Name: isolation of adult spinal cord nuclei for massively parallel single-nucleus rna sequencing
Uploaded: 2018-10-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato dal programma intramurale di NINDS (1 ZIA NS003153 02) e NIDCD (1 ZIA DC000059 18). Ringraziamo L. Li e C.I. Dobrott per il loro supporto tecnico e discussioni utili e Kathe C. per la revisione del manoscritto.

Tutto il lavoro animale è stato eseguito secondo un protocollo approvato dal Istituto nazionale dei disordini neurologici e colpo Animal Care e Comitato di uso. Bilanciato campioni di maschi e femminili topi wild-type ICR/CD-1, tra 8 e 12 settimane vecchio, sono stati utilizzati per tutti gli esperimenti. Topi devono essere manipolati conformemente alle linee guida istituzionali Animal Care e Comitato di uso locale.
1. preparazione dei materiali e buffer
<ol><li>Preparare tutti i buffer il ...

<ol>
	<li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+experience-dependent+transcriptomic+states+in+the+mouse+visual+cortex.">Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).</li><li>Hu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+Cell-Type+Composition+and+Activity-Dependent+Transcriptional+State+in+Mammalian+Brains+by+Massively+Parallel+Single-Nucleus+RNA-Seq.">Dissecting Cell-Type Composition and Activity-Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq.</a> Molecular Cell. 68 (5), 1006-1015 (2017).</li><li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+Activated+Cell+Populations+Using+Single-Cell+RNA-Seq.">Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li><li>Sathyamurthy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+Parallel+Single+Nucleus+Transcriptional+Profiling+Defines+Spinal+Cord+Neurons+and+Their+Activity+during+Behavior.">Massively Parallel Single Nucleus Transcriptional Profiling Defines Spinal Cord Neurons and Their Activity during Behavior.</a> Cell Reports. 22 (8), 2216-2225 (2018).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell.">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).</li><li>Campbell, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+census+of+arcuate+hypothalamus+and+median+eminence+cell+types.">A molecular census of arcuate hypothalamus and median eminence cell types.</a> Nature Neuroscience. 20 (3), 484-496 (2017).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+Reveals+Hypothalamic+Cell+Diversity.">Single-Cell RNA-Seq Reveals Hypothalamic Cell Diversity.</a> Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).</li><li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-cell+RNA-seq+for+marker-free+decomposition+of+tissues+into+cell+types.">Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types.</a> Science. 343 (6172), 776-779 (2014).</li><li>Li, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatosensory+neuron+types+identified+by+high-coverage+single-cell+RNA-sequencing+and+functional+heterogeneity.">Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity.</a> Cell Research. 26 (8), 967 (2016).</li><li>Shin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+with+Waterfall+Reveals+Molecular+Cascades+underlying+Adult+Neurogenesis.">Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis.</a> Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics.">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).</li><li>Usoskin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+classification+of+sensory+neuron+types+by+large-scale+single-cell+RNA+sequencing.">Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing.</a> Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).</li><li>Villani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+new+types+of+human+blood+dendritic+cells,+monocytes,+and+progenitors.">Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors.</a> Science. 356 (6335), (2017).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+structure.+Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).</li><li>Lacar, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+RNA-seq+of+single+neurons+reveals+molecular+signatures+of+activation.">Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation.</a> Nature Communications. 7, 11022 (2016).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain.">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li><li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-sequencing+from+single+nuclei.">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li><li>Krishnaswami, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+single+nuclei+for+RNA-seq+to+capture+the+transcriptome+of+postmortem+neurons.">Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons.</a> Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).</li><li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+nuclei+isolation+from+human+postmortem+brain+tissue.">Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).</li><li>Bergmann, O., Jovinge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+cardiomyocyte+nuclei+from+post-mortem+tissue.">Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Nohara, K., Chen, Z., Yoo, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Filtration-based+Method+of+Preparing+High-quality+Nuclei+from+Cross-linked+Skeletal+Muscle+for+Chromatin+Immunoprecipitation.">A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).</li><li>Halder, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+changes+in+plasticity+genes+accompany+the+formation+and+maintenance+of+memory.">DNA methylation changes in plasticity genes accompany the formation and maintenance of memory.</a> Nature Neuroscience. 19 (1), 102-110 (2016).</li><li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-nucleus+RNA-seq+with+DroNc-seq.">Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq.</a> Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).</li><li>. Sample Preparation Demonstrated Protocols: Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing</a> (2018)</li><li>10X Genomics. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single Cell 3' Reagent Kits v2 User Guide. , (2018).</li><li>Fu, Y., Rusznak, Z., Herculano-Houzel, S., Watson, C., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+composition+characterizing+postnatal+development+and+maturation+of+the+mouse+brain+and+spinal+cord.">Cellular composition characterizing postnatal development and maturation of the mouse brain and spinal cord.</a> Brain Structure and Function. 218 (5), 1337-1354 (2013).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+strategy+for+single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+confirms+accuracy+in+predicted+cell-type+expression+from+nuclear+RNA.">A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6031 (2017).</li><li>Bakken, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equivalent+high-resolution+identification+of+neuronal+cell+types+with+single-nucleus+and+single-cell+RNA-sequencing.">Equivalent high-resolution identification of neuronal cell types with single-nucleus and single-cell RNA-sequencing.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Div-Seq:+Single-nucleus+RNA-Seq+reveals+dynamics+of+rare+adult+newborn+neurons.">Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons.</a> Science. 353 (6302), 925-928 (2016).</li></ol>

