Name: isolation of adult spinal cord nuclei for massively parallel single-nucleus rna sequencing
Uploaded: 2018-10-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing at JoVE.com

Эта работа была поддержана в очной программе NINDS (1 Зия NS003153 02) и NIDCD (1 Зия DC000059 18). Мы благодарим L. Li и воспламенением Dobrott за их техническую поддержку и полезные обсуждения и Kathe C. для рассмотрения рукописи.

Все животные работа была выполнена в соответствии с протоколом, утвержденным Национальный институт неврологических нарушений и инсульта животных уход и использования Комитетом. Сбалансированный образцы мужские и женские мышей дикого типа МГП/CD-1, между 8 и 12 недель старые, были исполь?...

<ol>
	<li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+experience-dependent+transcriptomic+states+in+the+mouse+visual+cortex.">Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).</li><li>Hu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+Cell-Type+Composition+and+Activity-Dependent+Transcriptional+State+in+Mammalian+Brains+by+Massively+Parallel+Single-Nucleus+RNA-Seq.">Dissecting Cell-Type Composition and Activity-Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq.</a> Molecular Cell. 68 (5), 1006-1015 (2017).</li><li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+Activated+Cell+Populations+Using+Single-Cell+RNA-Seq.">Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li><li>Sathyamurthy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+Parallel+Single+Nucleus+Transcriptional+Profiling+Defines+Spinal+Cord+Neurons+and+Their+Activity+during+Behavior.">Massively Parallel Single Nucleus Transcriptional Profiling Defines Spinal Cord Neurons and Their Activity during Behavior.</a> Cell Reports. 22 (8), 2216-2225 (2018).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell.">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).</li><li>Campbell, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+census+of+arcuate+hypothalamus+and+median+eminence+cell+types.">A molecular census of arcuate hypothalamus and median eminence cell types.</a> Nature Neuroscience. 20 (3), 484-496 (2017).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+Reveals+Hypothalamic+Cell+Diversity.">Single-Cell RNA-Seq Reveals Hypothalamic Cell Diversity.</a> Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).</li><li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-cell+RNA-seq+for+marker-free+decomposition+of+tissues+into+cell+types.">Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types.</a> Science. 343 (6172), 776-779 (2014).</li><li>Li, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatosensory+neuron+types+identified+by+high-coverage+single-cell+RNA-sequencing+and+functional+heterogeneity.">Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity.</a> Cell Research. 26 (8), 967 (2016).</li><li>Shin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+with+Waterfall+Reveals+Molecular+Cascades+underlying+Adult+Neurogenesis.">Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis.</a> Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics.">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).</li><li>Usoskin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+classification+of+sensory+neuron+types+by+large-scale+single-cell+RNA+sequencing.">Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing.</a> Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).</li><li>Villani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+new+types+of+human+blood+dendritic+cells,+monocytes,+and+progenitors.">Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors.</a> Science. 356 (6335), (2017).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+structure.+Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).</li><li>Lacar, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+RNA-seq+of+single+neurons+reveals+molecular+signatures+of+activation.">Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation.</a> Nature Communications. 7, 11022 (2016).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain.">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li><li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-sequencing+from+single+nuclei.">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li><li>Krishnaswami, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+single+nuclei+for+RNA-seq+to+capture+the+transcriptome+of+postmortem+neurons.">Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons.</a> Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).</li><li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+nuclei+isolation+from+human+postmortem+brain+tissue.">Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).</li><li>Bergmann, O., Jovinge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+cardiomyocyte+nuclei+from+post-mortem+tissue.">Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Nohara, K., Chen, Z., Yoo, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Filtration-based+Method+of+Preparing+High-quality+Nuclei+from+Cross-linked+Skeletal+Muscle+for+Chromatin+Immunoprecipitation.">A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).</li><li>Halder, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+changes+in+plasticity+genes+accompany+the+formation+and+maintenance+of+memory.">DNA methylation changes in plasticity genes accompany the formation and maintenance of memory.</a> Nature Neuroscience. 19 (1), 102-110 (2016).</li><li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-nucleus+RNA-seq+with+DroNc-seq.">Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq.</a> Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).</li><li>. Sample Preparation Demonstrated Protocols: Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing</a> (2018)</li><li>10X Genomics. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single Cell 3' Reagent Kits v2 User Guide. , (2018).</li><li>Fu, Y., Rusznak, Z., Herculano-Houzel, S., Watson, C., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+composition+characterizing+postnatal+development+and+maturation+of+the+mouse+brain+and+spinal+cord.">Cellular composition characterizing postnatal development and maturation of the mouse brain and spinal cord.</a> Brain Structure and Function. 218 (5), 1337-1354 (2013).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+strategy+for+single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+confirms+accuracy+in+predicted+cell-type+expression+from+nuclear+RNA.">A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6031 (2017).</li><li>Bakken, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equivalent+high-resolution+identification+of+neuronal+cell+types+with+single-nucleus+and+single-cell+RNA-sequencing.">Equivalent high-resolution identification of neuronal cell types with single-nucleus and single-cell RNA-sequencing.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Div-Seq:+Single-nucleus+RNA-Seq+reveals+dynamics+of+rare+adult+newborn+neurons.">Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons.</a> Science. 353 (6302), 925-928 (2016).</li></ol>

