Name: isolation of adult spinal cord nuclei for massively parallel single-nucleus rna sequencing
Uploaded: 2018-10-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing at JoVE.com

Este trabajo fue financiado por el programa intramuros de NINDS (1 ZIA NS003153 02) y NIDCD (1 ZIA DC000059 18). Agradecemos a L. Li y C.I. Dobrott por su apoyo técnico y discusiones útiles y C. Kathe para revisar el manuscrito.

Todos los trabajos de animales se realizan según un protocolo aprobado por el Instituto Nacional de desórdenes neurológicos y movimiento Animal cuidado y uso. Equilibrado de las muestras de hombres y mujeres ICR/CD-1 tipo salvaje ratones, entre 8 y 12 semanas viejo, fueron utilizados para todos los experimentos. Ratones deben ser manejados con arreglo a directrices institucionales Animal Care y Comité de uso locales.
1. preparación de materiales y Buffers
<ol><li>Preparar todos los búf...

<ol>
	<li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+experience-dependent+transcriptomic+states+in+the+mouse+visual+cortex.">Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).</li><li>Hu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+Cell-Type+Composition+and+Activity-Dependent+Transcriptional+State+in+Mammalian+Brains+by+Massively+Parallel+Single-Nucleus+RNA-Seq.">Dissecting Cell-Type Composition and Activity-Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq.</a> Molecular Cell. 68 (5), 1006-1015 (2017).</li><li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+Activated+Cell+Populations+Using+Single-Cell+RNA-Seq.">Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li><li>Sathyamurthy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+Parallel+Single+Nucleus+Transcriptional+Profiling+Defines+Spinal+Cord+Neurons+and+Their+Activity+during+Behavior.">Massively Parallel Single Nucleus Transcriptional Profiling Defines Spinal Cord Neurons and Their Activity during Behavior.</a> Cell Reports. 22 (8), 2216-2225 (2018).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell.">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).</li><li>Campbell, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+census+of+arcuate+hypothalamus+and+median+eminence+cell+types.">A molecular census of arcuate hypothalamus and median eminence cell types.</a> Nature Neuroscience. 20 (3), 484-496 (2017).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+Reveals+Hypothalamic+Cell+Diversity.">Single-Cell RNA-Seq Reveals Hypothalamic Cell Diversity.</a> Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).</li><li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-cell+RNA-seq+for+marker-free+decomposition+of+tissues+into+cell+types.">Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types.</a> Science. 343 (6172), 776-779 (2014).</li><li>Li, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatosensory+neuron+types+identified+by+high-coverage+single-cell+RNA-sequencing+and+functional+heterogeneity.">Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity.</a> Cell Research. 26 (8), 967 (2016).</li><li>Shin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+with+Waterfall+Reveals+Molecular+Cascades+underlying+Adult+Neurogenesis.">Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis.</a> Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics.">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).</li><li>Usoskin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+classification+of+sensory+neuron+types+by+large-scale+single-cell+RNA+sequencing.">Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing.</a> Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).</li><li>Villani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+new+types+of+human+blood+dendritic+cells,+monocytes,+and+progenitors.">Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors.</a> Science. 356 (6335), (2017).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+structure.+Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).</li><li>Lacar, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+RNA-seq+of+single+neurons+reveals+molecular+signatures+of+activation.">Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation.</a> Nature Communications. 7, 11022 (2016).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain.">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li><li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-sequencing+from+single+nuclei.">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li><li>Krishnaswami, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+single+nuclei+for+RNA-seq+to+capture+the+transcriptome+of+postmortem+neurons.">Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons.</a> Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).</li><li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+nuclei+isolation+from+human+postmortem+brain+tissue.">Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).</li><li>Bergmann, O., Jovinge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+cardiomyocyte+nuclei+from+post-mortem+tissue.">Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Nohara, K., Chen, Z., Yoo, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Filtration-based+Method+of+Preparing+High-quality+Nuclei+from+Cross-linked+Skeletal+Muscle+for+Chromatin+Immunoprecipitation.">A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).</li><li>Halder, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+changes+in+plasticity+genes+accompany+the+formation+and+maintenance+of+memory.">DNA methylation changes in plasticity genes accompany the formation and maintenance of memory.</a> Nature Neuroscience. 19 (1), 102-110 (2016).</li><li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-nucleus+RNA-seq+with+DroNc-seq.">Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq.</a> Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).</li><li>. Sample Preparation Demonstrated Protocols: Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing</a> (2018)</li><li>10X Genomics. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single Cell 3' Reagent Kits v2 User Guide. , (2018).</li><li>Fu, Y., Rusznak, Z., Herculano-Houzel, S., Watson, C., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+composition+characterizing+postnatal+development+and+maturation+of+the+mouse+brain+and+spinal+cord.">Cellular composition characterizing postnatal development and maturation of the mouse brain and spinal cord.</a> Brain Structure and Function. 218 (5), 1337-1354 (2013).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+strategy+for+single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+confirms+accuracy+in+predicted+cell-type+expression+from+nuclear+RNA.">A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6031 (2017).</li><li>Bakken, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equivalent+high-resolution+identification+of+neuronal+cell+types+with+single-nucleus+and+single-cell+RNA-sequencing.">Equivalent high-resolution identification of neuronal cell types with single-nucleus and single-cell RNA-sequencing.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Div-Seq:+Single-nucleus+RNA-Seq+reveals+dynamics+of+rare+adult+newborn+neurons.">Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons.</a> Science. 353 (6302), 925-928 (2016).</li></ol>

