Name: isolation of adult spinal cord nuclei for massively parallel single-nucleus rna sequencing
Uploaded: 2018-10-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing at JoVE.com

이 작품은 NINDS 교내 프로그램에 의해 지원 되었다 (1 지아 NS003153 02) 및 NIDCD (1 지아 DC000059 18). 우리는 L. 리 및 그들의 기술 지원 및 유용한 토론, C.I. Dobrott C. Kathe 원고를 검토 하기 위한 감사 합니다.

모든 동물 일 신경 성 질환의 국가 학회 및 치기 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 수행 되었다. 샘플은 남성과 여성의 ICR/CD-1 야생-타입 마우스, 8 사이 균형 그리고 12 주 오래 된, 모든 실험을 위해 사용 되었다. 마우스 로컬 기관 동물 관리 및 사용 위원회 지침에 따라 처리 되어야 합니다.
1입니다. 준비 재료 및 버퍼의
<ol><li>모든 버퍼 사용의 날?...

<ol>
	<li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+experience-dependent+transcriptomic+states+in+the+mouse+visual+cortex.">Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).</li><li>Hu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+Cell-Type+Composition+and+Activity-Dependent+Transcriptional+State+in+Mammalian+Brains+by+Massively+Parallel+Single-Nucleus+RNA-Seq.">Dissecting Cell-Type Composition and Activity-Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq.</a> Molecular Cell. 68 (5), 1006-1015 (2017).</li><li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+Activated+Cell+Populations+Using+Single-Cell+RNA-Seq.">Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li><li>Sathyamurthy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+Parallel+Single+Nucleus+Transcriptional+Profiling+Defines+Spinal+Cord+Neurons+and+Their+Activity+during+Behavior.">Massively Parallel Single Nucleus Transcriptional Profiling Defines Spinal Cord Neurons and Their Activity during Behavior.</a> Cell Reports. 22 (8), 2216-2225 (2018).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell.">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).</li><li>Campbell, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+census+of+arcuate+hypothalamus+and+median+eminence+cell+types.">A molecular census of arcuate hypothalamus and median eminence cell types.</a> Nature Neuroscience. 20 (3), 484-496 (2017).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+Reveals+Hypothalamic+Cell+Diversity.">Single-Cell RNA-Seq Reveals Hypothalamic Cell Diversity.</a> Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).</li><li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-cell+RNA-seq+for+marker-free+decomposition+of+tissues+into+cell+types.">Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types.</a> Science. 343 (6172), 776-779 (2014).</li><li>Li, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatosensory+neuron+types+identified+by+high-coverage+single-cell+RNA-sequencing+and+functional+heterogeneity.">Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity.</a> Cell Research. 26 (8), 967 (2016).</li><li>Shin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+with+Waterfall+Reveals+Molecular+Cascades+underlying+Adult+Neurogenesis.">Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis.</a> Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics.">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).</li><li>Usoskin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+classification+of+sensory+neuron+types+by+large-scale+single-cell+RNA+sequencing.">Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing.</a> Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).</li><li>Villani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+new+types+of+human+blood+dendritic+cells,+monocytes,+and+progenitors.">Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors.</a> Science. 356 (6335), (2017).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+structure.+Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).</li><li>Lacar, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+RNA-seq+of+single+neurons+reveals+molecular+signatures+of+activation.">Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation.</a> Nature Communications. 7, 11022 (2016).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain.">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li><li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-sequencing+from+single+nuclei.">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li><li>Krishnaswami, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+single+nuclei+for+RNA-seq+to+capture+the+transcriptome+of+postmortem+neurons.">Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons.</a> Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).</li><li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+nuclei+isolation+from+human+postmortem+brain+tissue.">Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).</li><li>Bergmann, O., Jovinge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+cardiomyocyte+nuclei+from+post-mortem+tissue.">Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Nohara, K., Chen, Z., Yoo, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Filtration-based+Method+of+Preparing+High-quality+Nuclei+from+Cross-linked+Skeletal+Muscle+for+Chromatin+Immunoprecipitation.">A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).</li><li>Halder, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+changes+in+plasticity+genes+accompany+the+formation+and+maintenance+of+memory.">DNA methylation changes in plasticity genes accompany the formation and maintenance of memory.</a> Nature Neuroscience. 19 (1), 102-110 (2016).</li><li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-nucleus+RNA-seq+with+DroNc-seq.">Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq.</a> Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).</li><li>. Sample Preparation Demonstrated Protocols: Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing</a> (2018)</li><li>10X Genomics. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single Cell 3' Reagent Kits v2 User Guide. , (2018).</li><li>Fu, Y., Rusznak, Z., Herculano-Houzel, S., Watson, C., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+composition+characterizing+postnatal+development+and+maturation+of+the+mouse+brain+and+spinal+cord.">Cellular composition characterizing postnatal development and maturation of the mouse brain and spinal cord.</a> Brain Structure and Function. 218 (5), 1337-1354 (2013).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+strategy+for+single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+confirms+accuracy+in+predicted+cell-type+expression+from+nuclear+RNA.">A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6031 (2017).</li><li>Bakken, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equivalent+high-resolution+identification+of+neuronal+cell+types+with+single-nucleus+and+single-cell+RNA-sequencing.">Equivalent high-resolution identification of neuronal cell types with single-nucleus and single-cell RNA-sequencing.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Div-Seq:+Single-nucleus+RNA-Seq+reveals+dynamics+of+rare+adult+newborn+neurons.">Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons.</a> Science. 353 (6302), 925-928 (2016).</li></ol>

