Name: isolation of adult spinal cord nuclei for massively parallel single-nucleus rna sequencing
Uploaded: 2018-10-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av intramural programmet av NINDS (1 ZIA NS003153 02) og NIDCD (1 ZIA DC000059 18). Vi takker L. Li og bakgrunnsstøyreduksjon Dobrott for kundestøtte og nyttig diskusjoner og C. Kathe for gjennomgang manuskriptet.

Alle dyr arbeidet ble utført i henhold til en protokoll som er godkjent av National Institute av nevrologiske lidelser og hjerneslag Animal Care og bruk komiteen. Balansert prøver av mannlige og kvinnelige ICR/CD-1 vill-type mus, mellom 8 og 12 uker gamle, ble brukt til alle eksperimentene. Mus skal håndteres i henhold til lokale institusjonelle Animal Care og bruk komiteen retningslinjer.
1. forberedelse av materialer og buffere
<ol><li>Forberede alle buffere dagen bruk og pre chill på ...

<ol>
	<li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+experience-dependent+transcriptomic+states+in+the+mouse+visual+cortex.">Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).</li><li>Hu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+Cell-Type+Composition+and+Activity-Dependent+Transcriptional+State+in+Mammalian+Brains+by+Massively+Parallel+Single-Nucleus+RNA-Seq.">Dissecting Cell-Type Composition and Activity-Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq.</a> Molecular Cell. 68 (5), 1006-1015 (2017).</li><li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+Activated+Cell+Populations+Using+Single-Cell+RNA-Seq.">Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li><li>Sathyamurthy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+Parallel+Single+Nucleus+Transcriptional+Profiling+Defines+Spinal+Cord+Neurons+and+Their+Activity+during+Behavior.">Massively Parallel Single Nucleus Transcriptional Profiling Defines Spinal Cord Neurons and Their Activity during Behavior.</a> Cell Reports. 22 (8), 2216-2225 (2018).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell.">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).</li><li>Campbell, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+census+of+arcuate+hypothalamus+and+median+eminence+cell+types.">A molecular census of arcuate hypothalamus and median eminence cell types.</a> Nature Neuroscience. 20 (3), 484-496 (2017).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+Reveals+Hypothalamic+Cell+Diversity.">Single-Cell RNA-Seq Reveals Hypothalamic Cell Diversity.</a> Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).</li><li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-cell+RNA-seq+for+marker-free+decomposition+of+tissues+into+cell+types.">Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types.</a> Science. 343 (6172), 776-779 (2014).</li><li>Li, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatosensory+neuron+types+identified+by+high-coverage+single-cell+RNA-sequencing+and+functional+heterogeneity.">Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity.</a> Cell Research. 26 (8), 967 (2016).</li><li>Shin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+with+Waterfall+Reveals+Molecular+Cascades+underlying+Adult+Neurogenesis.">Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis.</a> Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics.">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).</li><li>Usoskin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+classification+of+sensory+neuron+types+by+large-scale+single-cell+RNA+sequencing.">Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing.</a> Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).</li><li>Villani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+new+types+of+human+blood+dendritic+cells,+monocytes,+and+progenitors.">Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors.</a> Science. 356 (6335), (2017).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+structure.+Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).</li><li>Lacar, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+RNA-seq+of+single+neurons+reveals+molecular+signatures+of+activation.">Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation.</a> Nature Communications. 7, 11022 (2016).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain.">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li><li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-sequencing+from+single+nuclei.">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li><li>Krishnaswami, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+single+nuclei+for+RNA-seq+to+capture+the+transcriptome+of+postmortem+neurons.">Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons.</a> Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).</li><li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+nuclei+isolation+from+human+postmortem+brain+tissue.">Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).</li><li>Bergmann, O., Jovinge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+cardiomyocyte+nuclei+from+post-mortem+tissue.">Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Nohara, K., Chen, Z., Yoo, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Filtration-based+Method+of+Preparing+High-quality+Nuclei+from+Cross-linked+Skeletal+Muscle+for+Chromatin+Immunoprecipitation.">A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).</li><li>Halder, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+changes+in+plasticity+genes+accompany+the+formation+and+maintenance+of+memory.">DNA methylation changes in plasticity genes accompany the formation and maintenance of memory.</a> Nature Neuroscience. 19 (1), 102-110 (2016).</li><li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-nucleus+RNA-seq+with+DroNc-seq.">Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq.</a> Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).</li><li>. Sample Preparation Demonstrated Protocols: Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing</a> (2018)</li><li>10X Genomics. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single Cell 3' Reagent Kits v2 User Guide. , (2018).</li><li>Fu, Y., Rusznak, Z., Herculano-Houzel, S., Watson, C., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+composition+characterizing+postnatal+development+and+maturation+of+the+mouse+brain+and+spinal+cord.">Cellular composition characterizing postnatal development and maturation of the mouse brain and spinal cord.</a> Brain Structure and Function. 218 (5), 1337-1354 (2013).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+strategy+for+single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+confirms+accuracy+in+predicted+cell-type+expression+from+nuclear+RNA.">A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6031 (2017).</li><li>Bakken, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equivalent+high-resolution+identification+of+neuronal+cell+types+with+single-nucleus+and+single-cell+RNA-sequencing.">Equivalent high-resolution identification of neuronal cell types with single-nucleus and single-cell RNA-sequencing.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Div-Seq:+Single-nucleus+RNA-Seq+reveals+dynamics+of+rare+adult+newborn+neurons.">Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons.</a> Science. 353 (6302), 925-928 (2016).</li></ol>