Конечная цель настоящего Протокола заключается в изоляции ядер, содержащие РНК высокого качества для вниз по течению transcriptional анализа. Мы адаптировали мяРНК Seq методы для того, чтобы профиль, все типы клеток спинного мозга. Первоначально мы обнаружили, что типичных клеток диссоциации м?...

Нервная система состоит из гетерогенных групп клеток, которые отображают разнообразные морфологических, биохимических и электрофизиологических свойств. В то время как основная РНК последовательности был полезным для определения ткани-изменения в экспрессии генов в различных условиях, он исключает обнаружения transcriptional изменений на уровне одной ячейки. Последние достижения в одну ячейку транскрипционный анализ анализ позволили классификации разнородные клеток в функциональные группы на основании их молекулярные репертуар и даже могут быть использованы для обнаружения наборы нейронов, которые были недавно активных. 1 , 2 , 3 , 4 за последние десять лет, развитие одноклеточного РНК последовательности (scRNA-Seq) позволило изучение экспрессии генов в отдельных клетках, обеспечивая представление в разнообразии типа клеток. 5
Появление масштабируемых подходов, таких как массивно параллельной scRNA-Seq, предоставил платформ для последовательности разнородных тканей, включая многие регионы центральной нервной системы. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 однако, методы диссоциации одной ячейке может привести к гибели клеток, а также экспериментальные изменения в экспрессии генов. 16 последние работы адаптировала одну ячейку последовательности методов включения сохранения эндогенного транскрипционный анализ профиля. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 эти стратегии были особенно подходит для обнаружения немедленно ранних экспрессии генов (IEG) после сенсорные стимулы или поведение. 3 , 4 в будущем, эта стратегия могла бы также использоваться для изучения динамических изменений в тканях в болезненном состоянии или в ответ на стресс. Из этих методов, последовательности одного ядра РНК (мяРНК Seq) является многообещающим подходом, который не предполагает стресса заставить диссоциации клеток и могут быть использованы на трудно отделить ткани (например, спинной мозг), а также замороженные ткани. 4 , 17 , 18 , 19 адаптировано из предыдущих методов изоляции ядер,20,21,22,,2325 мяРНК Seq обычно использует нарушения быстрого ткани и клетки Лизис в холодных условиях, центрифугирования и разделение ядер от сотовой мусора. 4 ядра могут быть изолированы для вниз по течению виртуализации следующего поколения на нескольких платформах инкапсуляции microfluidic капли. 4 , 7 , 24 , 25 этот метод позволяет для моментального снимка транскрипционный анализ деятельности тысяч клеток в момент времени.
Существует несколько стратегий для выпускать ядра от клеток до изоляции и последовательности, каждый имеет свои собственные преимущества и недостатки. Здесь мы описываем и сравнить два протокола для включения изоляции ядра от взрослых спинного мозга для вниз по течению массивно параллельной мяРНК Seq: лизис моющих средств механические и гипотонической механические lysis. Моющее механические лизис обеспечивает полный тканей срыв и более высокую доходность окончательный ядер. Гипотонический механические лизис включает управляемые степень разрушения тканей, обеспечивая возможность для выбора баланса между количеством и чистоты доходности окончательного ядерного. Эти подходы обеспечивают сопоставимых РНК урожайности, обнаруженных числа генов в ядро и профилирование типа клеток и также может использоваться успешно для мяРНК Seq.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15503-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES (pH = 8.0)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgAc</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1028-10X1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA (pH = 8.0)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-46034CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10197777001</td>
			<td>Add DTT just prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Crystalgen</td>
			<td>221-238-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl (pH = 7.4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T2194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>59222C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate-A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A12475-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Crystalgen</td>
			<td>221-133-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.04% BSA</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 U/&#956;L RNAse Inhibitor</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>30281-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oak Ridge Centrifuge Tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3118-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Tissue Dounce (2 ml)</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>885303-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass large clearance pestle</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>885301-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass small clearance pestle</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>885302-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3737001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispersing tool (S 10 N &#8211; 5G)</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3304000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers, 30 &#956;m</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>1000799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XTR Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75003698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterological Pipettes: 5 ml, 10 ml</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>EF16034F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemgenes Barcoding Beads</td>
			<td>Chemgenes</td>
			<td>Macosko-2011-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 &#956;m)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo Astrios Cell Sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B25982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>120262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#8217; Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>120267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish (60 x 15 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of adult spinal cord nuclei for massively parallel single-nucleus rna sequencing

