Name: purification of extracellular trypanosomes, including african, from blood by anion-exchangers (diethylaminoethyl-cellulose columns)
Uploaded: 2019-04-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers Diethylaminoethyl-cellulose Columns at JoVE.com

Vi takker alle medlemmer af UMR 177 INTERTRYP IRD CIRAD Université de Bordeaux. Denne forskning blev støttet af indre finansiering fra universitetet i Bordeaux og støtte fra ANR, LABEX ParaFrap ANR-11-LABX-0024, og fra Association pour le développement de la recherche en parasitologie et médecine tropicale og Service de Coopération et d'action culturelle de l'Ambassade de France à Bangui (Centrafrique).

Undersøgelser i overensstemmelse med retningslinjerne for pleje og anvendelse af forsøgsdyr (NIH publikation nr. 85±23, revideret 1996). Protokoller blev godkendt af vores lokale etiske udvalg.
1. dyr
<ol><li>Holde Swiss (af-1) hunmus alderen otte til ti uger gamle, 20-25 g, i en dyr bolig facilitet femten dage før hvert forsøg. Hus dem i ventilerede bokse, der er holdt i en beskyttet, temperatur (22 ° C) og fugtighed (50%) kontrolleret rum, med 12 timer tænd/sluk lys cyklus.<...

<ol>
	<li>B&#252;scher, P., Cecchi, G., Jamonneau, V., Priotto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+African+trypanosomiasis.">Human African trypanosomiasis.</a> Lancet. 390 (10110), 2397-2409 (2017).</li><li>Lejon, V., Bentivoglio, M., Franco, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+African+trypanosomiasis.">Human African trypanosomiasis.</a> Handbook of Clinical Neurology. 114, 169-181 (2013).</li><li>Giordani, F., Morrison, L. J., Rowan, T. G., De Koning, H. P., Barrett, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+animal+trypanosomiases+and+their+chemotherapy:+a+review.">The animal trypanosomiases and their chemotherapy: a review.</a> Parasitology. 143 (14), 1862-1889 (2016).</li><li>Aksoy, S., Buscher, P., Lehane, M., Solano, P., Van Den Abbeele, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+African+trypanosomiasis+control:+Achievements+and+challenges.">Human African trypanosomiasis control: Achievements and challenges.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (4), e0005454 (2017).</li><li>B&#252;scher, P., Deborggraeve, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+can+molecular+diagnostics+contribute+to+the+elimination+of+human+African+trypanosomiasis?.">How can molecular diagnostics contribute to the elimination of human African trypanosomiasis?.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (5), 607-615 (2015).</li><li>Truc, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atypical+human+infections+by+animal+trypanosomes.">Atypical human infections by animal trypanosomes.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (9), e2256 (2013).</li><li>Lumsden, W. H., Kimber, C. D., Evans, D. A., Doig, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosoma+brucei:+miniature+anion-exchange+centrifugation+technique+for+detection+of+low+parasitaemias:+adaptation+for+field+use.">Trypanosoma brucei: miniature anion-exchange centrifugation technique for detection of low parasitaemias: adaptation for field use.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (3), 312-317 (1979).</li><li>B&#252;scher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Models+of+Mini+Anion+Exchange+Centrifugation+Technique+(mAECT)+and+Modified+Single+Centrifugation+(MSC)+for+sleeping+sickness+diagnosis+and+staging.">Improved Models of Mini Anion Exchange Centrifugation Technique (mAECT) and Modified Single Centrifugation (MSC) for sleeping sickness diagnosis and staging.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (11), e471 (2009).</li><li>Lanham, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+trypanosomes+from+the+blood+of+infected+rats+and+mice+by+anion-exchangers.">Separation of trypanosomes from the blood of infected rats and mice by anion-exchangers.