Det endelige målet med denne protokollen er å isolere kjerner som inneholder høykvalitets RNA for nedstrøms transcriptional analyse. Vi tilpasset snRNA-Seq metoder for å profilere alle celletyper i ryggmargen. Først fant vi at typisk celle dissosiasjon metoder var ineffektivt for enkeltcelle RNA sekvensering, som ryggmargen neurons er spesielt utsatt for celledød. Videre induserer celle dissosiasjon metoder uttrykk for ulike aktivitet - og stressrespons gener av opptil flere hundred-fold. 3...

Nervesystemet består av heterogene grupper av celler som viser et variert utvalg av morfologiske, biokjemiske og elektrofysiologiske. Mens den bulk RNA sekvensering har vært nyttig for å bestemme vev-omfattende endringer i genuttrykk under ulike forhold, utelukker det gjenkjenning av transcriptional endringer på encellede nivå. Nylige fremskritt innen én celle transcriptional analysen har aktivert klassifiseringen av heterogene celler i funksjonelle grupper basert på repertoaret molekylære og kan selv bli leveraged for å oppdage sett med nevroner som hadde vært nylig aktiv. 1 , 2 , 3 , 4 de siste ti årene, utviklingen av enkeltcelle RNA sekvensering (scRNA-Seq) har aktivert studiet av genuttrykk i enkeltceller gir en oversikt over celle-type mangfold. 5
Fremveksten av skalerbare tilnærminger som massivt parallell scRNA-Seq, har gitt plattformer sekvens heterogen vev, inkludert mange områder av det sentrale nervesystemet. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 men enkeltcelle dissosiasjon metoder kan føre til celledød samt eksperimentelle endringer i genuttrykk. 16 nyere arbeid er tilpasset enkeltcelle sekvensering metoder for å aktivere bevaring av endogene transcriptional profiler. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 disse strategiene er spesielt egnet for å avdekke umiddelbar tidlig (IEG) genuttrykk etter sensoriske stimulans eller atferd. 3 , 4 i fremtiden, denne strategien kan også brukes til å studere dynamiske endringer i vev i sykdomstilstander eller som svar på stress. Disse metodene enkelt kjernen RNA sekvensering (snRNA-Seq) er en lovende metode som ikke involverer stress-inducing celle dissosiasjon og kan brukes på vanskelig å distansere vev (som ryggmargen), samt frosne vev. 4 , 17 , 18 , 19 tilpasset fra atomkjerner isolasjon metodene,20,21,22,23,25 snRNA-Seq vanligvis benytter rask vev avbrudd og celle lysis under kalde forhold, sentrifugering og separasjon av kjerner fra mobilnettet rusk. 4 kjerner kan være isolert for den nedstrøms neste generasjons sekvensering på flere microfluidic slippverktøy innkapsling plattformer. 4 , 7 , 24 , 25 denne metoden gir et øyeblikksbilde av transcriptional aktivitet av celler på et tidspunkt.
Det er flere strategier for å slippe kjerner fra celler før isolasjon og sekvensering, hver med sine egne fordeler og ulemper. Her beskriver vi og sammenligne to protokoller for å aktivere isolering av kjerner fra voksen ryggmargen for den nedstrøms massivt parallelle snRNA-Seq: vaskemiddel mekaniske lyse og hypotonisk mekaniske lysis. Vaskemiddel mekaniske lysis gir komplett vev avbrudd og en høyere siste avkastning av kjerner. Hypotonisk mekanisk-lysis inkluderer en kontrollerbar grad av vev avbrudd, gir en mulighet for å velge en balanse mellom antallet og renhet av den endelige kjernefysiske Sprengkraften. Disse gir sammenlignbare RNA avkastning, oppdaget antall gener per kjerne og celle-type profilering og også begge kan brukes med hell for snRNA-Seq.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15503-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES (pH = 8.0)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgAc</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1028-10X1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA (pH = 8.0)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-46034CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10197777001</td>
