Name: isolation of adult spinal cord nuclei for massively parallel single-nucleus rna sequencing
Uploaded: 2018-10-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing at JoVE.com

この作品は、NINDS イントラミュラル プログラムによって支えられた (1 ZIA NS003153 02) と NIDCD (1 ZIA DC000059 18)。C. ケーテ原稿を確認して、テクニカル サポートと有用な議論の c. i. Dobrott L. 李を感謝いたします。

国立神経疾患と脳卒中動物ケアおよび使用委員会によって承認されたプロトコールに従ったすべての動物の仕事を行った。8 の間、男性と女性の ICR/CD-1 野生型マウスのサンプルを分散し、12 週古い、すべての実験に使用されました。マウスは、地域機関動物ケアおよび使用委員会ガイドラインに沿った処理必要があります。
1. 材料とバッファーの準備
<ol><li>すべてのバ...

<ol>
	<li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+experience-dependent+transcriptomic+states+in+the+mouse+visual+cortex.">Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).</li><li>Hu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+Cell-Type+Composition+and+Activity-Dependent+Transcriptional+State+in+Mammalian+Brains+by+Massively+Parallel+Single-Nucleus+RNA-Seq.">Dissecting Cell-Type Composition and Activity-Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq.</a> Molecular Cell. 68 (5), 1006-1015 (2017).</li><li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+Activated+Cell+Populations+Using+Single-Cell+RNA-Seq.">Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li><li>Sathyamurthy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+Parallel+Single+Nucleus+Transcriptional+Profiling+Defines+Spinal+Cord+Neurons+and+Their+Activity+during+Behavior.">Massively Parallel Single Nucleus Transcriptional Profiling Defines Spinal Cord Neurons and Their Activity during Behavior.</a> Cell Reports. 22 (8), 2216-2225 (2018).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell.">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).</li><li>Campbell, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+census+of+arcuate+hypothalamus+and+median+eminence+cell+types.">A molecular census of arcuate hypothalamus and median eminence cell types.</a> Nature Neuroscience. 20 (3), 484-496 (2017).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+Reveals+Hypothalamic+Cell+Diversity.">Single-Cell RNA-Seq Reveals Hypothalamic Cell Diversity.</a> Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).</li><li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-cell+RNA-seq+for+marker-free+decomposition+of+tissues+into+cell+types.">Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types.</a> Science. 343 (6172), 776-779 (2014).</li><li>Li, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatosensory+neuron+types+identified+by+high-coverage+single-cell+RNA-sequencing+and+functional+heterogeneity.">Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity.</a> Cell Research. 26 (8), 967 (2016).</li><li>Shin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+with+Waterfall+Reveals+Molecular+Cascades+underlying+Adult+Neurogenesis.">Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis.</a> Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics.">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).</li><li>Usoskin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+classification+of+sensory+neuron+types+by+large-scale+single-cell+RNA+sequencing.">Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing.</a> Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).</li><li>Villani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+new+types+of+human+blood+dendritic+cells,+monocytes,+and+progenitors.">Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors.</a> Science. 356 (6335), (2017).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+structure.+Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).</li><li>Lacar, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+RNA-seq+of+single+neurons+reveals+molecular+signatures+of+activation.">Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation.</a> Nature Communications. 7, 11022 (2016).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain.">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li><li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-sequencing+from+single+nuclei.">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li><li>Krishnaswami, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+single+nuclei+for+RNA-seq+to+capture+the+transcriptome+of+postmortem+neurons.">Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons.</a> Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).</li><li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+nuclei+isolation+from+human+postmortem+brain+tissue.">Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).</li><li>Bergmann, O., Jovinge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+cardiomyocyte+nuclei+from+post-mortem+tissue.">Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Nohara, K., Chen, Z., Yoo, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Filtration-based+Method+of+Preparing+High-quality+Nuclei+from+Cross-linked+Skeletal+Muscle+for+Chromatin+Immunoprecipitation.">A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).</li><li>Halder, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+changes+in+plasticity+genes+accompany+the+formation+and+maintenance+of+memory.">DNA methylation changes in plasticity genes accompany the formation and maintenance of memory.</a> Nature Neuroscience. 19 (1), 102-110 (2016).</li><li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-nucleus+RNA-seq+with+DroNc-seq.">Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq.</a> Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).</li><li>. Sample Preparation Demonstrated Protocols: Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing</a> (2018)</li><li>10X Genomics. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single Cell 3' Reagent Kits v2 User Guide. , (2018).</li><li>Fu, Y., Rusznak, Z., Herculano-Houzel, S., Watson, C., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+composition+characterizing+postnatal+development+and+maturation+of+the+mouse+brain+and+spinal+cord.">Cellular composition characterizing postnatal development and maturation of the mouse brain and spinal cord.</a> Brain Structure and Function. 218 (5), 1337-1354 (2013).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+strategy+for+single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+confirms+accuracy+in+predicted+cell-type+expression+from+nuclear+RNA.">A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6031 (2017).</li><li>Bakken, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equivalent+high-resolution+identification+of+neuronal+cell+types+with+single-nucleus+and+single-cell+RNA-sequencing.">Equivalent high-resolution identification of neuronal cell types with single-nucleus and single-cell RNA-sequencing.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Div-Seq:+Single-nucleus+RNA-Seq+reveals+dynamics+of+rare+adult+newborn+neurons.">Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons.</a> Science. 353 (6302), 925-928 (2016).</li></ol>