El objetivo final de este protocolo es aislar a los núcleos que contienen RNA de alta calidad para posteriores análisis transcripcional. Adaptamos métodos snRNA-Seq para Perfil de todos los tipos de células en la médula espinal. Inicialmente, se encontró que célula típica disociación métodos eran ineficaces para secuenciación unicelular RNA, como las neuronas de la médula espinal son especialmente vulnerables a la muerte celular. Además, métodos de disociación celular inducen la expresión de varios genes ...

El sistema nervioso se compone de grupos heterogéneos de células que muestran una gran variedad de propiedades morfológicas, bioquímicas y electrofisiológicas. Mientras que la secuencia de RNA a granel ha sido útil para determinar cambios de todo el tejido en la expresión de genes en diferentes condiciones, excluye la detección de cambios transcripcionales a nivel unicelular. Los avances recientes en el análisis transcripcional unicelulares han permitido la clasificación de las células heterogéneas en grupos funcionales basados en su repertorio molecular e incluso se pueden aprovechar para detectar grupos de neuronas que habían sido recientemente activas. 1 , 2 , 3 , 4 en los últimos diez años, el desarrollo de RNA de la célula única secuenciación (scRNA-Seq) ha permitido el estudio de la expresión génica en células individuales, proporcionando una visión en la diversidad de tipo de la célula. 5
La aparición de métodos escalables como tratamiento masivo en paralelo scRNA-Seq, ha proporcionado plataformas para tejidos heterogéneos de la secuencia, incluyendo muchas regiones del sistema nervioso central. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 sin embargo, métodos de disociación celular solo pueden llevar a la muerte celular así como los cambios experimentales en la expresión génica. 16 trabajo reciente ha adaptado métodos de secuenciación de unicelular para preservación de perfiles transcripcionales endógenos. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 estas estrategias han sido particularmente convenientes para la detección inmediata temprana expresión del gen (IEG) después de estímulo sensorial o comportamiento. 3 , 4 en el futuro, esta estrategia podría también ser utilizada para estudiar los cambios dinámicos en los tejidos en Estados de enfermedad o en respuesta al estrés. De estos métodos, la secuencia solo núcleo RNA (snRNA-Seq) es un enfoque prometedor que implican estrés induce la disociación celular y puede ser utilizado en difícil de disociar del tejido (por ejemplo, la médula espinal), así como congelado tejido. 4 , 17 , 18 , 19 adaptado de los métodos de aislamiento de los núcleos anteriores,20,21,22,23,25 snRNA-Seq típicamente utiliza el celular y la interrupción de tejido rápido lisis en condiciones de frío, centrifugación y separación de los núcleos de la ruina celular. 4 núcleos pueden ser aislados para la secuenciación de próxima generación descendente en múltiples plataformas de encapsulación de gotita de microfluidos. 4 , 7 , 24 , 25 este método permite una instantánea de la actividad transcripcional de miles de células en un momento en el tiempo.
Existen múltiples estrategias para la liberación de los núcleos de las células antes de aislamiento y secuencia, cada uno con sus ventajas y desventajas. Aquí, describimos y comparar dos protocolos para permitir el aislamiento de los núcleos de la médula espinal adulta para el tratamiento masivo en paralelo abajo snRNA-Seq: lisis mecánica detergente y lisis hipotónica-mecánica. Lisis de detergente-mecánica proporciona la interrupción completa del tejido y un mayor rendimiento final de los núcleos. Mecánica-lisis hipotónica incluyen un grado controlable de disrupción del tejido, proporcionando una oportunidad para la selección de un equilibrio entre la cantidad y la pureza de la producción nuclear final. Estos enfoques proporcionan rendimiento comparable de RNA detectado un número de genes por núcleo y mediante perfiles tipo de la célula y también pueden tanto ser utilizados con éxito para snRNA-SS.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15503-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES (pH = 8.0)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgAc</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1028-10X1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA (pH = 8.0)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-46034CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10197777001</td>
			<td>Add DTT just prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Crystalgen</td>
			<td>221-238-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl (pH = 7.4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T2194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>59222C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate-A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A12475-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Crystalgen</td>
			<td>221-133-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.04% BSA</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 U/&#956;L RNAse Inhibitor</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>30281-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oak Ridge Centrifuge Tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3118-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Tissue Dounce (2 ml)</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>885303-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass large clearance pestle</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>885301-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass small clearance pestle</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>885302-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3737001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispersing tool (S 10 N &#8211; 5G)</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3304000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers, 30 &#956;m</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>1000799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XTR Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75003698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterological Pipettes: 5 ml, 10 ml</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>EF16034F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemgenes Barcoding Beads</td>
			<td>Chemgenes</td>
			<td>Macosko-2011-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 &#956;m)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo Astrios Cell Sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B25982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>120262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#8217; Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>120267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish (60 x 15 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of adult spinal cord nuclei for massively parallel single-nucleus rna sequencing