			<td>Add DTT just prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Crystalgen</td>
			<td>221-238-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl (pH = 7.4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T2194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>59222C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate-A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A12475-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Crystalgen</td>
			<td>221-133-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.04% BSA</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 U/&#956;L RNAse Inhibitor</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>30281-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oak Ridge Centrifuge Tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3118-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Tissue Dounce (2 ml)</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>885303-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass large clearance pestle</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>885301-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass small clearance pestle</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>885302-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3737001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispersing tool (S 10 N &#8211; 5G)</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3304000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers, 30 &#956;m</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>1000799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XTR Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75003698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterological Pipettes: 5 ml, 10 ml</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>EF16034F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemgenes Barcoding Beads</td>
			<td>Chemgenes</td>
			<td>Macosko-2011-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 &#956;m)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo Astrios Cell Sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B25982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>120262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#8217; Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>120267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish (60 x 15 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of adult spinal cord nuclei for massively parallel single-nucleus rna sequencing

Undersøkelser en enkeltcelle genuttrykk aktiverer identifisering av celle type og celle tilstand. Encellede RNA sekvensering har dukket opp som et kraftig verktøy for å studere transcriptional profiler av celler, spesielt i heterogen vev som sentralnervesystemet. Dissosiasjon metoder for enkeltcelle sekvensering kan imidlertid føre til eksperimentelle endringer i gene expression og celle død. Videre er disse metodene vanligvis begrenset til friske vevet, dermed begrense studier på arkivering og bio-bank materiale. Enkelt kjernen RNA sekvensering (snRNA-Seq) er et attraktivt alternativ for transcriptional studier, gitt at det nøyaktig identifiserer celletyper, tillater studiet av vev som frosne eller vanskelig å oppheve tilknytningen, og reduserer dissosiasjon-indusert transkripsjon. Her presenterer vi en høy gjennomstrømming protokoll for rask isolering av kjerner for nedstrøms snRNA-Seq. Denne metoden gjør at isolering av kjerner fra friske eller frosne ryggmargen prøver og kan kombineres med to massivt parallelle slippverktøy innkapsling plattformer.