이 프로토콜의 궁극적인 목표는 다운스트림 transcriptional 분석에 대 한 높은-품질 RNA를 포함 하는 핵을 분리 하는. 우리는 모든 척수에서 세포 유형의 프로필 위해 snRNA-Seq 방법 적응. 처음에, 우리는 전형적인 세포 분리 방법 효과 없었다 단일 셀 RNA 시퀀싱, 척수 신경은 세포 죽음에 특히 취약 발견. 또한, 세포 분리 방법 hundred-fold 몇몇까지 여 다양 한 활동 및 스트레스 반응 유전자의 표정을 유도. <...

신 경계는 다양 한 형태학, 생화학, 및 electrophysiological 속성을 표시 하는 셀의 이기종 그룹의 구성 됩니다. 대량 RNA 시퀀싱은 다른 조건 하에서 유전자 발현에서 조직 전체의 변화를 결정 하는 데 유용한 동안, 단일 세포 수준에서 transcriptional 변화의 감지를 걸로 하겠습니다. 단일 셀 transcriptional 분석의 최근 발전 기능적인 그룹 분자 그들의 레 퍼 토리를 기반으로 이기종 세포의 분류를 가능 하 게 하 고 했다 최근에 활성화 된 뉴런의 집합을 검색 하는 데도 수 있습니다. 1 , 2 , 3 , 4 지난 10 년 동안, 단일 셀 RNA 시퀀싱 (scRNA-Seq)의 개발은 개별 셀, 셀 형 다양성으로 볼의 유전자 발현의 연구 활성화. 5
대규모 병렬 scRNA-Seq, 같은 확장 가능한 접근의 출현 순서 이질적인 조직, 중앙 신경 시스템의 많은 영역을 포함 한 플랫폼을 제공 하고있다. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 그러나 15 , 단일 세포 분리 방법 세포 죽음 뿐만 아니라 유전자 발현 실험 변경 발생할 수 있습니다. 16 최근 작품 내 생 transcriptional 프로필의 보존 수 있도록 단일 셀 시퀀싱 방법 적응 했다. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 이러한 전략 즉시 이른 유전자 (IEG) 식 다음 감각 자극 또는 동작을 감지 하는 데 특히 적합 했습니다. 3 , 4 미래에,이 전략 또한 사용 될 수 조직 질병 상태 또는 스트레스에 대 한 응답에서 동적인 변화를 공부 하. 이러한 메서드의 단일 핵 RNA 시퀀싱 (snRNA-Seq) 스트레스 유도 세포 분리를 포함 하지 않는 및 (척수), 같은 조직 분리 하기 어려운 뿐만 아니라 냉동에 사용할 수 있습니다 유망 접근은 조직. 4 , 17 , 18 , 19 이전 핵 격리 방법에서 적응,20,,2122,23,25 snRNA-Seq 일반적으로 활용 하 여 신속한 조직 장애 및 셀 차가운 조건, 원심 분리, 및 세포에서 핵의 분리에서 세포. 4 핵 여러 미세 물방울 캡슐화 플랫폼에서 다운스트림 차세대 시퀀싱에 대 한 격리 수 있습니다. 4 , 7 , 24 , 25 이 메서드는 시간에 순간에 세포의 수천의 transcriptional 활동 현황에 대 한 수 있습니다.
절연 및 시퀀싱, 각각 그들의 자신의 이점 및 불리 하기 전에 세포에서 핵을 방출 하기 위한 여러 전략을 확인 하 고 있습니다. 여기, 우리가 설명 및 다운스트림 대규모 병렬 snRNA-Seq에 대 한 성인 척수에서 핵의 격리 수 있도록 두 개의 프로토콜 비교: 세제 기계 세포 및 소형 기계 세포. 세제-기계 세포 완전 한 조직 장애 및 핵의 높은 최종 수익률을 제공합니다. 소형 기계-세포 조직 장애, 수량 및 최종 핵 수확량의 순도 사이의 균형을 선택 하기 위한 기회를 제공의 제어도 포함 되어 있습니다. 이러한 접근 비교 RNA 수확량, 핵, 그리고 셀 형 프로 파일링 당 유전자의 감지 된 숫자를 제공 하 고 또한 둘 다에 사용할 수 있습니다 성공적으로 snRNA-이