このプロトコルの究極の目標は、下流の転写解析のための高品質の RNA を含む核を分離することです。我々 は、すべての脊髄の細胞型をプロファイルするために snRNA Seq メソッドを適応しました。当初、ことが判明した典型的な細胞解離方法ない単一細胞 RNA シーケンス、効果的な脊髄神経が細胞死を特に受けやすい。さらに、細胞解離手法は 100 倍までいくつかによるさまざまな活動とスト?...

神経系は、形態学的、生化学的、および電気生理学的特性の多様な配列を表示するセルの異種グループで構成されます。一括 RNA シーケンスは、異なる条件下での遺伝子発現の組織全体にわたる変更を決める際に有用されている、単一細胞レベルでの転写の変化の検出ができなくなります。単一細胞の転写解析における最近の進歩は、異種細胞の機能グループ分子をレパートリーに基づく分類を有効にし、最近活躍していたニューロンのセットを検出にも利用できます。1,2,3,4過去 10 年間単一細胞 RNA シーケンス (Seq-scRNA) の開発が有効に細胞タイプの多様にビューを提供する個々 の細胞における遺伝子発現の研究。5
超並列 scRNA-Seq などの拡張性の高いアプローチの出現は、中枢神経系の多くの地域を含むシーケンス異種組織のプラットフォームを提供しています。6,7,8,9,10,11,12,13,14,15ただし、単一セル解離メソッドは、遺伝子発現の実験的変化と同様、細胞死につながることができます。16最近の作品は、内因性転写プロファイルの保存を有効にする 1 つのセルの配列方法を適応しています。1,3,4,17,18,19これらの戦略は、前初期遺伝子 (IEG) 発現次の感覚的な刺激や動作を検出するために特に適しています。3,4将来、この戦略も使える組織病気の状態やストレスへの応答のダイナミックな変化を検討します。これらのメソッドの核 RNA シーケンス (Seq snRNA) はストレスを誘発する細胞解離を伴わない、(脊髄) などの組織を分離することは困難として冷凍で使用できる有望なアプローチ組織。4,17,18,19核分離従来から適合、20,21,22,23,25 snRNA Seq 通常利用して急速な組織の混乱とセル細胞の残骸から核を分離、遠心分離、冷たい条件の下での換散。4核は下流の次世代シーケンシング複数マイクロ液滴のカプセル化プラットフォーム上の分離できます。4,7,24,25のこの方法はセルの何千もの転写活性のスナップショットの時点でできます。
分離とそれぞれ独自の長所と短所を持つシーケンスの前に細胞から核を解放するための戦略は複数あります。ここで、説明と下流の並列 snRNA Seq の大人の脊髄からの核の隔離を有効にする 2 つのプロトコルを比較: 洗剤機械換散および低張性機械換散。洗剤機械換散では、完全な組織破壊と核の高い最終的な利回りを提供しています。低張性機械溶解には量と最終的に核収量の純度のバランスを選択する機会を提供する組織破壊度制御できるにはが含まれます。これらのアプローチは匹敵する RNA の収穫、核および細胞型プロファイルごとの遺伝子の検出数を提供しも両方使用できます正常に snRNA シーケンスの

