

ייצור RNA לניתוח תעתיקי מגופי תאי נוירון מוטוריים של חוט השדרה של העכבר על ידי לכידת לייזר Microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

RNA-Seq ניתוח של ביטוי הגנים בדיפרנציאל חוט השדרה Electroporated אפרוח עוברי

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

הכנת תרבויות גליה מעורבת ראשיים מרקמות קורד למבוגרים עכבר השדרה

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

שחול הידראולי של קורד ובידוד השדרה של גרעיני שורש הגבה במכרסמים

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

נוירונים חוט השדרה בידוד ותרבות מ עכברים ניאונטליים

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

בידוד של אזור-מיקרוגליה ספציפי מתוך חצי הכדור השני של המוח העכבר עבור רצפי RNA של תא יחיד בודד

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

משלוח פנים-עורקי של תאי גזע עצביים למוח עכברוש ועכבר: יישום איסכמיה מוחין

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Induction of Complete Transection-Type Spinal Cord Injury in Mice

אינדוקציה של פגיעה מלאה בחוט השדרה מסוג טרנס-פעולה בעכברים

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, ...

A Minimally Invasive, Fast Spinal Cord Lateral Hemisection Technique for Modeling Open Spinal Cord Injuries in Rats

Open spinal cord injury techniques modeling laceration-like injuries are time-consuming and invasive because they involve laminectomy. This new technique ...