Name: isolation of adult spinal cord nuclei for massively parallel single-nucleus rna sequencing
Uploaded: 2018-10-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing at JoVE.com

Detta arbete stöds av intramurala programet av NINDS (1 ZIA NS003153 02) och NIDCD (1 ZIA DC000059 18). Vi tackar L. Li och C.I. Dobrott för deras teknisk support och bra diskussioner, och C. Kathe för granskning av manuskriptet.

Alla djur arbetet utförs i enlighet med ett protokoll som godkänts av den nationella institutet för neurologiska sjukdomar och Stroke djur vård och användning kommittén. Balanserad prover av manliga och kvinnliga ICR/CD-1 vildtyp möss, mellan 8 och 12 veckor gamla, användes för alla experiment. Möss ska hanteras enligt lokala riktlinjer för institutionella djur vård och användning kommittén.
1. beredning av material och buffertar
<ol><li>Förbereda alla buffertar dagen för anv...

<ol>
	<li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+experience-dependent+transcriptomic+states+in+the+mouse+visual+cortex.">Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).</li><li>Hu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+Cell-Type+Composition+and+Activity-Dependent+Transcriptional+State+in+Mammalian+Brains+by+Massively+Parallel+Single-Nucleus+RNA-Seq.">Dissecting Cell-Type Composition and Activity-Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq.</a> Molecular Cell. 68 (5), 1006-1015 (2017).</li><li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+Activated+Cell+Populations+Using+Single-Cell+RNA-Seq.">Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li><li>Sathyamurthy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+Parallel+Single+Nucleus+Transcriptional+Profiling+Defines+Spinal+Cord+Neurons+and+Their+Activity+during+Behavior.">Massively Parallel Single Nucleus Transcriptional Profiling Defines Spinal Cord Neurons and Their Activity during Behavior.</a> Cell Reports. 22 (8), 2216-2225 (2018).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell.">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).</li><li>Campbell, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+census+of+arcuate+hypothalamus+and+median+eminence+cell+types.">A molecular census of arcuate hypothalamus and median eminence cell types.</a> Nature Neuroscience. 20 (3), 484-496 (2017).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+Reveals+Hypothalamic+Cell+Diversity.">Single-Cell RNA-Seq Reveals Hypothalamic Cell Diversity.</a> Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).</li><li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-cell+RNA-seq+for+marker-free+decomposition+of+tissues+into+cell+types.">Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types.</a> Science. 343 (6172), 776-779 (2014).</li><li>Li, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatosensory+neuron+types+identified+by+high-coverage+single-cell+RNA-sequencing+and+functional+heterogeneity.">Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity.</a> Cell Research. 26 (8), 967 (2016).</li><li>Shin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+with+Waterfall+Reveals+Molecular+Cascades+underlying+Adult+Neurogenesis.">Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis.</a> Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics.">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).</li><li>Usoskin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+classification+of+sensory+neuron+types+by+large-scale+single-cell+RNA+sequencing.">Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing.</a> Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).</li><li>Villani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+new+types+of+human+blood+dendritic+cells,+monocytes,+and+progenitors.">Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors.</a> Science. 356 (6335), (2017).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+structure.+Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).</li><li>Lacar, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+RNA-seq+of+single+neurons+reveals+molecular+signatures+of+activation.">Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation.</a> Nature Communications. 7, 11022 (2016).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain.">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li><li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-sequencing+from+single+nuclei.">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li><li>Krishnaswami, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+single+nuclei+for+RNA-seq+to+capture+the+transcriptome+of+postmortem+neurons.">Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons.</a> Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).</li><li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+nuclei+isolation+from+human+postmortem+brain+tissue.">Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).</li><li>Bergmann, O., Jovinge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+cardiomyocyte+nuclei+from+post-mortem+tissue.">Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Nohara, K., Chen, Z., Yoo, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Filtration-based+Method+of+Preparing+High-quality+Nuclei+from+Cross-linked+Skeletal+Muscle+for+Chromatin+Immunoprecipitation.">A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).</li><li>Halder, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+changes+in+plasticity+genes+accompany+the+formation+and+maintenance+of+memory.">DNA methylation changes in plasticity genes accompany the formation and maintenance of memory.</a> Nature Neuroscience. 19 (1), 102-110 (2016).</li><li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-nucleus+RNA-seq+with+DroNc-seq.">Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq.</a> Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).</li><li>. Sample Preparation Demonstrated Protocols: Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing</a> (2018)</li><li>10X Genomics. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single Cell 3' Reagent Kits v2 User Guide. , (2018).</li><li>Fu, Y., Rusznak, Z., Herculano-Houzel, S., Watson, C., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+composition+characterizing+postnatal+development+and+maturation+of+the+mouse+brain+and+spinal+cord.">Cellular composition characterizing postnatal development and maturation of the mouse brain and spinal cord.</a> Brain Structure and Function. 218 (5), 1337-1354 (2013).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+strategy+for+single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+confirms+accuracy+in+predicted+cell-type+expression+from+nuclear+RNA.">A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6031 (2017).</li><li>Bakken, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equivalent+high-resolution+identification+of+neuronal+cell+types+with+single-nucleus+and+single-cell+RNA-sequencing.">Equivalent high-resolution identification of neuronal cell types with single-nucleus and single-cell RNA-sequencing.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Div-Seq:+Single-nucleus+RNA-Seq+reveals+dynamics+of+rare+adult+newborn+neurons.">Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons.</a> Science. 353 (6302), 925-928 (2016).</li></ol>