Sondeo de genes de una célula individual permite la identificación del tipo celular y el estado de la célula. La secuencia de RNA unicelular ha surgido como una poderosa herramienta para el estudio de perfiles transcripcionales de las células, particularmente en tejidos heterogéneos tales como el sistema nervioso central. Sin embargo, métodos de disociación para la secuencia de la célula pueden conducir a cambios experimentales en la gene expresión y muerte celular. Además, estos métodos están generalmente restringidos a tejido fresco, limitando así los estudios sobre archivos y material bio-Banco. Solo núcleo RNA secuencia (snRNA-Seq) es una alternativa atractiva para estudios transcripcionales, dado que precisamente identifica tipos de la célula, permite el estudio de los tejidos congelados o difícil de disociar, y reduce la disociación inducida transcripción. Aquí, presentamos un protocolo de alto rendimiento para el aislamiento rápido de núcleos para abajo snRNA-SS. Este método permite el aislamiento de los núcleos de las muestras frescas o congeladas de la médula espinal y puede combinarse con dos plataformas de encapsulación de gota masiva y en paralelo.

Aquí, realizamos aislamiento de núcleos de la médula espinal lumbar ratón adulto para la descendente secuencia de RNA masivamente paralela. El protocolo participan tres componentes principales: tejido celular e interrupción lisis, homogeneización y sacarosa densidad centrifugación (figura 1). En cuestión de segundos la lisis mecánica de detergente rindió una preparación cruda de núcleos con un gran número de núcleos, así como desechos celulares...

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Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Aquí, presentamos un protocolo para aislar rápidamente a núcleos de alta calidad del tejido fresco o congelado para la descendente secuencia de RNA masivamente paralelo. Nos incluyen tejido detergente-mecánica y de mecánica hipotónica interrupción y célula opciones de lisis, que pueden utilizarse para el aislamiento de los núcleos.

Aislamiento de núcleos de adultos de la médula espinal para secuenciación masivamente paralela solo núcleo ARN