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15503-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES (pH = 8.0)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgAc</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1028-10X1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA (pH = 8.0)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-46034CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10197777001</td>
			<td>Add DTT just prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Crystalgen</td>
			<td>221-238-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl (pH = 7.4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T2194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>59222C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate-A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A12475-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Crystalgen</td>
			<td>221-133-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.04% BSA</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 U/&#956;L RNAse Inhibitor</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>30281-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oak Ridge Centrifuge Tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3118-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Tissue Dounce (2 ml)</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>885303-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass large clearance pestle</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>885301-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass small clearance pestle</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>885302-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3737001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispersing tool (S 10 N &#8211; 5G)</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3304000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers, 30 &#956;m</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>1000799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XTR Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75003698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterological Pipettes: 5 ml, 10 ml</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>EF16034F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemgenes Barcoding Beads</td>
			<td>Chemgenes</td>
			<td>Macosko-2011-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 &#956;m)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo Astrios Cell Sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B25982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>120262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#8217; Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>120267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish (60 x 15 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of adult spinal cord nuclei for massively parallel single-nucleus rna sequencing

개별 셀의 유전자 발현 프로 빙 셀 유형과 셀 상태 식별 수 있습니다. 단일 셀 RNA 시퀀싱 transcriptional 프로필 셀, 특히 중추 신 경계와 같은 다른 유형의 조직에서에서의 공부에 대 한 강력한 도구로 떠오르고 있다. 그러나, 분리 방법 단일 셀 시퀀싱에 필요한 실험 변경 유전자 표현과 세포 죽음에 발생할 수 있습니다. 또한, 이러한 방법을 따라서 보관에 대 한 연구 및 바이오-은행 소재를 제한 하는 신선한 조직에 일반적으로 제한 됩니다. 단일 핵 RNA 시퀀싱 (snRNA-Seq)는 그것은 정확 하 게 세포 유형 식별, 냉동 또는 해리, 어려운 조직의 연구 주어진 transcriptional 연구에 대 한 매력적인 대안 이다 분리 유발 감소 전사입니다. 여기, 선물이 다운스트림 snRNA-이 대 한 핵의 신속한 격리에 대 한 높은 처리 프로토콜 이 메서드는 신선 또는 냉동 척수 샘플에서 핵의 분리를 가능 하 게 하 고 두 대규모 병렬 드롭릿 캡슐화 플랫폼 결합 될 수 있다.

여기, 우리는 다운스트림 대규모 병렬 RNA 시퀀싱 성인 마우스 요 추 척수에서 핵의 격리를 수행합니다. 프로토콜 관련 세 가지 주요 구성 요소: 조직 장애 및 세포 세포의 용 해, 균질, 고 자당 밀도 원심 분리 (그림 1). 초 이내에, 세제 기계 세포 세포와 조직 파편 (그림 2A표 2) 핵의 많은 수와 원유 핵 준비 나왔고. 15 ...