Det slutliga målet med detta protokoll är att isolera atomkärnor som innehåller högkvalitativa RNA för nedströms transkriptionell analys. Vi anpassat snRNA-Seq metoder för att profilera alla celltyper i ryggmärgen. Vi hittade inledningsvis att typiska cell dissociation metoder var ineffektivt för enstaka cell RNA sekvensering, som ryggmärgen nervceller är särskilt utsatta för celldöd. Dessutom inducerar cell dissociation metoder uttryck av olika aktivitet och stress-och svar gener av upp till flera hundraf...

Nervsystemet består av heterogena grupper av celler som visar en mångfald av morfologiska, biokemiska och elektrofysiologiska egenskaper. Medan den bulk RNA-sekvenseringen har varit användbar för att fastställa vävnad-omfattande förändringar i genuttryck under olika förhållanden, den utgör hinder för detektion av transkriptionell ändringar på enskild cell. Senaste framstegen inom encelliga transkriptionell analysen har aktiverat Klassificering av heterogen celler i funktionella grupper baserat på deras molekylära repertoar och kan även användas för att identifiera uppsättningar av nervceller som hade varit nyligen aktiva. 1 , 2 , 3 , 4 de senaste tio åren har utvecklingen av enstaka cell RNA sekvensering (scRNA-Seq) har möjliggjort studier av genuttryck i enskilda celler, som ger en inblick i celltyp mångfald. 5
Uppkomsten av skalbara metoder såsom massivt parallella scRNA-Seq, har lämnat plattformar till sekvens heterogena vävnader, inklusive många regioner i centrala nervsystemet. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 dock enstaka cell dissociation metoder kan leda till såväl celldöd som experimentella förändringar i genuttryck. 16 senaste arbete har anpassat enda cell sekvenseringsmetoder för att aktivera bevarande av endogena transkriptionell profiler. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 dessa strategier har varit särskilt lämplig för att upptäcka omedelbara tidiga (IEG) genuttryck efter sinnesretning eller beteende. 3 , 4 i framtiden, denna strategi kan också användas för att studera dynamiska förändringar i vävnader i sjukdomstillstånd eller som svar på stress. Dessa metoder, enda nucleus RNA-sekvensering (snRNA-Seq) är en lovande strategi som innebär inte stress-inducerande cell dissociation och kan användas på svårt att separera vävnad (såsom ryggmärgen), samt fryst vävnad. 4 , 17 , 18 , 19 anpassas från tidigare kärnor isoleringsmetoder,20,21,22,23,25 snRNA-Seq vanligtvis använder snabb vävnad störningar och cell lysis under kalla förhållanden, centrifugering och separering av atomkärnor från cellulära skräp. 4 kärnor kan isoleras för nedströms nästa generations sekvensering på flera mikroflödessystem droplet inkapsling plattformar. 4 , 7 , 24 , 25 denna metod möjliggör en ögonblicksbild av tusentals celler transkriptionell verksamhet vid en tidpunkt.
I området i närheten finns det flera strategier för att frigöra kärnor från celler innan isolering och sekvensering, alla med sina egna fördelar och nackdelar. Här, vi beskriver och jämför två protokoll om du vill aktivera isolering av kärnor från vuxna ryggmärgen för de nedströms massivt parallella snRNA-Seq: tvättmedel-mekaniska lysis och hypoton-mekaniska lysis. Tvättmedel-mekaniska lysis ger komplett vävnad störningar och en högre slutliga avkastning av atomkärnor. Hypoton mekaniska-Lys inkluderar en kontrollerbar grad av vävnad störningar, vilket ger en möjlighet för att välja en balans mellan kvantitet och renhet av slutlig kärnteknisk avkastningen. Dessa metoder ger jämförbara RNA avkastning, upptäckta antal gener per kärna och celltyp profilering och också kan både användas framgångsrikt för snRNA-följande punkter