L'obiettivo finale di questo protocollo è quello di isolare i nuclei contenente RNA di alta qualità per analisi trascrizionale a valle. Abbiamo adattato snRNA-Seq metodi al fine di profilo di tutti i tipi di cellule nel midollo spinale. Inizialmente, abbiamo trovato che metodi dissociazione tipici delle cellule erano inefficaci per la sequenziazione di singola cellula RNA, come neuroni del midollo spinale sono particolarmente vulnerabili alla morte delle cellule. Inoltre, metodi di dissociazione delle cellule inducono ...

Il sistema nervoso è composto da gruppi eterogenei di cellule che visualizzano una gamma diversificata di proprietà morfologiche, biochimiche ed elettrofisiologiche. Mentre il sequenziamento di RNA di massa è stato utile per determinare le modifiche a livello di tessuto nell'espressione genica in condizioni diverse, non preclude il rilevamento delle modifiche trascrizionali a livello di singola cellula. Gli avanzamenti recenti nell'analisi trascrizionale monocellulari hanno permesso la classificazione delle cellule eterogenee in gruppi funzionali basati sul loro repertorio molecolare e possono essere sfruttati anche per rilevare insiemi di neuroni che erano stato recentemente attivi. 1 , 2 , 3 , 4 negli ultimi dieci anni, lo sviluppo della singola cella RNA sequenziamento (scRNA-Seq) ha permesso lo studio dell'espressione genica in cellule individuali, offrendo una visione diversità di cellula-tipo. 5
L'emergere di approcci scalabili come parallelismo massivo scRNA-Seq, ha fornito piattaforme ai tessuti eterogenei sequenza, tra cui molte regioni del sistema nervoso centrale. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 tuttavia, metodi di dissociazione di singola cellula possono portare a morte cellulare, nonché di modifiche sperimentali nell'espressione genica. 16 lavoro recente ha adattato i metodi di sequenziamento di singola cella per consentire la conservazione dei profili trascrizionali endogeni. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 queste strategie sono state particolarmente adatte per la rilevazione di espressione genica (IEG) inizio immediato seguito stimolo sensoriale o comportamento. 3 , 4 In futuro, questa strategia potrebbe essere utilizzata anche per studiare i cambiamenti dinamici in tessuti negli Stati di malattia o in risposta allo stress. Di questi metodi, sequenziamento singolo nucleo RNA (snRNA-Seq) è un approccio promettente che non comporta la dissociazione di cella stressanti e può essere utilizzato su difficile dissociare il tessuto (ad esempio il midollo spinale), come pure congelati tessuto. 4 , 17 , 18 , 19 adattato da precedenti metodi di isolamento di nuclei,20,21,22,23,25 snRNA-Seq in genere utilizza delle cellule e la rottura rapida dei tessuti Lisi sotto condizioni di freddo, centrifugazione e separazione dei nuclei da detriti cellulari. 4 nuclei possono essere isolati per il sequenziamento di nuova generazione a valle su piattaforme multiple di incapsulamento gocciolina microfluidica. 4 , 7 , 24 , 25 questo metodo permette un'istantanea dell'attività trascrizionale di migliaia di cellule in un momento nel tempo.
Ci sono strategie multiple per rilasciare i nuclei dalle cellule prima di isolamento e sequenziamento, ciascuno con i propri vantaggi e svantaggi. Qui, descriviamo e confrontare due protocolli per consentire l'isolamento dei nuclei dal midollo spinale adulto per il parallelismo massivo a valle snRNA-Seq: detergente-meccanica Lisi e Lisi ipotonica-meccanico. Detergente-meccanica Lisi fornisce la rottura completa del tessuto e una maggiore resa finale dei nuclei. Meccanica-Lisi ipotonica includono un livello controllabile di rottura del tessuto, fornendo un'opportunità per la selezione di un equilibrio tra la quantità e la purezza del rendimento nucleare finale. Questi approcci forniscono paragonabile rendimento del RNA, rilevati numeri di geni al nucleo e la cellula-tipo di profilatura e anche entrambi possono essere utilizzati con successo per snRNA-segg.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15503-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES (pH = 8.0)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgAc</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1028-10X1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA (pH = 8.0)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-46034CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10197777001</td>
			<td>Add DTT just prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Crystalgen</td>
			<td>221-238-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl (pH = 7.4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T2194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>59222C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate-A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A12475-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Crystalgen</td>
			<td>221-133-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.04% BSA</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 U/&#956;L RNAse Inhibitor</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>30281-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oak Ridge Centrifuge Tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3118-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Tissue Dounce (2 ml)</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>885303-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass large clearance pestle</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>885301-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass small clearance pestle</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>885302-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3737001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispersing tool (S 10 N &#8211; 5G)</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3304000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers, 30 &#956;m</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>1000799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XTR Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75003698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterological Pipettes: 5 ml, 10 ml</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>EF16034F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemgenes Barcoding Beads</td>
			<td>Chemgenes</td>
			<td>Macosko-2011-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 &#956;m)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo Astrios Cell Sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B25982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>120262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#8217; Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>120267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish (60 x 15 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of adult spinal cord nuclei for massively parallel single-nucleus rna sequencing

