Name: isolation of adult spinal cord nuclei for massively parallel single-nucleus rna sequencing
Uploaded: 2018-10-12T14:30:00
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यह काम NINDS के अंदर प्रोग्राम (1 जिया NS003153 02) और NIDCD (1 जिया DC000059 18) के सहयोग से किया गया । हम अपनी तकनीकी सहायता और सहायक चर्चा के लिए एल ली और C.I. Dobrott धंयवाद, और सी. कठे पांडुलिपि की समीक्षा के लिए ।

सभी पशु काम एक राष्ट्रीय मस्तिष्क संबंधी विकार और स्ट्रोक पशु देखभाल और उपयोग समिति के नेशनल इंस्टीट्यूट द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार प्रदर्शन किया गया । पुरुष और महिला ICR/CD-1 वाइल्ड-टाइप चूहों ?...

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	<li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+experience-dependent+transcriptomic+states+in+the+mouse+visual+cortex.">Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).</li><li>Hu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+Cell-Type+Composition+and+Activity-Dependent+Transcriptional+State+in+Mammalian+Brains+by+Massively+Parallel+Single-Nucleus+RNA-Seq.">Dissecting Cell-Type Composition and Activity-Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq.</a> Molecular Cell. 68 (5), 1006-1015 (2017).</li><li>Wu, Y. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+census+of+arcuate+hypothalamus+and+median+eminence+cell+types.">A molecular census of arcuate hypothalamus and median eminence cell types.</a> Nature Neuroscience. 20 (3), 484-496 (2017).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+Reveals+Hypothalamic+Cell+Diversity.">Single-Cell RNA-Seq Reveals Hypothalamic Cell Diversity.</a> Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).</li><li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-cell+RNA-seq+for+marker-free+decomposition+of+tissues+into+cell+types.">Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types.</a> Science. 343 (6172), 776-779 (2014).</li><li>Li, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatosensory+neuron+types+identified+by+high-coverage+single-cell+RNA-sequencing+and+functional+heterogeneity.">Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity.</a> Cell Research. 26 (8), 967 (2016).</li><li>Shin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+with+Waterfall+Reveals+Molecular+Cascades+underlying+Adult+Neurogenesis.">Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis.</a> Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics.">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).</li><li>Usoskin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+classification+of+sensory+neuron+types+by+large-scale+single-cell+RNA+sequencing.">Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing.</a> Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).</li><li>Villani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+new+types+of+human+blood+dendritic+cells,+monocytes,+and+progenitors.">Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors.</a> Science. 356 (6335), (2017).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+structure.+Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).</li><li>Lacar, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+RNA-seq+of+single+neurons+reveals+molecular+signatures+of+activation.">Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation.</a> Nature Communications. 7, 11022 (2016).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain.">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li><li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-sequencing+from+single+nuclei.">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li><li>Krishnaswami, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+single+nuclei+for+RNA-seq+to+capture+the+transcriptome+of+postmortem+neurons.">Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons.</a> Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).</li><li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+nuclei+isolation+from+human+postmortem+brain+tissue.">Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).</li><li>Bergmann, O., Jovinge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+cardiomyocyte+nuclei+from+post-mortem+tissue.">Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Nohara, K., Chen, Z., Yoo, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Filtration-based+Method+of+Preparing+High-quality+Nuclei+from+Cross-linked+Skeletal+Muscle+for+Chromatin+Immunoprecipitation.">A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).</li><li>Halder, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+changes+in+plasticity+genes+accompany+the+formation+and+maintenance+of+memory.">DNA methylation changes in plasticity genes accompany the formation and maintenance of memory.</a> Nature Neuroscience. 19 (1), 102-110 (2016).</li><li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-nucleus+RNA-seq+with+DroNc-seq.">Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq.</a> Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).</li><li>. Sample Preparation Demonstrated Protocols: Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing</a> (2018)</li><li>10X Genomics. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single Cell 3' Reagent Kits v2 User Guide. , (2018).</li><li>Fu, Y., Rusznak, Z., Herculano-Houzel, S., Watson, C., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+composition+characterizing+postnatal+development+and+maturation+of+the+mouse+brain+and+spinal+cord.">Cellular composition characterizing postnatal development and maturation of the mouse brain and spinal cord.</a> Brain Structure and Function. 218 (5), 1337-1354 (2013).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+strategy+for+single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+confirms+accuracy+in+predicted+cell-type+expression+from+nuclear+RNA.">A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6031 (2017).</li><li>Bakken, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equivalent+high-resolution+identification+of+neuronal+cell+types+with+single-nucleus+and+single-cell+RNA-sequencing.">Equivalent high-resolution identification of neuronal cell types with single-nucleus and single-cell RNA-sequencing.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Div-Seq:+Single-nucleus+RNA-Seq+reveals+dynamics+of+rare+adult+newborn+neurons.">Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons.</a> Science. 353 (6302), 925-928 (2016).</li></ol>