</a> Nature. 218 (5148), 1273-1274 (1968).</li><li>Lanham, S. M., Godfrey, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+salivarian+trypanosomes+from+man+and+other+mammals+using+DEAE-cellulose.">Isolation of salivarian trypanosomes from man and other mammals using DEAE-cellulose.</a> Experimental Parasitology. 28 (3), 521-534 (1970).</li><li>Humphrey, P. A., Ashraf, M., Lee, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+trypanosomes+in+vivo,+host+body+weight+gains,+and+food+consumption+in+zinc-deficient+mice.">Growth of trypanosomes in vivo, host body weight gains, and food consumption in zinc-deficient mice.</a> Journal of the National Medical Association. 89 (1), 48-56 (1997).</li><li>Lowry, J. E., Leonhardt, J. A., Yao, C., Belden, E. L., Andrews, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+C57BL/6+mice+by+Trypanosoma+musculi+modulates+host+immune+responses+during+Brucella+abortus+cocolonization.">Infection of C57BL/6 mice by Trypanosoma musculi modulates host immune responses during Brucella abortus cocolonization.</a> Journal of Wildlife Diseases. 50 (1), 11-20 (2014).</li><li>Vincendeau, P., Da&#235;ron, M., Daulouede, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+antibody+classes+and+Fc+receptors+responsible+for+phagocytosis+of+Trypanosoma+musculi+by+mouse+macrophages.">Identification of antibody classes and Fc receptors responsible for phagocytosis of Trypanosoma musculi by mouse macrophages.</a> Infection and Immunity. 53 (3), 600-605 (1986).</li><li>Vincendeau, P., Da&#235;ron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosoma+musculi+co-express+several+receptors+binding+rodent+IgM,+IgE,+and+IgG+subclasses.">Trypanosoma musculi co-express several receptors binding rodent IgM, IgE, and IgG subclasses.</a> Journal of Immunology. 142 (5), 1702-1709 (1989).</li><li>Holzmuller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+and+pathogenicity+patterns+of+Trypanosoma+bruceigambiense+field+isolates+in+experimentally+infected+mouse:+differences+in+host+immune+response+modulation+by+secretome+and+proteomics.">Virulence and pathogenicity patterns of Trypanosoma bruceigambiense field isolates in experimentally infected mouse: differences in host immune response modulation by secretome and proteomics.</a> Microbes and Infections. 10 (1), 79-86 (2008).</li><li>Holzmuller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+parasites+and+their+excreted-secreted+factors+modulate+the+inducible+metabolism+of+L-arginine+in+macrophages?.">How do parasites and their excreted-secreted factors modulate the inducible metabolism of L-arginine in macrophages?.</a> Frontiers in Immunology. 9, 778 (2018).</li><li>Abrahamson, I. A., Da Silva, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-dependent+cytotoxicity+against+Trypanosoma+cruzi.">Antibody-dependent cytotoxicity against Trypanosoma cruzi.</a> Parasitology. 75 (3), 317-323 (1977).</li><li>Herbert, W. J., Lumsden, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosoma+brucei:+a+rapid+&amp;#34;matching&amp;#34;+method+for+estimating+the+host's+parasitemia.">Trypanosoma brucei: a rapid &amp;#34;matching&amp;#34; method for estimating the host's parasitemia.</a> Experimental Parasitology. 40 (3), 427-431 (1976).</li><li>Dauchy, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosoma+brucei+CYP51:+Essentiality+and+Targeting+Therapy+in+an+Experimental+Model.">Trypanosoma brucei CYP51: Essentiality and Targeting Therapy in an Experimental Model.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (11), e0005125 (2016).</li><li>Raz, B., Iten, M., Grether-B&#252;hler, Y., Kaminsky, R., Brun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Alamar+Blue+assay+to+determine+drug+sensitivity+of+African+trypanosomes+(T.+b.+rhodesiense+and+T.+b.