Зондирование экспрессии генов отдельной ячейки позволяет идентифицировать тип ячейки и ячейки состояния. Одноместный клеточной РНК последовательности стала мощным инструментом для изучения транскрипционный анализ профиля клеток, особенно в разнородных тканей, таких как центральной нервной системы. Однако диссоциация методы, необходимые для отдельной ячейки виртуализации может привести к экспериментальные изменения в ген выражение и клеток смерть. Кроме того эти методы обычно ограничены свежие ткани, тем самым ограничивая исследования архивных и био банк материала. Последовательности одного ядра РНК (мяРНК Seq) является привлекательной альтернативой для транскрипционный анализ исследований, учитывая, что он точно идентифицирует типы клеток, позволяет исследование ткани, замороженные или трудно отделить, и уменьшает диссоциации индуцированной транскрипция. Здесь мы представляем высок объём протокол для быстрой изоляции ядер для вниз по течению мяРНК Seq. Этот метод позволяет изоляции ядер из свежих или замороженных спинного образцов и могут быть объединены с двумя платформами инкапсуляции массивно параллельной капелька.

Здесь мы провели изоляции ядер от поясничного отдела спинного мозга взрослого мыши по течению массивно параллельной последовательности РНК. Протокол участвуют три основных компонента: тканей срыв и сотовых лизиса, гомогенизации и сахароза плотность центрифугирован...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing at JoVE.com

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Здесь мы представляем протокол быстро изолировать высокого качества ядер из свежих или замороженных ткани для вниз по течению массивно параллельной последовательности РНК. Мы включать моющих средств механические и гипотонической механические ткани нарушения и ячейки лизис вариантов, оба из которых могут быть использованы для изоляции ядер.

Изоляция взрослых спинной ядра для массивно параллельной сингл ядро РНК последовательности