इस प्रोटोकॉल का अंतिम लक्ष्य बहाव transcriptional विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता आरएनए युक्त नाभिक को अलग करने के लिए है । हम snRNA-Seq तरीके अनुकूलित करने के क्रम में रीढ़ की हड्डी में कोशिका प्रकार के सभी प्रोफ़ाइल क?...

तंत्रिका तंत्र कोशिकाओं के heterogenous समूहों है कि रूपात्मक की एक विविध सरणी, जैव रासायनिक, और electrophysiological गुण प्रदर्शित शामिल है । जबकि बल्क आरएनए अनुक्रमण विभिन्न परिस्थितियों में जीन अभिव्यक्ति में ऊतक चौड़ा परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए उपयोगी हो गया है, यह एकल कोशिका स्तर पर transcriptional परिवर्तन का पता लगाने precludes. एकल सेल transcriptional विश्लेषण में हाल के अग्रिमों कार्यात्मक समूहों में अपने आणविक प्रदर्शनों की जांच के आधार पर heterogenous कोशिकाओं के वर्गीकरण को सक्षम किया है और भी ंयूरॉंस कि हाल ही में सक्रिय किया गया था के सेट का पता लगाने के लिए leveraged किया जा सकता है । 1 , 2 , 3 , 4 पिछले दस वर्षों में, एकल कोशिका आरएनए अनुक्रमण (scRNA-Seq) के विकास ने कोशिका-प्रकार की विविधता में एक दृश्य प्रदान करते हुए, व्यक्तिगत कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन को सक्षम किया है । 5
ऐसे बड़े पैमाने पर समानांतर scRNA-Seq के रूप में स्केलेबल दृष्टिकोण के उद्भव, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के कई क्षेत्रों सहित विषम ऊतकों अनुक्रम के लिए प्लेटफार्मों प्रदान की गई है । 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 हालांकि, एकल सेल पृथक्करण तरीकों कोशिका मृत्यु के साथ ही जीन अभिव्यक्ति में प्रयोगात्मक परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । 16 हाल ही में काम अंतर्जात transcriptional प्रोफाइल के संरक्षण को सक्षम करने के लिए एकल सेल अनुक्रमण तरीकों को अनुकूलित किया है । 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 इन रणनीतियों संवेदी उत्तेजना या व्यवहार के बाद तत्काल जल्दी जीन (IEG) अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है । 3 , 4 भविष्य में, इस रणनीति भी रोग राज्यों में या तनाव के जवाब में ऊतकों में गतिशील परिवर्तन का अध्ययन किया जा सकता है । इन विधियों में से एक नाभिक आरएनए sequencing (snRNA-Seq) तनाव उत्प्रेरण सेल पृथक्करण शामिल नहीं है और अलग कर देना ऊतक (जैसे रीढ़ की हड्डी के रूप में) के लिए मुश्किल पर इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ ही जमे हुए ऊतक एक आशाजनक दृष्टिकोण है । 4 , 17 , 18 , 19 पिछले नाभिक अलगाव तरीकों से अनुकूलित,20,21,22,23,25 snRNA-Seq आम तौर पर तेजी से ऊतक व्यवधान और सेल का इस्तेमाल lysis ठंड की स्थिति, केंद्रापसारक के तहत, और सेलुलर मलबे से नाभिक की जुदाई । 4 नाभिक कई microfluidic छोटी बूंद encapsulation प्लेटफार्मों पर बहाव अगली पीढ़ी अनुक्रमण के लिए अलग किया जा सकता है । 4 , 7 , 24 , 25 इस विधि समय में एक पल में कोशिकाओं के हजारों की transcriptional गतिविधि का एक स्नैपशॉट के लिए अनुमति देता है ।
अलगाव और अनुक्रमण से पहले कोशिकाओं से नाभिक जारी करने के लिए कई रणनीतियों, अपने स्वयं के फायदे और नुकसान के साथ प्रत्येक रहे हैं । यहां, हम वर्णन और दो प्रोटोकॉल की तुलना करने के लिए बहाव बड़े पैमाने पर समानांतर snRNA-Seq: डिटर्जेंट यांत्रिक lysis और hypotonic-यांत्रिक lysis के लिए वयस्क रीढ़ की हड्डी से नाभिक के अलगाव सक्षम करें । डिटर्जेंट-यांत्रिक lysis पूर्ण ऊतक विघटन और नाभिक के एक उच्च अंतिम उपज प्रदान करता है । Hypotonic यांत्रिक-lysis ऊतक विघटन के एक नियंत्रणीय डिग्री शामिल है, मात्रा और अंतिम परमाणु उपज की शुद्धता के बीच एक संतुलन का चयन करने के लिए एक अवसर प्रदान करते हैं । इन दृष्टिकोणों तुलनीय आरएनए उपज प्रदान करते हैं, नाभिक प्रति जीन की संख्या का पता चला, और सेल-प्रकार रूपरेखा और भी दोनों सफलतापूर्वक snRNA-Seq के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15503-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES (pH = 8.0)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgAc</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1028-10X1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA (pH = 8.0)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-46034CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10197777001</td>