+gambiense)+in+vitro.">The Alamar Blue assay to determine drug sensitivity of African trypanosomes (T. b. rhodesiense and T. b. gambiense) in vitro.</a> Acta Tropica. 68 (2), 139-147 (1997).</li><li>Albright, J. W., Albright, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+growth+of+Trypanosoma+musculi+in+cell-free+medium+conditioned+by+rodent+macrophages+and+mercaptoethanol.">In vitro growth of Trypanosoma musculi in cell-free medium conditioned by rodent macrophages and mercaptoethanol.</a> International Journal for Parasitology. 10 (2), 137-142 (1980).</li><li>Gobert, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-Arginine+availability+modulates+local+nitric+oxide+production+and+parasite+killing+in+experimental+trypanosomiasis.">L-Arginine availability modulates local nitric oxide production and parasite killing in experimental trypanosomiasis.</a> Infection and Immunity. 68 (8), 4653-4657 (2000).</li><li>De Muylder, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Trypanosoma+brucei+kinesin+heavy+chain+promotes+parasite+growth+by+triggering+host+arginase+activity.">A Trypanosoma brucei kinesin heavy chain promotes parasite growth by triggering host arginase activity.</a> PLoS Pathogens. 9 (10), e1003731 (2013).</li><li>Nzoumbou-Boko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosoma+musculi+Infection+in+Mice+Critically+Relies+on+Mannose+Receptor-Mediated+Arginase+Induction+by+a+TbKHC1+Kinesin+H+Chain+Homolog.">Trypanosoma musculi Infection in Mice Critically Relies on Mannose Receptor-Mediated Arginase Induction by a TbKHC1 Kinesin H Chain Homolog.</a> Journal of Immunology. 199 (5), 1762-1771 (2017).</li><li>Bonhivers, M., Nowacki, S., Landrein, N., Robinson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+the+trypanosome+endo-exocytotic+organelle+is+cytoskeleton+mediated.">Biogenesis of the trypanosome endo-exocytotic organelle is cytoskeleton mediated.</a> PLoS Biology. 6 (5), e105 (2008).</li><li>Albisetti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+the+flagellar+pocket+collar+and+the+hook+complex+via+a+novel+microtubule-binding+protein+in+Trypanosoma+brucei.">Interaction between the flagellar pocket collar and the hook complex via a novel microtubule-binding protein in Trypanosoma brucei.</a> PLoS Pathogens. 13 (11), e1006710 (2017).</li><li>Cross, G. A. M., Klein, R. A., Linstead, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+amino+acids+by+Trypanosoma+brucei+in+culture:+L-threonine+as+a+precursor+for+acetate.">Utilization of amino acids by Trypanosoma brucei in culture: L-threonine as a precursor for acetate.</a> Parasitology. 71 (2), 311-326 (1975).</li><li>Bringaud, F., Rivi&#232;re, L., Coustou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+of+trypanosomatids:+adaptation+to+available+carbon+sources.">Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 149 (1), 1-9 (2006).</li><li>Mazet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+central+metabolism+of+the+bloodstream+forms+of+Trypanosoma+brucei:+production+of+acetate+in+the+mitochondrion+is+essential+for+the+parasite+viability.">Revisiting the central metabolism of the bloodstream forms of Trypanosoma brucei: production of acetate in the mitochondrion is essential for the parasite viability.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (12), e2587 (2013).</li><li>Coutton, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+CFAP43+and+CFAP44+cause+male+infertility+and+flagellum+defects+in+Trypanosoma+and+human.">Mutations in CFAP43 and CFAP44 cause male infertility and flagellum defects in Trypanosoma and human.</a> Nature Communications. 9 (1), 686 (2018).</li><li>Cnops, J., Magez, S., De Trez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escape+mechanisms+of+African+trypanosomes:+Why+trypanosomosis+is+keeping+us+awake.">Escape mechanisms of African trypanosomes: Why trypanosomosis is keeping us awake.</a> Parasitology. 142 (3), 417-427 (2015).