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15503-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES (pH = 8.0)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgAc</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1028-10X1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA (pH = 8.0)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-46034CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10197777001</td>
			<td>Add DTT just prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Crystalgen</td>
			<td>221-238-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl (pH = 7.4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T2194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>59222C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate-A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A12475-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Crystalgen</td>
			<td>221-133-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.04% BSA</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 U/&#956;L RNAse Inhibitor</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>30281-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oak Ridge Centrifuge Tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3118-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Tissue Dounce (2 ml)</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>885303-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass large clearance pestle</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>885301-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass small clearance pestle</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>885302-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3737001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispersing tool (S 10 N &#8211; 5G)</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3304000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers, 30 &#956;m</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>1000799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XTR Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75003698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterological Pipettes: 5 ml, 10 ml</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>EF16034F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemgenes Barcoding Beads</td>
			<td>Chemgenes</td>
			<td>Macosko-2011-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 &#956;m)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo Astrios Cell Sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B25982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>120262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#8217; Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>120267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish (60 x 15 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of adult spinal cord nuclei for massively parallel single-nucleus rna sequencing

個々 の細胞の遺伝子発現を調査セルの種類および細胞の同定ができます。単一細胞 RNA シーケンスは、中枢神経系など異種組織の特に細胞の転写プロファイルを勉強するための強力なツールとして浮上しています。ただし、セルを 1 つのシーケンスに必要な解離メソッドは、遺伝子発現と細胞死の実験的な変更につながることができます。さらに、これらのメソッドは、一般にアーカイブに関する研究とバイオ銀行材料が少なくて、新鮮な組織に制限されます。単一核 RNA シーケンス (Seq snRNA) は転写研究、それが正確に細胞の種類を識別する、冷凍または分離することは困難である組織の研究を許可を与えられた魅力的な代替され、解離による転写。ここでは、提案する下流 snRNA シーケンスの核の急速な隔離のための高スループット プロトコルこのメソッドでは、新鮮なまたは冷凍脊髄由来の核の隔離を有効にし、2 つの並列の液滴カプセル化プラットフォームと組み合わせることができます。

ここでは、下流の並列 RNA シーケンスの成体マウスの腰椎脊髄から核の分離を行った。プロトコルは 3 つの主要なコンポーネントを関与する: 組織混乱と細胞換散、均質化、およびショ糖密度遠心分離 (図 1)。秒以内に、洗剤機械換散は細胞およびティッシュの残骸 (図 2 a, 表 2) と同様に、核の数が多いと原油?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing at JoVE.com

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

ここでは、急速に下流の並列 RNA 配列のため新鮮なまたは冷凍組織から高品質の核を分離するためのプロトコルを提案する.我々 オプションを含める洗剤機械と低張性機械組織破壊とセル換散の核の隔離のどちらも使用できます。