			<td>Add DTT just prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Crystalgen</td>
			<td>221-238-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl (pH = 7.4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T2194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>59222C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate-A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A12475-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Crystalgen</td>
			<td>221-133-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.04% BSA</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 U/&#956;L RNAse Inhibitor</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>30281-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oak Ridge Centrifuge Tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3118-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Tissue Dounce (2 ml)</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>885303-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass large clearance pestle</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>885301-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass small clearance pestle</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>885302-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3737001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispersing tool (S 10 N &#8211; 5G)</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3304000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers, 30 &#956;m</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>1000799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XTR Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75003698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterological Pipettes: 5 ml, 10 ml</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>EF16034F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemgenes Barcoding Beads</td>
			<td>Chemgenes</td>
			<td>Macosko-2011-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 &#956;m)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo Astrios Cell Sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B25982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>120262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#8217; Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>120267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish (60 x 15 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of adult spinal cord nuclei for massively parallel single-nucleus rna sequencing

एक व्यक्ति कोशिका की जीन अभिव्यक्ति की जांच सेल प्रकार और सेल राज्य की पहचान को सक्षम बनाता है । एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण केंद्रीय तंत्रिका तंत्र जैसे विषम ऊतकों में, विशेष रूप से कोशिकाओं के transcriptional प्रोफाइल का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा है । हालांकि, पृथक्करण एकल सेल अनुक्रमण के लिए आवश्यक तरीकों जीन अभिव्यक्ति और कोशिका मृत्यु में प्रयोगात्मक परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इसके अलावा, इन तरीकों को आम तौर पर ताजा ऊतक के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं, इस प्रकार अभिलेखीय और जैव बैंक सामग्री पर अध्ययन सीमित । एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण (snRNA-Seq) transcriptional अध्ययन के लिए एक आकर्षक विकल्प है, यह देखते हुए कि यह सही सेल प्रकार की पहचान करता है, ऊतक के अध्ययन की अनुमति देता है कि जमे हुए या अलग कर देना करने के लिए मुश्किल है, और पृथक्करण प्रेरित कम कर देता है प्रतिलेखन. यहां, हम बहाव snRNA-Seq के लिए नाभिक के तेजी से अलगाव के लिए एक उच्च प्रवाह प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इस विधि ताजा या जमे हुए रीढ़ की हड्डी के नमूनों से नाभिक के अलगाव को सक्षम बनाता है और दो बड़े पैमाने पर समानांतर छोटी बूंद encapsulation प्लेटफार्मों के साथ जोड़ा जा सकता है ।