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

La secuenciación de ARN de una sola célula es una poderosa herramienta para estudiar los perfiles transcripcionales de las células, particularmente en el tejido heterogéneo, como el sistema nervioso central. Este protocolo proporciona un método para aislar núcleos para la secuenciación de ARN de un solo núcleo. Mediante el uso de núcleos en lugar de células, este método se puede aplicar a los tejidos difíciles de disociar, así como al tejido congelado.Además, este método se puede aplicar para estudiar los cambios específicos del tipo de células en las células después de la enfermedad o lesión. Comience este procedimiento con la eutanasia del ratón, como se describe en el protocolo de texto. A continuación, haga una incisión a lo largo de la longitud del cuerpo para exponer los órganos internos.Eviscerar al ratón tirando de los órganos internos de la cavidad del cuerpo usando fórceps. No utilice toallas de papel para limpiar la zona o para eliminar órganos, ya que esto puede introducir contaminantes. Usando tijeras, corte la columna vertebral entre las vértebras espinales L2 y L3.Para expulsar la médula espinal, coloque una jeringa de tres mililitros que contenga PBS helado con una aguja de 25 calibres de 1/4 de pulgada. Coloque la punta de la aguja en el extremo sacro de la columna vertebral. Use dos dedos para pellizcar las vértebras para crear un sello hermético alrededor de la punta de la aguja, y presione hacia abajo en el émbolo para expulsar la médula espinal rostralmente.Coloque la médula espinal en una placa de Petri con PBS helada. Si solo se requiere la parte lumbar de la médula, recorte las porciones sacra y torácica de la médula espinal. En este punto, congelar el tejido y almacenar a menos 80 grados Celsius, o utilizar inmediatamente para la lisis de células mecánicas detergentes como se describe aquí, o la lisis mecánica hipotónica como se describe en el protocolo de texto.Para determinar la lelisis de células mecánicas detergentes, coloque la médula espinal lumbar en un homogeneizador Dounce preenfriado y agregue 500 microlitros de tampón de lelisis detergente preenfriado. Dounce con cinco golpes del peste suelto, A, y luego cinco a 10 golpes del peste apretado, B.Evitar levantar el homogeneizador fuera de la solución de lisis entre golpes, y evitar la introducción de burbujas. Ahora, coloque un colador de 40 micras sobre un tubo cónico pre-enfriado de 50 mililitros y pre-mojado con un mililitro de tampón de sacarosa baja.Agregue un mililitro de tampón de sacarosa baja al homogeneizador Dounce que contiene los núcleos crudos en el tampón de lelisis, y mezcle suavemente pipeteando de dos a tres veces. Pasar la preparación de núcleos crudos sobre el colador de 40 micras, en el tubo cónico pre-enfriado de 50 mililitros. Pase un búfer de sacarosa baja adicional de un mililitro sobre el colador de 40 micras, con lo que el volumen final a tres mililitros del búfer de sacarosa baja y 500 microlitros del búfer de lisis.Repita estos pasos si combina varios cables, enfriando en el mismo tubo cónico. Luego, centrifuga la muestra a 3200 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Una vez completada la centrifugación, decantar el sobrenadante.Suspendemos la paleta usando tres mililitros de tampón de sacarosa baja. Revuelva suavemente para retirar el pellet de la pared para facilitar la resuspensión. Después de dejar que la muestra se siente en hielo durante dos minutos, transfiera la suspensión a un tubo Oak Ridge.Usando el homogeneizador en el ajuste uno, homogeneizar los núcleos en tampón de sacarosa baja durante 15 a 30 segundos, manteniendo la muestra sobre hielo. A continuación, utilice una pipeta serológica para poner en capas 12,5 mililitros de tampón de sacarosa de densidad, debajo del búfer de sacarosa baja homogeneizar, teniendo cuidado de no crear una burbuja que interrumpa las capas de densidad. Centrifugar los tubos a 3200 veces G, durante 20 minutos a cuatro grados centígrados.Una vez completada la centrifugación, decanta inmediatamente el sobrenadante en un movimiento de parpadeo. Al intentar este procedimiento, es importante recordar retirar inmediatamente el tubo Oak Ridge de la centrífuga, y decantar rápidamente el sobrenadante. Usando 100 microlitros a un mililitro de solución de resuspensión, suspendemos los núcleos restantes en la pared.Evite el ceño fruncido de mielina que queda con la preparación a base de detergente. Si no se realizan estos pasos rápidamente, se puede producir una preparación de núcleos con exceso de residuos celulares, o mielina, que puede impedir la secuenciación de ARN de un solo núcleo aguas abajo. Filtrar los núcleos a través de un colador de 30 a 35 micras tamaño de poro y recoger en un tubo pre-refrigerado.Determinar el rendimiento de los núcleos, utilizando un hemocitoómetro para contar núcleos bajo un objetivo de 10 x, antes de proceder a la secuenciación de ARN de un solo núcleo, como se describe en el protocolo de texto. El campo brillante y las imágenes epifluorescentes de núcleos, aislados mediante el protocolo de lisis mecánica detergente, se muestran a 10 x. Estos núcleos están aislados de manera imparcial, lo que permite el estudio de perfiles de expresión génica endógenos a nivel de una sola célula.Aquí se muestra una gráfica tSNE representativa de la secuenciación de ARN de un solo núcleo, a partir de una médula espinal lumbar de ratón, utilizando una plataforma de encapsulación de gotas masivamente paralela. Los núcleos aislados de tejido fresco o congelado se pueden utilizar para la secuenciación en plataformas comerciales y académicas. Esta técnica permite a los investigadores explorar perfiles transcripcionales a nivel de una sola célula, utilizando tejidos difíciles de disociar, como la médula espinal, o incluso tejido congelado, como el material biobanco.Al intentar este procedimiento, es importante reducir la cantidad de tiempo entre la eutanasia y la lelisis celular. Además, es importante minimizar las burbujas introducidas en las soluciones desde la lelisis celular hasta la resuspensión, y comprar núcleos de mascotas con cuidado. Siguiendo este procedimiento, los núcleos se pueden utilizar para aplicaciones alternativas, como la clasificación de facs, con el fin de aislar tipos de celdas específicos.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Investigación

Neurociencias

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