Espressione genica di una singola cella di sondaggio consente l'identificazione del tipo di cella e stato della cellula. Sequenziamento di RNA di cella singola è emerso come un potente strumento per lo studio di profili trascrizionali delle cellule, particolarmente in tessuti eterogenei, come il sistema nervoso centrale. Tuttavia, metodi di dissociazione richiesti per il sequenziamento di singola cellula possono portare a modifiche sperimentali nella morte delle cellule e l'espressione genica. Inoltre, questi metodi sono generalmente limitati ai tessuti freschi, limitando così gli studi su archiviazione e materiale bio-banca. Sequenziamento di singolo nucleo RNA (snRNA-Seq) è un'alternativa attraente per gli studi trascrizionale, dato che esso identifica i tipi di cellule con precisione, permette lo studio del tessuto che è congelato o difficile dissociare, e riduce la dissociazione indotta trascrizione. Qui, presentiamo un protocollo ad alta velocità per il rapido isolamento dei nuclei per downstream snRNA-segg. Questo metodo attiva l'isolamento dei nuclei da campioni di midollo spinale fresco o congelato e può essere combinato con due piattaforme di incapsulamento di parallelismo massivo della gocciolina.

Qui, abbiamo effettuato l'isolamento dei nuclei dal midollo spinale lombare topo adulto per sequenziamento di RNA massicciamente parallelo a valle. Il protocollo ha coinvolto tre componenti principali: tessuto rottura e cellular Lisi, omogeneizzazione e saccarosio centrifugazione di densità (Figura 1). In pochi secondi, la lisi di detersivo-meccanici ha reso una preparazione di nuclei grezzo con un gran numero di nuclei così come detriti cellulari e tissuta...

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Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Qui, presentiamo un protocollo per isolare rapidamente i nuclei di alta qualità dal tessuto fresco o congelato per sequenziamento di RNA massicciamente parallelo a valle. Includiamo opzioni lisi delle cellule e la rottura detergente-meccanica e ipotonico-meccanica del tessuto, entrambi dei quali possono essere utilizzati per l'isolamento dei nuclei.

Isolamento dei Nuclei del midollo spinale adulto per il sequenziamento massivamente parallelo Single-nucleo RNA