Her utført vi isolering av kjerner fra voksen mus lumbale ryggmargen for nedstrøms massivt parallelle RNA sekvensering. Protokollen involvert tre hovedkomponenter: vev avbrudd og cellular lyse og homogenisering sukrose tetthet sentrifugering (figur 1). Innen sekunder gitt vaskemiddel mekaniske lysis en grov kjerner forberedelse med et stort antall atomkjerner samt mobilnettet og vev rusk (figur 2Atabell 2). Ett...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing at JoVE.com

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Her presenterer vi en protokoll for å raskt isolere høykvalitets kjerner fra friske eller frosne vev for nedstrøms massivt parallelle RNA sekvensering. Vi inkluderer vaskemiddel mekaniske og hypotonisk mekaniske vev avbrudd og celle lysis alternativer, begge kan brukes for isolering av kjerner.

Isolasjon av voksen ryggmargen kjerner for massivt parallelle Single-kjernen RNA sekvensering

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Encellede RNA sekvensering er et kraftig verktøy for å studere transkripsjonsprofiler av celler, spesielt i heterogent vev, som sentralnervesystemet. Denne protokollen gir en metode for å isolere kjerner for enkeltkjerners RNA-sekvensering. Ved å bruke kjerner i stedet for celler, kan denne metoden brukes på vanskelig å dissosiere vev, samt frosset vev.Videre kan denne metoden brukes til å studere celletypespesifikke endringer i celler etter sykdom eller skade. Begynn denne prosedyren med mus eutanasi, som beskrevet i tekstprotokollen. Deretter gjør et snitt langs kroppens lengde for å avsløre de indre organene.Eviscerate musen ved å trekke de indre organene fra kroppen hulrom ved hjelp av tang. Ikke bruk papirhåndklær til å rengjøre området eller for å fjerne organer, da dette kan introdusere forurensninger. Bruk saks, kutt vertebralkolonnen mellom L2 og L3 spinalvirvler.For å løse ut ryggmargen, monter en tre milliliter sprøyte som inneholder iskald PBS med en 25 gauge 1/4 tommers nål. Plasser spissen av nålen i sakralenden av vertebralkolonnen. Bruk to fingre til å klemme ryggvirvlene for å skape en tett forsegling rundt spissen av nålen, og trykk ned på stempelet for å løse ut ryggmargen rostrally.Legg ryggmargen i en petriskål med iskald PBS. Hvis bare lumbaldelen av ledningen er nødvendig, trim bort sakral- og thoraxdelene i ryggmargen. På dette punktet, fryse vevet og lagre på minus 80 grader Celsius, eller bruk umiddelbart for enten vaskemiddel mekanisk celle lysis som beskrevet her, eller hypotonisk mekanisk lysis som beskrevet i tekstprotokollen.For å bestemme vaskemiddel mekanisk celle lysis, plasser lumbal ryggmargen i en pre-kjølt Dounce homogenisator og tilsett 500 mikroliter av pre-kjølt vaskemiddel lysis buffer. Dounce med fem slag av løs pestle, A, og deretter fem til 10 slag av den stramme pestle, B.Unngå å løfte homogenisen utenfor lysisløsningen mellom slag, og unngå å introdusere bobler. Legg nå en 40 mikron sil over en forhåndskjølt 50 milliliter konisk rør og pre-våt med en milliliter lav sukrose buffer.Tilsett en milliliter lav sukrosebuffer til Dounce homogenisator som inneholder de rå kjernene i lysisbufferen, og bland forsiktig ved å pipettering to til tre ganger. Send den rå kjernen prep over 40-mikron sil, inn i pre-kjølt 50 milliliter konisk rør. Send en ekstra en milliliter lav sukrose buffer over 40 mikron sil, bringe det endelige volumet til tre milliliter av lav sukrose buffer og 500 mikroliter av lysis buffer.Gjenta disse trinnene hvis du kombinerer flere ledninger, kjøling i samme koniske rør. Deretter sentrifuger prøven på 3200 ganger G i 10 minutter ved fire grader Celsius. Når sentrifugeringen er fullført, dekanter supernatanten.Vi suspenderer paletten ved hjelp av tre milliliter med lav sukrosebuffer. Virvle forsiktig for å fjerne pelleten fra veggen for å lette resuspensjonen. Etter å ha latt prøven sitte på is i to minutter, overfør suspensjonen til et Oak Ridge-rør.Bruk homogenisatoren ved å sette en, homogenisere kjernene i lav sukrosebuffer i 15 til 30 sekunder, og hold prøven på is. Deretter bruker du en serologisk pipette til å legge lag 12,5 milliliter tetthet sukrose buffer, under den lave sukrose buffer homogenate, tar vare på ikke å skape en boble som forstyrrer tetthet lagene. Sentrifuger rørene ved 3200 ganger G, i 20 minutter ved fire grader Celsius.Når sentrifugeringen er fullført, dekanterer du umiddelbart supernatanten i en flicking bevegelse. Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske å umiddelbart fjerne Oak Ridge-røret fra sentrifugen, og raskt dekantere supernatanten. Ved hjelp av 100 mikroliter til en milliliter resuspensjonsløsning, suspenderer vi kjernene som er igjen på veggen.Unngå myelin rynke som forblir med vaskemiddel-basert forberedelse. Unnlatelse av å gjøre disse trinnene raskt kan resultere i en kjerne forberedelse med overflødig cellulær rusk, eller myelin, som kan hindre nedstrøms enkeltkjerners RNA sekvensering. Filtrer kjernene gjennom en 30 til 35 mikron porestørrelsessil og samle i et forkjølet rør.Bestem kjerneutbyttet ved hjelp av et hemocytometer for å telle kjerner under et 10 x mål, før du går videre til enkeltkjerners RNA-sekvensering, som beskrevet i tekstprotokollen. Bright felt og epifluorescerende bilder av kjerner, isolert ved hjelp av vaskemiddel mekanisk lysis protokollen, vises på 10 x. Disse kjernene er isolert på en objektiv måte, noe som åpner for studiet av endogene genuttrykkprofiler på nivå med en enkelt celle.Vist her, er en representativ tSNE plott av single-nucleus RNA sekvensering, fra en mus lumbal ryggmarg, ved hjelp av en massivt parallell dråpe innkapsling plattform. Kjerner isolert fra ferskt eller frosset vev kan brukes til sekvensering på både kommersielle og akademiske plattformer. Denne teknikken gjør det mulig for forskere å utforske transkripsjonsprofiler på encellenivå, ved hjelp av vanskelig å dissosiere vev, som ryggmargen, eller til og med frosset vev, for eksempel biobankmateriale.Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å redusere tiden mellom eutanasi og cellulær lysis. Videre er det viktig å minimere bobler introdusert i løsninger fra cellulær lysis til gjenoppliving, og å kjøpe kjæledyrkjerner med forsiktighet. Etter denne prosedyren kan kjerner brukes til alternative applikasjoner, for eksempel facs sortering, for å isolere bestemte celletyper.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Produksjon av RNA for transkripsjonsanalyse fra mus ryggmargsmotor neuroncellelegemer ved laserfangst mikrodeseksjon

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

RNA-Seq Analyse av Differential Gene Expression i elektroporerte Chick Embryonic Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Utarbeidelse av Primary Mixed Glial kulturer fra Adult Mouse Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Hydraulisk Ekstrudering av ryggmargen og isolering av de dorsale nerveknutene i Gnagere

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

Spinal Cord Neurons Isolasjon og kultur fra neonatale mus

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

Isolering av region-spesifikke Mikroglia fra en voksen mus Brain halvkule for Deep single-celle RNA sekvensering

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Intraarteriell levering av nevrale stamceller til rotte- og mushjernen: Søknad om cerebral iskemi

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Induction of Complete Transection-Type Spinal Cord Injury in Mice

Induksjon av fullstendig transeksjon-type ryggmargsskade hos mus

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, ...

A Minimally Invasive, Fast Spinal Cord Lateral Hemisection Technique for Modeling Open Spinal Cord Injuries in Rats

Open spinal cord injury techniques modeling laceration-like injuries are time-consuming and invasive because they involve laminectomy. This new technique ...