</li><li>Barrett, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-Based+Approaches+to+the+Isolation+of+African+Trypanosomes.">Microfluidics-Based Approaches to the Isolation of African Trypanosomes.</a> Pathogens. 6 (4), (2017).</li><li>Taylor, A. E., Lanham, S. M., Williams, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+methods+of+preparation+on+the+infectivity,+agglutination,+activity,+and+ultrastructure+of+bloodstream+trypanosomes.">Influence of methods of preparation on the infectivity, agglutination, activity, and ultrastructure of bloodstream trypanosomes.</a> Experimental Parasitology. 35 (2), 196-208 (1974).</li><li>Gutteridge, W. E., Cover, B., Gaborak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+blood+and+intracellular+forms+of+Trypanosoma+cruzi+from+rats+and+other+rodents+and+preliminary+studies+of+their+metabolism.">Isolation of blood and intracellular forms of Trypanosoma cruzi from rats and other rodents and preliminary studies of their metabolism.</a> Parasitology. 76 (2), 159-176 (1978).</li><li>Cruz-Saavedra, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Trypanosoma+cruzi+metacyclic+trypomastigotes+by+ion+exchange+chromatography+in+sepharose-DEAE,+a+novel+methodology+for+host-pathogen+interaction+studies.">Purification of Trypanosoma cruzi metacyclic trypomastigotes by ion exchange chromatography in sepharose-DEAE, a novel methodology for host-pathogen interaction studies.</a> Journal of Microbiological Methods. 142, 27-32 (2017).</li><li>Lemesre, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+protection+against+canine+visceral+leishmaniasis+using+the+LiESAp-MDP+vaccine+in+endemic+areas+of+France:+double-blind+randomised+efficacy+field+trial.">Long-lasting protection against canine visceral leishmaniasis using the LiESAp-MDP vaccine in endemic areas of France: double-blind randomised efficacy field trial.</a> Vaccine. 25 (21), 4223-4234 (2007).</li></ol>

Renset trypanosomes repræsenterer et stærkt middel til at studere immunologi, biokemi, cellulær og molekylær biologi. Store vidder af data og resultater er opnået ved trypanosomes, som derefter har bidraget til at indhente oplysninger fra andre eukaryote celler30. Trypanosomes er også genstand for vigtigt og interessant forskning, fordi de har udtænkt utallige mekanismer, der tillader dem at overleve og vokse i to meget forskellige miljøer: tsetsefluen vektor og pattedyr vært<sup class="x...

Metoden fremlægges beskrevet her giver mulighed for adskillelse af trypanosomes, parasitter ansvarlig for dyrs og menneskers afrikanske trypanosomiasis (HAT), fra blodet. Dette er den bedste metode til diagnosticering af første etape HAT og desuden denne parasit rensning metode tillader robust serologiske og forskning undersøgelse.
HAT er forårsaget af tsetsefluen overføres Trypanosoma brucei gambiense og T. b. rhodesiense1. Disse protozo parasitter formere extracellularly i blodbanen, lymfeknuder og interstitielle væsker under den første fase af sygdommen (hemolymphatic fase). Den anden fase (meningoencephalitic fase) begynder når parasitter krydse blod-hjerne barrieren; neurologiske tegn, herunder en søvnforstyrrelse, der har givet sit navn "sovesyge" til denne sygdom, er typisk for denne anden fase2. Relaterede trypanosomes (T. evansi, T. congolense, T. vivax, T. b. brucei) er de agenser af animalsk afrikanske trypanosomosis (AAT)3.
Verdenssundhedsorganisationen (WHO) har til formål at eliminere HAT som et offentligt sundhedsproblem i 2020 og stoppe transmission af 20304. Den nylige indførelse af hurtige diagnose tests har forbedret serologiske diagnosticering1,4,5. Adskillige molekylære diagnostiske tests er blevet udviklet, men deres rolle i feltet diagnostik er endnu ikke blevet etableret5. De bruges til at identificere underarter af brucei gruppe og atypiske trypanosomiasis forårsaget af parasitter ansvarlig for animalske trypanosomosis6.