यहाँ, हम बहाव बड़े पैमाने पर समानांतर आरएनए अनुक्रमण के लिए वयस्क माउस काठ रीढ़ की हड्डी से नाभिक का अलगाव प्रदर्शन किया । प्रोटोकॉल तीन मुख्य घटक शामिल: ऊतक व्यवधान और सेलुलर lysis, homogenization, और स?...

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Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

यहाँ, हम तेजी से बहाव बड़े पैमाने पर समानांतर आरएनए अनुक्रमण के लिए ताजा या जमे हुए ऊतकों से उच्च गुणवत्ता नाभिक को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं । हम डिटर्जेंट-यांत्रिक और hypotonic यांत्रिक ऊतक व्यवधान और कोशिका lysis विकल्प, दोनों जिनमें से नाभिक के अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता शामिल हैं ।

बड़े पैमाने पर समानांतर एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण के लिए वयस्क रीढ़ की हड्डी नाभिक के अलगाव

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

एकल कोशिका आरएनए अनुक्रमण कोशिकाओं के प्रतिलेखन प्रोफाइल का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, विशेष रूप से विषम ऊतकों में, जैसे केंद्रीय तंत्रिका तंत्र। यह प्रोटोकॉल एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण के लिए नाभिक को अलग करने के लिए एक विधि प्रदान करता है। कोशिकाओं के बजाय नाभिक का उपयोग करके, इस विधि को मुश्किल से अलग ऊतकों के साथ-साथ जमे हुए ऊतकों पर लागू किया जा सकता है।इसके अलावा, इस विधि को रोग या चोट के बाद कोशिकाओं में सेल प्रकार-विशिष्ट परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है। पाठ प्रोटोकॉल में वर्णित माउस इच्छामृत्यु के साथ इस प्रक्रिया को शुरू करें। इसके बाद, आंतरिक अंगों को बेनकाब करने के लिए शरीर की लंबाई के साथ एक चीरा बनाएं।शरीर के गुहा से आंतरिक अंगों को संदंश का उपयोग करके माउस को निकालकर प्राप्त करें। क्षेत्र को साफ करने या अंगों को हटाने के लिए पेपर तौलिए का उपयोग न करें, क्योंकि इससे संदूषक पेश हो सकते हैं। कैंची का उपयोग करना, L2 और L3 रीढ़ की हड्डी कशेरुकी के बीच कशेरुकी स्तंभ काटें।रीढ़ की हड्डी को बाहर निकालने के लिए, 25 गेज 1/4 इंच सुई के साथ बर्फ-ठंडे पीबीएस युक्त तीन मिलीलीटर सिरिंज फिट करें। सुई की नोक को कशेरुका स्तंभ के पवित्र छोर में रखें। सुई की नोक के चारों ओर एक तंग सील बनाने के लिए कशेरुकी चुटकी करने के लिए दो उंगलियों का उपयोग करें, और रीढ़ की हड्डी को रोकने के लिए प्लंजर पर नीचे दबाएं।रीढ़ की हड्डी को बर्फ से ठंडे पीबीएस के साथ पेट्री डिश में रखें। यदि केवल कॉर्ड के काठ के हिस्से की आवश्यकता होती है, तो रीढ़ की हड्डी के पवित्र और छाती वाले हिस्सों को ट्रिम करें। इस बिंदु पर, ऊतक को फ्रीज करें और शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, या यहां वर्णित डिटर्जेंट मैकेनिकल सेल लाइसिस के लिए तुरंत उपयोग करें, या टेक्स्ट प्रोटोकॉल में वर्णित हाइपोटोनिक मैकेनिकल लाइसिस।डिटर्जेंट मैकेनिकल सेल लाइसिस निर्धारित करने के लिए, काठ की रीढ़ की हड्डी को पूर्व-ठंडा डोउंस होमोजेनाइजर में रखें और प्री-ठंडा डिटर्जेंट लाइसिस बफर के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें। ढीले मूसल, ए के पांच स्ट्रोक के साथ Dounce, और फिर तंग मूसल के पांच से 10 स्ट्रोक, बी स्ट्रोक के बीच में लाइसिस समाधान के बाहर समरूप उठाने से बचें, और बुलबुले शुरू करने से बचें । अब, एक पूर्व ठंडा 50 मिलीलीटर शंकु नली पर एक 40 माइक्रोन छन्नी जगह है और कम सुक्रोज बफर के एक मिलीलीटर के साथ पूर्व गीला।लाइसिस बफर में क्रूड न्यूक्लियी युक्त डोंस होमोजेनाइजर में कम सुक्रोज बफर का एक मिलीलीटर जोड़ें, और दो से तीन बार पाइपिंग करके धीरे से मिलाएं। 40-माइक्रोन छलनी पर क्रूड नाभिक तैयारी पास, पूर्व ठंडा 50 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में। 