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15503-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES (pH = 8.0)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgAc</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1028-10X1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA (pH = 8.0)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-46034CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10197777001</td>
			<td>Add DTT just prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Crystalgen</td>
			<td>221-238-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl (pH = 7.4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T2194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>59222C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate-A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A12475-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Crystalgen</td>
			<td>221-133-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.04% BSA</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 U/&#956;L RNAse Inhibitor</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>30281-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oak Ridge Centrifuge Tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3118-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Tissue Dounce (2 ml)</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>885303-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass large clearance pestle</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>885301-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass small clearance pestle</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>885302-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3737001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispersing tool (S 10 N &#8211; 5G)</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3304000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers, 30 &#956;m</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>1000799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XTR Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75003698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterological Pipettes: 5 ml, 10 ml</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>EF16034F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemgenes Barcoding Beads</td>
			<td>Chemgenes</td>
			<td>Macosko-2011-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 &#956;m)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo Astrios Cell Sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B25982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>120262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#8217; Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>120267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish (60 x 15 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of adult spinal cord nuclei for massively parallel single-nucleus rna sequencing

Sondera en enskild cell genuttryck möjliggör identifiering av celltyp och cell staten. Encelliga RNA-sekvensering har vuxit fram som ett kraftfullt verktyg för att studera transkriptionell profiler av celler, särskilt i heterogena vävnader såsom det centrala nervsystemet. Dock kan dissociation metoder krävs för enstaka cell sekvensering leda till experimentella förändringar i genen uttryck och cell död. Dessa metoder är dessutom generellt begränsad till färsk vävnad, vilket begränsar studier på arkivering och bio-bank material. Enda nucleus RNA-sekvensering (snRNA-Seq) är ett tilltalande alternativ för transkriptionell studier, med tanke på att det exakt identifierar celltyper, tillåter studiet av vävnader som är frysta eller svårt att sära på, och minskar dissociation-inducerad transkription. Här presenterar vi ett högt dataflöde protokoll för snabb isolering av kärnor för nedströms snRNA-följande punkter. Denna metod möjliggör isolering av kärnor från färska eller frysta ryggmärgen prover och kan kombineras med två massivt parallella droplet inkapsling plattformar.