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Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

여기, 선물이 빠르게 다운스트림 대규모 병렬 RNA 시퀀싱 신선 또는 냉동 조직에서 높은-품질 핵을 분리 하는 프로토콜. 우리는 세제-기계 및 소형 기계 조직 장애 및 셀 세포 옵션을 둘 다 핵의 격리에 대 한 사용할 수 있습니다를 포함 합니다.

대규모 병렬 단일 핵 RNA 시퀀싱에 대 한 성인 척수 핵의 절연

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

단세포 RNA 시퀀싱은 특히 중추 신경계와 같은 이질조직에서 세포의 전사 프로파일을 연구하기 위한 강력한 도구입니다. 이 프로토콜은 단일 핵 RNA 염기서열분석용 핵을 격리하는 방법을 제공한다. 세포 대신 핵을 사용하여, 이 방법은 동결된 조직뿐만 아니라, 하기 어려운 조직에 적용될 수 있습니다.더욱이, 이 방법은 질병 또는 상해 다음 세포에 있는 세포 모형 특이적 변경을 연구하기 위하여 적용될 수 있다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 마우스 안락사로 이 절차를 시작합니다. 다음으로, 내부 장기를 노출하기 위해 신체의 길이를 따라 절개를합니다.집게를 사용하여 신체 구멍에서 내부 장기를 당겨 마우스를 eviscerate. 이 오염 물질을 도입 할 수 있기 때문에, 지역을 청소하거나 장기를 제거하기 위해 종이 타월을 사용하지 마십시오. 가위를 사용하여 L2와 L3 척추 척추 사이의 척추 컬럼을 잘라냅니다.척수를 배출하려면 25 게이지 1/4 인치 바늘로 얼음 차가운 PBS가 들어있는 3 밀리리터 주사기를 착용하십시오. 바늘 끝을 척추 기둥의 성추끝에 놓습니다. 두 손가락을 사용하여 척추를 꼬집어 바늘 끝 주위에 단단한 씰을 만들고 플런저를 눌러 척수를 roste없이 배출합니다.추한 PBS를 곁들인 페트리 접시에 척수를 놓습니다. 코드의 요추 부분만 필요한 경우 척수의 성추와 흉부 부분을 다듬습니다. 이 시점에서, 조직을 동결하고 영하 80도에서 저장하거나, 여기에 설명된 바와 같이 세제 기계식 세포 용해 또는 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 저혈압 기계적 용해에 즉시 사용한다.세제 기계식 세포 용액을 결정하기 위해 요추 척수를 미리 냉각된 둔균질제에 넣고 500마이크로리터의 미리 냉장 된 세제 용액 버퍼를 추가하십시오. 느슨한 유봉의 5 스트로크로 두드리고, A, 그리고 5 ~ 10 스트로크의 단단한 유봉, B.피하기 뇌졸중 사이에 용액의 외부 균질화제를 들어 올리고, 거품을 도입하지 마십시오. 이제 40미크론 스트레이너를 미리 냉각된 50밀리리터 원뿔 튜브 위에 놓고 저당 버퍼 1밀리리터로 미리 젖습니다.리시스 버퍼에 원유 핵을 함유한 Dounce 균질화제에 저자산완충제 1밀리리터를 넣고 2~3회 배로 하여 부드럽게 섞는다. 40 미크로른 여과기를 통해 조핵 준비를 미리 냉각된 50 밀리리터 원추형 튜브에 전달합니다. 40 미크론 스트레이너 위에 1밀리리터 저자당 버퍼를 추가로 전달하여 최종 부피를 저자산 완충제의 3밀리리터와 500 마이크로리터의 용액 버퍼에 전달합니다.여러 코드를 결합하고 동일한 원전 튜브에서 냉각하는 경우 이러한 단계를 반복합니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 4도에서 10분 동안 3200회 G로 원심분리합니다. 원심분리가 완료되면 상체를 감소시다.우리는 낮은 자당 버퍼의 세 밀리리터를 사용하여 팔레트를 일시 중단합니다. 부드럽게 소용돌이하여 벽에서 펠릿을 제거하여 재서스펜션을 용이하게 합니다. 샘플을 2분 동안 얼음 위에 앉은 후 서스펜션을 오크 리지 튜브로 옮기습니다.균질화제를 사용하여 15~30초 동안 저당버퍼에서 핵을 균질화하여 얼음 위에 샘플을 유지합니다. 그런 다음, 밀도 자당 버퍼의 12.5 밀리리터를 층으로 서학적 파이펫을 사용, 낮은 자당 버퍼 homogenate 아래, 밀도 층을 방해 거품을 만들지 않도록주의. 3200회 G의 튜브를 원심분리하여 섭씨 4도에서 20분 동안 원심분리합니다.원심분리가 완료되면 즉시 상체를 깜박이는 동작으로 디게팅합니다. 이 절차를 시도하는 동안, 즉시 원심분리기에서 오크 리지 튜브를 제거하고 신속하게 상퍼를 데칭하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 100 마이크로리터를 1밀리리터에 사용하여 정지용 용액을 사용하여 벽에 남아 있는 핵을 중단합니다.세제 기반 준비로 남아있는 myelin 찡그린 얼굴을 피하십시오. 이러한 단계를 신속하게 수행하지 못하면 다운스트림 단일 핵 RNA 시퀀싱을 방해할 수 있는 과도한 세포 이물질 또는 myelin을 사용하여 핵 을 준비할 수 있습니다. 30 내지 35 미크론 모공 크기의 여과기를 통해 핵을 걸러내고 미리 차가운 튜브에서 수집합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 단일 핵 RNA 시퀀싱을 진행하기 전에 혈류계를 사용하여 10 x 목표하에서 핵을 계산하는 핵 수율을 결정한다. 세제 기계적 용해 프로토콜을 사용하여 분리된 핵의 밝은 필드 및 상피성 이미지는 10 x로 도시된다. 이러한 핵은 편견없는 방식으로 분리되어 단일 세포의 수준에서 내인성 유전자 발현 프로파일의 연구를 허용합니다.여기에 도시된, 마우스 요추 척수로부터, 대규모 병렬 액적 캡슐화 플랫폼을 사용하여 단일 핵 RNA 시퀀싱의 대표적인 tSNE 플롯이다. 신선하거나 냉동 된 조직에서 분리 된 핵은 상업 및 학술 플랫폼 모두에서 시퀀싱에 사용할 수 있습니다. 이 기술은 연구원이 척수와 같은 어려운 조직을 사용하여 단세포 수준에서 전사 프로파일을 탐구할 수 있게 합니다, 또는 biobank 물질과 같은 동결된 조직조차.이 절차를 시도하는 동안, 안락사와 세포 리시스 사이의 시간을 줄이는 것이 중요합니다. 또한 세포 리시스에서 재발에 이르는 솔루션에 도입된 거품을 최소화하고 조심스럽게 애완 동물 핵을 구입하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 핵은 특정 세포 유형을 격리하기 위해 팩 선별과 같은 대체 응용 분야에 사용될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