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Одноклеточное секвенирование РНК является мощным инструментом для изучения транскрипционных профилей клеток, особенно в неоднородных тканях, таких как центральная нервная система. Этот протокол предоставляет метод изоляции ядер для одноядерного секвенирования РНК. Используя ядра вместо клеток, этот метод может быть применен к трудно диссоциативным тканям, а также замороженным тканям.Кроме того, этот метод может быть применен для изучения клеток типа конкретных изменений в клетках после болезни или травмы. Начните эту процедуру с эвтаназии мыши, как описано в текстовом протоколе. Затем сделайте разрез по длине тела, чтобы разоблачить внутренние органы.Вывести мышь, вытащив внутренние органы из полости тела с помощью типсов. Не используйте бумажные полотенца для очистки области или для удаления органов, так как это может привести загрязняющих веществ. Используя ножницы, вырезать позвоночный столб между L2 и L3 позвонков позвоночника.Чтобы извлечь спинной мозг, подходят три миллилитров шприц, содержащий ледяной PBS с 25 калибровочных 1 / 4 дюйма иглы. Поместите кончик иглы в сакральный конец позвоночного столба. Используйте два пальца, чтобы ущипнуть позвонки, чтобы создать плотный уплотнение вокруг кончика иглы, и нажмите вниз на поршень, чтобы извлечь спинной мозг rostrally.Поместите спинной мозг в чашку Петри с ледяной PBS. Если требуется только поясничная часть шнура, обрежьте сакральные и грудные части спинного мозга. На данный момент, заморозить ткани и хранить при температуре минус 80 градусов по Цельсию, или немедленно использовать либо моющее средство механического лиза клеток, как описано здесь, или гипотонический механическийлиз, как описано в текстовом протоколе.Для определения моющего средства механического клеточного лиза поместите поясничный спинной мозг в предварительно охлажденный гомогенизатор Dounce и добавьте 500 микролитров предварительно охлажденного моющего средства лиза буфера. Dounce с пятью штрихами рыхлой пестик, А, а затем от пяти до 10 ударов жесткой пестик, B.Avoid подъема гомогенизатора за пределами раствора лиза между ударами, и избежать введения пузырьков. Теперь поместите 40 микрон ситечко над предварительно охлажденной 50 миллилитров конической трубки и предварительно мокрый с одним миллилитр низкой сахарозы буфера.Добавьте один миллилитр низкого буфера сахарозы к гомогенизатору Dounce, содержащем сырые ядра в буфере лиза, и аккуратно перемешайте, трубя два-три раза. Перейти сырой ядра подготовки над 40-микрон ситечко, в предварительно охлажденной 50 миллилитров конической трубки. Пройди еще один миллилитр низкой сахарозы буфера над 40 микрон ситечко, в результате чего окончательный объем до трех миллилитров низкой сахарозы буфера и 500 микролитров буфера лиза.Повторите эти шаги, если объединить несколько шнуров, охлаждение в той же конической трубки. Затем центрифуга образца в 3200 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. После того, как центрифугация завершена, декантировать супернатант.Мы приостанавливаем палитру, используя три миллилитров низкого буфера сахарозы. Аккуратно вихрем, чтобы удалить гранулы со стены, чтобы облегчить повторное успение. После того, как образец будет сидеть на льду в течение двух минут, перенесите подвеску в трубку Oak Ridge.Используя гомогенизатор при установке одного, гомогенизировать ядра в буфер низкой сахарозы в течение 15 до 30 секунд, сохраняя образец на льду. Затем используйте серологическую пипетку, чтобы слой 12,5 миллилитров буфера плотности сахарозы, под низким гогенатом буфера сахарозы, заботясь, чтобы не создать пузырь, который нарушает плотность слоев. Центрифуга труб при 3200 раз G, в течение 20 минут при четырех градусах по Цельсию.После того, как центрифугация завершена, немедленно decant supernatant в стряхивая движения. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы немедленно удалить трубку Oak Ridge из центрифуги, и быстро decant супернатант. Используя 100 микролитров до одного миллилитра раствора повторного незаменимия, мы приостанавливаем ядра, оставшиеся на стене.Избегайте миелин хмуриться, что остается с моющим средством на основе подготовки. Невыполнение этих шагов быстро может привести к подготовке ядер с избытком клеточного мусора, или миелина, который может препятствовать секвенированию РНК ниже по течению. Фильтр ядра через 30 до 35 микрон пор размер ситечко и собирать в предварительно охлажденной трубки.Определите выход ядер, используя гемоцитометр для подсчета ядер под целью 10 х, прежде чем приступить к одноядерной РНК секвенирования, как описано в текстовом протоколе. Яркие полевые и эпифлюоресцентные изображения ядер, изолированных с помощью протокола механического лиза моющего средства, показаны на уровне 10 x. Эти ядра изолированы непредвзято, что позволяет изучать профили экспрессии эндогенных генов на уровне одной клетки.Здесь показан репрезентативный участок tSNE одноядерного РНК секвенирования, от поясничного спинного мозга мыши, используя массивно параллельную платформу инкапсуляции капель. Ядра, изолированные от свежих или замороженных тканей, могут использоваться для секвенирования как на коммерческих, так и на академических платформах. Этот метод позволяет исследователям исследовать транскрипционные профили на одноклеточном уровне, используя трудноразобщенные ткани, такие как спинной мозг, или даже замороженные ткани, такие как биобанковый материал.При попытке этой процедуры, важно, чтобы уменьшить количество времени между эвтаназией и клеточного лиза. Кроме того, важно свести к минимуму пузырьки, введенные в растворы от клеточного лиза до повторного успенения, и купить ядра домашних животных с осторожностью. Следуя этой процедуре, ядра могут быть использованы для альтернативных приложений, таких как сортировка факсов, для того, чтобы изолировать определенные типы клеток.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Спинной мозг электрофизиологии II: внеклеточной изготовление электродов Всасывающая

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Производство РНК для транскриптомного анализа от мыши спинного мозга Моторные нейронные клетки органов лазерного захвата microdissection

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

Секвенирование РНК анализ дифференциальных экспрессии генов в электропорации Чик эмбрионального спинного мозга

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Получение первичных смешанных глиальных культур от взрослых спинного мозга мыши ткани

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Гидравлический экструзионный спинного мозга и выделение спинальных ганглиях в Грызуны

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

Изоляция и культура нейронов спинного мозга от неонатальных мышей

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

Изоляция региона конкретных микроглии от одного взрослого полушария мозга мыши для глубокой одноклеточной РНК секвенирования

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Внутриархивная доставка нейронных стволовых клеток крыс и мышей мозга: Применение к церебральной ишемии

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Induction of Complete Transection-Type Spinal Cord Injury in Mice

Индукция полной трансекции типа травмы спинного мозга у мышей

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, ...

A Minimally Invasive, Fast Spinal Cord Lateral Hemisection Technique for Modeling Open Spinal Cord Injuries in Rats

Open spinal cord injury techniques modeling laceration-like injuries are time-consuming and invasive because they involve laminectomy. This new technique ...