Här, utfört vi isolering av kärnor från vuxen mus ländryggen ryggmärgen för nedströms massivt parallella RNA-sekvensering. Protokollet inblandade tre huvudkomponenter: vävnad störningar och cellulär Lys, homogenisering och sackaros densitet centrifugering (figur 1). Inom sekunder gav tvättmedel-mekaniska Lys en rå atomkärnor preparationen med ett stort antal kärnor samt cellulär och vävnad skräp (figur 2A<strong...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing at JoVE.com

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Här presenterar vi ett protokoll för att snabbt isolera högkvalitativa kärnor från färska eller frysta vävnaden för nedströms massivt parallella RNA-sekvensering. Vi inkluderar rengöringsmedel-mekaniska och hypoton-mekaniska vävnad störningar och cell lysis alternativ, som båda kan användas för isolering av atomkärnor.

Isolering av vuxna ryggmärgen kärnor för massivt parallella singel-nucleus RNA-sekvensering

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Encellig RNA-sekvensering är ett kraftfullt verktyg för att studera transkriptionella profiler av celler, särskilt i heterogen vävnad, såsom centrala nervsystemet. Detta protokoll ger en metod för att isolera kärnor för enkel-nucleus RNA-sekvensering. Genom att använda kärnor i stället för celler kan denna metod appliceras på svårlösa vävnader, liksom frusen vävnad.Vidare kan denna metod tillämpas för att studera celltypspecifika förändringar i celler efter sjukdom eller skada. Inled den här proceduren med mus dödshjälp, som beskrivs i textprotokollet. Därefter gör ett snitt längs längden på kroppen för att exponera de inre organen.Avlägsna musen genom att dra de inre organen från kroppshålan med hjälp av tuppar. Använd inte hushållspapper för att rengöra området eller för att avlägsna organ, eftersom detta kan införa föroreningar. Med hjälp av sax, skär kotpelaren mellan L2 och L3 ryggraden.För att mata ut ryggmärgen, montera en tre milliliter spruta som innehåller iskall PBS med en 25 gauge 1/4 tums nål. Placera nålspetsen i den sakrala änden av kotpelaren. Använd två fingrar för att nypa kotorna för att skapa en tät tätning runt spetsen på nålen, och tryck ner på kolven för att mata ut ryggmärgen rostrally.Placera ryggmärgen i en petriskål med iskall PBS. Om endast ländryggen del av sladden krävs, trimma bort sakrala och bröst delar av ryggmärgen. Vid denna punkt, frysa vävnaden och lagra på minus 80 grader Celsius, eller använd omedelbart för antingen tvättmedel mekanisk cell lys som beskrivs här, eller hypotona mekanisk lys som beskrivs i textprotokollet.För att bestämma tvättmedel mekanisk cell lys, placera ländryggen ryggmärgen i en pre-kyld Dounce homogenisator och tillsätt 500 mikroliter av pre-kyld tvättmedel lys buffert. Dounce med fem slag av den lösa mortelstöten, A, och sedan fem till 10 slag av den snäva mortelstöten, B.Undvik att lyfta homogenisatoren utanför lyslösningen mellan stroke, och undvik att införa bubblor. Nu, placera en 40 mikron sil över en pre-kyld 50 milliliter koniska rör och pre-våt med en milliliter låg sackaros buffert.Tillsätt en milliliter låg sackarosbuffert till Dounce-homogenisatorn som innehåller råkärnorna i lysbufferten och blanda försiktigt genom pipettering två till tre gånger. Passera råa kärnor prep över 40-micron sil, i pre-kylda 50 milliliter koniska röret. Passera ytterligare en milliliter låg sackaros buffert över 40 micron sil, vilket innebär att den slutliga volymen till tre milliliter av låg sackaros buffert och 500 mikroliter av lysbuffert.Upprepa dessa steg om kombinera flera sladdar, kylning i samma koniska röret. Sedan centrifug provet vid 3200 gånger G i 10 minuter vid fyra grader Celsius. När centrifugeringen är klar, dekantera supernatanten.Vi upphäver paletten med hjälp av tre milliliter låg sackaros buffert. Snurra försiktigt för att avlägsna pelleten från väggen för att underlätta återfpensionen. Efter att ha låtit provet sitta på is i två minuter, överför suspensionen till en Oak Ridge röret.Med hjälp av homogenisator vid inställning