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula è un potente strumento per studiare i profili trascrittivi delle cellule, in particolare nel tessuto eterogeneo, come il sistema nervoso centrale. Questo protocollo fornisce un metodo per isolare i nuclei per il sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo. Usando nuclei al posto delle cellule, questo metodo può essere applicato a tessuti difficili da dissociare, così come ai tessuti congelati.Inoltre, questo metodo può essere applicato allo studio di cambiamenti specifici del tipo di cellula nelle cellule a seguito di malattia o lesione. Iniziare questa procedura con l'eutanasia del mouse, come descritto nel protocollo di testo. Successivamente, fai un'incisione lungo la lunghezza del corpo per esporre gli organi interni.Eviscerare il topo tirando gli organi interni dalla cavità corporea usando le forcep. Non utilizzare tovaglioli di carta per pulire l'area o rimuovere organi, in quanto ciò potrebbe introdurre contaminanti. Usando le forbici, tagliare la colonna vertebrale tra le vertebre spinali L2 e L3.Per espellere il midollo spinale, montare una siringa da tre millilitri contenente PBS ghiacciato con un ago da 1/4 di pollice calibro 25. Posizionare la punta dell'ago nell'estremità sacrale della colonna vertebrale. Utilizzare due dita per pizzicare le vertebre per creare una tenuta stretta intorno alla punta dell'ago e premere verso il basso sullo stantuffo per espellere il midollo spinale rostralmente.Posizionare il midollo spinale in una piastra di Petri con PBS ghiacciato. Se è richiesta solo la porzione lombare del cordone ombelicale, tagliare le porzioni sacrali e toraciche del midollo spinale. A questo punto, congelare il tessuto e conservare a meno 80 gradi Celsius, o utilizzare immediatamente per la lisi cellulare meccanica del detergente come descritto qui, o lisi meccanica ipotonica come descritto nel protocollo di testo.Per determinare la lisi cellulare meccanica del detergente, posizionare il midollo spinale lombare in un omogeneizzatore Dounce pre-refrigerato e aggiungere 500 microlitri di tampone di lisi detergente prerimorto. Dounce con cinque tratti del pestello sciolto, A, e poi da cinque a 10 colpi del pestello stretto, B.Evitare di sollevare l'omogeneizzatore al di fuori della soluzione di lisi tra un tratto e l'altro ed evitare di introdurre bolle. Ora, posizionare un colino da 40 micron su un tubo conico pre-refrigerato da 50 millilitri e pre-bagnato con un millilitro di tampone di saccarosio basso.Aggiungere un millilitro di tampone di saccarosio basso all'omogeneizzatore Dounce contenente i nuclei grezzi nel tampone di lisi e mescolare delicatamente pipettando da due a tre volte. Passare i nuclei grezzi prep sopra il colino da 40 micron, nel tubo conico pre-refrigerato da 50 millilitri. Passare un ulteriore tampone di saccarosio basso di un millilitro sul colino da 40 micron, portando il volume finale a tre millilitri del tampone di saccarosio basso e a 500 microlitri del tampone di lysis.Ripetere questi passaggi se si combinano più cavi, raffreddando nello stesso tubo conico. Quindi, centrifugare il campione a 3200 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Una volta completata la centrifugazione, decantare il supernatante.Sospendiamo la tavolozza usando tre millilitri di tampone di saccarosio basso. Ruotare delicatamente per rimuovere il pellet dalla parete per facilitare la sospensione. Dopo aver lasciato riposare il campione sul ghiaccio per due minuti, trasferire la sospensione su un tubo Oak Ridge.Utilizzando l'omogeneizzatore all'impostazione di uno, omogeneizzare i nuclei in tampone di saccarosio basso per 15-30 secondi, mantenendo il campione sul ghiaccio. Quindi, utilizzare una pipetta sierologica per stratificazione di 12,5 millilitri di tampone di saccarosio a densità, sotto l'omogeneato tampone di saccarosio basso, facendo attenzione a non creare una bolla che interrompa gli strati di densità. Centrifugare i tubi a 3200 volte G, per 20 minuti a quattro gradi Celsius.Una volta completata la centrifugazione, decantare immediatamente il supernatante in un movimento di sfarfallio. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di rimuovere immediatamente il tubo oak ridge dalla centrifuga e decantare rapidamente il supernatante. Utilizzando 100 microlitri per un millilitro di soluzione di resuspensione, sospendiamo i nuclei rimanenti sulla parete.Evitare il cipiglio di mielina che rimane con la preparazione a base di detergente. La mancata zione rapida di questi passaggi può comportare una preparazione dei nuclei con detriti cellulari in eccesso, o mielina, che può impedire il sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo a valle. Filtrare i nuclei attraverso un colino di dimensioni dei pori da 30 a 35 micron e raccogliere in un tubo pre-refrigerato.Determinare la resa dei nuclei, usando un emocitometro per contare i nuclei sotto un obiettivo 10 x, prima di procedere al sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo, come descritto nel protocollo di testo. Il campo luminoso e le immagini epifluorescenti dei nuclei, isolati utilizzando il protocollo di lisi meccanica del detergente, sono mostrate a 10 x. Questi nuclei sono isolati in modo imparziale, consentendo lo studio dei profili di espressione genica endogena a livello di una singola cellula.Mostrato qui, è un grafico tSNE rappresentativo del sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo, da un midollo spinale lombare del topo, usando una piattaforma di incapsulamento delle goccioline massicciamente parallela. I nuclei isolati dal tessuto fresco o congelato possono essere utilizzati per il sequenziamento su piattaforme commerciali e accademiche. Questa tecnica consente ai ricercatori di esplorare i profili trascrittivi a livello di singola cellula, utilizzando tessuti difficili da dissociare, come il midollo spinale, o anche il tessuto congelato, come il materiale biobancario.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ridurre la quantità di tempo tra eutanasia elisi cellulare. Inoltre, è importante ridurre al minimo le bolle introdotte nelle soluzioni dalla lisi cellulare alla resopensione e acquistare nuclei animali domestici con cura. Seguendo questa procedura, i nuclei possono essere utilizzati per applicazioni alternative, come lo smistamento dei facs, al fine di isolare tipi di cellule specifici.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Ricerca

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