척수 전기 생리학 II : 세포 흡입 전극 제작

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

연구

신경과학

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

레이저 포획 미세 절에 의해 마우스 척수 모터 신경 세포 체에서 전사 분석을위한 RNA의 생산

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

electroporation하여 병아리 배아 척수에서 차동 유전자 발현의 RNA-SEQ 분석

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

성인 마우스 척수 조직에서 차 혼합 폐해 문화의 준비

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

설치류의 등쪽 뿌리 신경절의 척수 및 절연의 유압 압출

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

신생아 생쥐의 척수 신경 세포 분리 및 배양

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

깊은 단세포 RNA 염기서열 분석에 대한 하나의 성인 마우스 뇌 반구에서 영역 별 Microglia의 격리

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

쥐와 마우스 두뇌에 신경 줄기 세포의 동맥 내 납품: 대뇌 허혈에 응용 프로그램

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Induction of Complete Transection-Type Spinal Cord Injury in Mice

마우스에서 완전한 Transection 형 척수 손상의 유도

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, ...

A Minimally Invasive, Fast Spinal Cord Lateral Hemisection Technique for Modeling Open Spinal Cord Injuries in Rats

Open spinal cord injury techniques modeling laceration-like injuries are time-consuming and invasive because they involve laminectomy. This new technique ...