ett, homogenisera kärnorna i låg sackaros buffert för 15 till 30 sekunder, hålla provet på is. Använd sedan en serologisk pipet till lager 12,5 milliliter densitet sackaros buffert, under den låga sackaros buffert homogenate, var noga med att inte skapa en bubbla som stör densiteten lager. Centrifugera rören vid 3200 gånger G, i 20 minuter vid fyra grader Celsius.När centrifugeringen är klar, omedelbart dekantera supernatanten i en snärtande rörelse. Medan du försöker detta förfarande, det är viktigt att komma ihåg att omedelbart ta bort Oak Ridge röret från centrifug, och snabbt dekantera supernatant. Med hjälp av 100 mikroliter till en milliliter resuspension lösning, vi upphäva kärnor kvar på väggen.Undvik myelin rynka pannan som finns kvar med tvättmedelsbaserad beredning. Underlåtenhet att göra dessa steg snabbt kan resultera i en kärnor förberedelse med överskott cellulära skräp, eller myelin, som kan hindra nedströms enda kärnan RNA sekvensering. Filtrera kärnorna genom en 30 till 35 mikron porstorlek sil och samla i en pre-kyld tub.Bestäm kärnor avkastning, med hjälp av en hemocytometer att räkna kärnor under en 10 x objektiv, innan du fortsätter till single-nucleus RNA sekvensering, som beskrivs i textprotokollet. Ljusa fält- och epifluorescerande bilder av kärnor, isolerade med hjälp av tvättmedelsprotokollet mekanisk lys, visas vid 10 x. Dessa kärnor är isolerade på ett opartiskt sätt, vilket möjliggör studier av endogena genuttrycksprofiler på nivån för en enda cell.Visas här, är en representativ tSNE tomt av single-nucleus RNA sekvensering, från en mus ländryggen ryggmärg, med hjälp av en massivt parallell droppe inkapsling plattform. Kärnor isolerade från färsk eller fryst vävnad kan användas för sekvensering på både kommersiella och akademiska plattformar. Denna teknik gör det möjligt för forskare att utforska transkriptionella profiler på encellsnivå, med hjälp av svåravlösta vävnader, såsom ryggmärgen, eller till och med fryst vävnad, såsom biobanksmaterial.Medan du försöker detta förfarande, Det är viktigt att minska den tid mellan dödshjälp och cellulär lys. Vidare, den er viktig till minimera bubbla introducerat in i lösandet från cellular lysis till resuspension, och till köpa sällskapsdjur atomkärnor med bekymmer. Efter denna procedur kan kärnor användas för alternativa tillämpningar, till exempel facs sortering, i syfte att isolera specifika celltyper.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Ryggmärgen Elektrofysiologi II: Extracellulär Sug elektrod Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Produktion av RNA för transkriptomisk analys från mus ryggmärg motor neuron cellkroppar av laser capture mikrodissektion

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

RNA-Seq analys av Differential genuttryck i elektro Chick embryonala Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Framställning av primära blandade Glial kulturer från vuxen mus ryggmärg

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Hydraulisk Extrudering av ryggmärgen och isolering av dorsalrotsganglier i Gnagare

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

Ryggmärgsneurons isolering och kultur från neonatala möss

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

Isolering av regionspecifika Microglia från en vuxen mus hjärnhalva halvklotet för djup Single-cell RNA sekvensering

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Intra-arteriell leverans av neurala stamceller till råtta och mus hjärnan: Ansökan till cerebral ischemi

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Induction of Complete Transection-Type Spinal Cord Injury in Mice

Induktion av Komplett Transection-Typ ryggmärgsskada hos möss

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, ...

A Minimally Invasive, Fast Spinal Cord Lateral Hemisection Technique for Modeling Open Spinal Cord Injuries in Rats

Open spinal cord injury techniques modeling laceration-like injuries are time-consuming and invasive because they involve laminectomy. This new technique ...