40 माइक्रोन छन्नी पर एक अतिरिक्त एक मिलीलीटर कम सुक्रोज बफर पास करें, जिससे अंतिम मात्रा में कम सुक्रोज बफर के तीन मिलीलीटर और लाइसिस बफर के 500 माइक्रोलीटर आ गए।इन चरणों को दोहराएं यदि कई डोरियों का संयोजन करें, एक ही शंकु नली में ठंडा करें। इसके बाद 3200 बार जी पर 10 मिनट के लिए सैंपल को चार डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रलाइज करें। एक बार अपकेंद्रित्र पूर्ण हो जाने के बाद, सुपरनेट को डिकेंट करें।हम कम सुक्रोज बफर के तीन मिलीलीटर का उपयोग कर पैलेट को निलंबित करते हैं। धीरे-धीरे क्षतिपूर्ति की सुविधा के लिए दीवार से गोली हटाने के लिए भंवर। नमूना दो मिनट के लिए बर्फ पर बैठने देने के बाद, एक ओक रिज ट्यूब के लिए निलंबन हस्तांतरण ।एक स्थापित करने में समरूपता का उपयोग करना, बर्फ पर नमूना रखते हुए, 15 से 30 सेकंड के लिए कम सुक्रोज बफर में नाभिक को समरूप बनाना। फिर, कम सुक्रोज बफर समरूप के नीचे घनत्व सुक्रोज बफर के 12.5 मिलीलीटर परत के लिए एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करें, इस बात का ध्यान रखें कि घनत्व परतों को बाधित करने वाला बुलबुला न बनाएं। ३२०० बार जी पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र, चार डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए ।एक बार अपकेंद्री पूरा हो जाने के बाद, तुरंत एक फ्लिकिंग मोशन में सुपरनेट को डिकेंट करें। इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, अपकेंद्रित्र से ओक रिज ट्यूब को तुरंत हटाने के लिए याद रखना महत्वपूर्ण है, और जल्दी से सुपरनैंट को कम करना। पुनः पेंशन समाधान के एक मिलीलीटर के लिए 100 माइक्रोलीटर का उपयोग करके, हम दीवार पर शेष नाभिक को निलंबित करते हैं।डिटर्जेंट आधारित तैयारी के साथ रहता है कि myelin सिकोड़ी से बचें। इन चरणों को जल्दी से करने में विफलता के परिणामस्वरूप अतिरिक्त सेलुलर मलबे, या मायलिन के साथ एक नाभिक तैयारी हो सकती है, जो डाउनस्ट्रीम सिंगल-न्यूक्लियस आरएनए अनुक्रमण में बाधा डाल सकती है। नाभिक को 30 से 35 माइक्रोन पोर आकार छलनी के माध्यम से फ़िल्टर करें और एक पूर्व-ठंडा ट्यूब में एकत्र करें।एक हीन्यूक्लियी आरएनए अनुक्रमण के लिए आगे बढ़ने से पहले, जैसा कि पाठ प्रोटोकॉल में वर्णित है, 10 x उद्देश्य के तहत नाभिक की गिनती करने के लिए एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके नाभिक उपज का निर्धारण करें। डिटर्जेंट मैकेनिकल लाइसिस प्रोटोकॉल का उपयोग करके अलग किए गए नाभिक के उज्ज्वल क्षेत्र और एपिफ्लोरेसेंट छवियों को 10 x पर दिखाया गया है। ये नाभिक निष्पक्ष तरीके से अलग-थलग पड़ जाते हैं, जिससे एक ही कोशिका के स्तर पर अंतर्जात जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल के अध्ययन की अनुमति होती है ।यहां दिखाया गया है, एक माउस काठ रीढ़ की हड्डी से एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण का एक प्रतिनिधि tSNE साजिश है, एक बड़े पैमाने पर समानांतर बूंद encapsulation मंच का उपयोग कर । ताजा या जमे हुए ऊतकों से अलग नाभिक दोनों वाणिज्यिक और अकादमिक प्लेटफार्मों पर अनुक्रमण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह तकनीक शोधकर्ताओं को एकल कोशिका स्तर पर ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल का पता लगाने में सक्षम बनाती है, जो रीढ़ की हड्डी, या यहां तक कि बायोबैंक सामग्री जैसे जमे हुए ऊतकों जैसे कठिन-से-वियोजन ऊतकों का उपयोग करके।इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, इच्छामृत्यु और सेलुलर लाइसिस के बीच समय की मात्रा को कम करना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, सेलुलर लाइसिस से पुनर्संपन्न करने के लिए समाधान में पेश बुलबुले को कम करना और देखभाल के साथ पालतू नाभिक खरीदना महत्वपूर्ण है। इस प्रक्रिया के बाद, विशिष्ट सेल प्रकारों को अलग करने के लिए वैकल्पिक अनुप्रयोगों, जैसे facs छंटाई के लिए नाभिक का उपयोग किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