並列の単核 RNA 配列のため大人の脊髄核の分離

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

単細胞RNAシーケンシングは、細胞の転写プロファイル、特に中枢神経系などの異種組織を研究するための強力なツールです。このプロトコルは、単核RNAシーケンシング用の核を単離する方法を提供する。細胞の代わりに核を用いることで、この方法は、凍結組織だけでなく、解解化が困難な組織に適用することができる。さらに、この方法は、疾患または傷害後の細胞における細胞型特異的変化を研究するために適用することができる。テキスト プロトコルで説明されているように、マウス安楽死でこの手順を開始します。次に、体の長さに沿って切開を行い、内臓を露出させる。鉗子を使用して体腔から内臓を引っ張ることによって、マウスを回避する。汚れが生じる可能性があるため、ペーパータオルを使用してエリアを清掃したり、臓器を取り除いたりしないでください。はさみを使用して、L2とL3脊椎間の椎骨柱を切断します。脊髄を取り出すには、25ゲージ1/4インチの針で氷冷PBSを含む3ミリリットルの注射器を取り付けます。針の先端を脊椎柱の仙骨端に入れる。2本の指を使って椎骨をつまんで針の先端にタイトなシールを作成し、プランジャーを押して脊髄をロストリーで排出します。氷冷PBSのペトリ皿に脊髄を入れます。コードの腰部のみが必要な場合は、脊髄の仙骨部と胸部を切り取ってください。この時点で、組織を凍結し、マイナス80°Cで保存するか、またはここで説明するように洗剤機械的細胞のリシス、またはテキストプロトコルに記載されているように低張力機械的なライシスのいずれかにすぐに使用する。洗剤の機械的細胞のリシスを決定するには、腰椎を冷やされたDounceホモジナイザーに入れ、500マイクロリットルの冷やされた洗剤リシスバッファーを加えます。緩い害虫の5ストローク、A、そしてタイトな害虫の5〜10ストロークでダウンス、B.ストロークの間に溶解溶液の外側のホモジナイザーを持ち上げることを避け、気泡を導入することを避けてください。さて、40ミクロンのストレーナーを冷やした50ミリリットルの円錐管の上に置き、低いショ糖緩衝液の1ミリリットルで予め濡らします。粗核を含むDounceホモジナイザーに低いショ糖バッファーを1ミリリットル加え、2~3回ピペットで軽く混ぜます。40ミクロンのストレーナーの上に粗核の準備を渡し、事前に冷やした50ミリリットルの円錐形チューブに入れられます。40ミクロンのストレーナーの上に追加の1ミリリットルの低スクロースバッファーを渡し、最終体積を低スクロースバッファーの3ミリリットルと500マイクロリットルのリシスバッファーに持ち込みます。複数のコードを組み合わせて、同じ円錐形のチューブで冷却する場合は、これらの手順を繰り返します。次いで、試料を摂氏4度で10分間Gの3200倍に遠心する。遠心分離が完了したら、上清をデカントします。我々は、低いショ糖バッファーの3ミリリットルを使用してパレットを中断します。壁からペレットを取り除くように静かに旋回し、再懸濁を容易にします。サンプルを氷の上に2分間置いた後、サスペンションをオークリッジチューブに移します。1の設定でホモジナイザーを使用して、低ショ糖バッファー内の核を15〜30秒間均質化し、サンプルを氷の上に保ちます。次に、血清ピペットを使用して12.5ミリリットルの密度スクロースバッファーを層し、低ショ糖バッファーホモジネートの下に、密度層を破壊する気泡を作り出さないので注意する。チューブをGの3200倍、摂氏4度で20分間遠心分離する。遠心分離が完了したら、すぐにフリックモーションで上清をデカントします。この手順を試みる間、直ちに遠心分離機からオークリッジチューブを取り外し、上清を素早くデカントすることを忘れないでください。100マイクロリットルから1ミリリットルの再懸濁液を用いて、壁に残っている核を懸濁させる。洗剤ベースの準備に残っているミエリンの眉をひそめないようにしてください。これらのステップを迅速に行わないと、過剰な細胞破片、またはミエリンを含む核調製が行われ、下流の単核RNAシーケンシングを妨げる可能性があります。30〜35ミクロンの孔サイズストレーナーを介して核をフィルタリングし、事前に冷却されたチューブに収集します。テキストプロトコルに記載されているように、単核RNAシーケンシングに進む前に、ヘモサイトメーターを使用して10 xの目的の下で核を数え、核収率を決定する。核の明るいフィールドおよび蛍光画像は、洗剤機械的なリシスプロトコルを用いて単離され、10xで示される。これらの核は、単一細胞のレベルで内因性遺伝子発現プロファイルの研究を可能にする、公平な方法で単離される。ここに示されている、単核RNAシーケンシングの代表的なtSNEプロットは、マウス腰椎脊髄から、大規模に平行な液滴カプセル化プラットフォームを用いた。新鮮な組織または凍結組織から単離された核は、商業的および学術的なプラットフォームの両方でシーケンシングに使用することができます。この技術により、研究者は、脊髄などの解解化が困難な組織、あるいはバイオバンク材料などの凍結組織を使用して、単一細胞レベルで転写プロファイルを探索することができます。この手順を試みる間, 安楽死と細胞のリシスの間の時間の量を減らすことが重要です..さらに、細胞のリシスから再懸濁液に導入される気泡を最小限に抑え、ペットの核を注意して購入することが重要です。この手順に従って、核は、特定の細胞タイプを分離するために、ファックソートなどの代替用途に使用することができる。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

脊髄電気生理学II：細胞外吸引電極の作製

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

レーザー捕捉マイクロ解離によるマウス脊髄運動ニューロン細胞体からの転写解析のためのRNAの生成

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

エレクトロポひよこ胚脊髄における遺伝子発現差のRNA-配列解析

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

成体マウスの脊髄組織からの初代混合グリア培養の調製

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

げっ歯類での後根神経節の脊髄および単離の油圧押出

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

新生児マウスからの脊髄ニューロンの単離と培養

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

ディープシングルセルRNAシーケンシングのための1つの成人マウス脳半球からの領域特異的ミクログリアの分離

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

ラットおよびマウス脳への神経幹細胞の動脈内デリバリー:脳虚血への応用

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Induction of Complete Transection-Type Spinal Cord Injury in Mice

マウスにおける完全なトランセクション型脊髄損傷の誘導

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, ...

A Minimally Invasive, Fast Spinal Cord Lateral Hemisection Technique for Modeling Open Spinal Cord Injuries in Rats

Open spinal cord injury techniques modeling laceration-like injuries are time-consuming and invasive because they involve laminectomy. This new technique ...