कोशिकी सक्शन इलेक्ट्रोड निर्माण: स्पाइनल कॉर्ड इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी द्वितीय

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन द्वारा माउस स्पाइनल कॉर्ड मोटर न्यूरॉन सेल निकायों से ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण के लिए आरएनए का उत्पादन

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

Electroporated लड़की भ्रूण रीढ़ की हड्डी में विभेदक जीन एक्सप्रेशन की शाही सेना Seq विश्लेषण

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

वयस्क माउस रीढ़ की हड्डी ऊतक से प्राथमिक मिश्रित glial संस्कृति की तैयारी

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

चूहे में रीढ़ की हड्डी और पृष्ठीय रूट ganglia के अलगाव की हाइड्रोलिक बाहर निकालना

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

नवजात शिशुओं से स्पाइनल कॉर्ड न्यूरॉन्स अलगाव और संस्कृति

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

डीप सिंगल-सेल आरएनए अनुक्रमण के लिए एक वयस्क माउस ब्रेन गोलार्द्ध से क्षेत्र-विशिष्ट माइक्रोग्लिया का अलगाव

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

चूहा और माउस मस्तिष्क के लिए तंत्रिका स्टेम सेल की अंतर-धमनी वितरण: सेरेब्रल इस्केमिया के लिए आवेदन

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Induction of Complete Transection-Type Spinal Cord Injury in Mice

चूहों में पूर्ण ट्रांसेक्शन-टाइप स्पाइनल कॉर्ड इंजरी का प्रेरण

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, ...

A Minimally Invasive, Fast Spinal Cord Lateral Hemisection Technique for Modeling Open Spinal Cord Injuries in Rats

Open spinal cord injury techniques modeling laceration-like injuries are time-consuming and invasive because they involve laminectomy. This new technique ...