Påvisning af parasitten er afgørende for diagnose, behandling og opfølgning, som serum kan give falsk positive og desværre falske negative resultater1. Den direkte mikroskopiske observation af disse hemoflagellate protister er vanskeligt i HAT sager, der er forårsaget af T. b. gambiense, (mere end 95% af tilfældene), som lav parasitemias er reglen, for HAT som følge af T. b. rhodesiense, en stor antallet af parasitter er ofte til stede i blodet. Forskellige koncentration teknikker har været brugt som tyk drop og kapillarrør centrifugering (CTC), men adskillelse af parasitter blod af en kolonne af anionbytter (DEAE cellulose) efterfulgt af centrifugering og mikroskopiske observation af den pellet, er den mest følsomme metode (ca. 50 parasitter/mL blod kan detekteres)1,7. Rensning af trypanosomes af denne anion-vekslere (DEAE cellulose) metode er derfor bedst, og til dato er referencemetoden for visualisering og isolere parasitter fra blod til HAT diagnose. I marken, en mini kolonne af DEAE cellulose held har været anvendt og flere forbedringer har fremmet mikroskopiske observation7,8.
Metoden trypanosome adskillelse fra blod, beskrevet nedenfor, afhænger af parasitten overflade afgift, som er mindre negative end pattedyr blodlegemer9. Interessant, denne metode blev udviklet for 50 år siden, i 1968 af Dr. Sheila Lanham, og stadig er guld standard for påvisning og forberedelse af blodbanen trypanosomes. Det er hurtigt og reproducerbare for salivarian trypanosomes fra en bred vifte af pattedyr, tillader diagnosticering af både dyrs og menneskers trypanosomiasis10.
For at opnå levende, renset parasitter, er inficeret blod tilføjet en anionbytteren kolonne. Kromatografi betingelser (hovedsagelig pH-Ioniske styrken af buffere/media) skal tilpasses til hver trypanosome arter, og mere generelt, at hver blanding af pattedyr blodlegemer og trypanosomes10. Eluering buffer er netop indstillet til pH 8 for de fleste afrikanske trypanosomes10. Denne metode favoriserer koncentrationen af parasitter fundet i blodet hos patienter, fordi parasitemias kan være for lav til at blive opdaget af mikroskopiske observation alene, og det giver også mulighed for laboratorieundersøgelser. Arbejde med frisk isoleret trypanosomes og på blodet fra smittede dyr, ved hjælp af denne teknik, er mere relevant for forskellige undersøgelser end undersøgelser med parasitter, der har været kulturperler i axenic betingelser i laboratoriet på ubestemt tid.
Vært-parasit relationer er bedst studeret hos en parasit inficere sin naturlige vært, derfor, T. musculi, en naturlig murine parasit, som er repræsentant for ekstracellulære trypanosomes, har mange fordele som murine infektion omfatter i en lille laboratorium animalsk og gør ikke forlange biohazard niveau (BSL) sikkerhedsforhold. T. musculi dræbe ikke immunkompetente mus, i modsætning til mange andre Trypanosoma arter, herunder menneskelige patogener. T. musculi elimineres ikke i T-celle-berøvet mus og parasitemias kan øges i inficerede mus ved at ændre fødevarer og næringsstoffer indtagelse11. Denne parasit modulerer immunrespons i co-infektioner med andre patogener12. T. musculi fra inficerede mus udviser forskelle fra kulturperler T. musculi, for eksempel udtryk for Fc membranreceptorer er tabt i T. musculi axenic kulturer, i forhold til parasitter renset fra inficerede mus13 , 14. Excreted-udskilles faktorer (ESF) er også kvalitativt og kvantitativt mindre udtrykt i axenic trypanosome kulturer og varierer mellem isolerede i endemiske områder15stammer. ESF er de første antigener til at blive vist på vært immunsystemet og så spiller en vigtig rolle i den oprindelige vært immunrespons16.
I eksperimentelt inficerede dyr for laboratorieundersøgelser letter denne protokol eksperimenter på et større antal parasitter, minimere antallet af mus kræves især når du bruger immunosuppressed dyr. De variant overflade glykoproteiner (VSGs), der anvendes i kortet-agglutinationstest for Trypanosomiasis (Karina) i masse screening er stadig renset fra trypanosomes, som er opformeret i rotter. De to hurtige diagnostiske test (individuelt indpakkede kassetter), er nu tilgængelige til brug i feltet stadig bruger en smitsom model kilde til native VSGs og ikke i vitro kulturperler trypanosomes1,4, 5. avancement i undersøgelsen af trypanosome immunologi og biologi er blevet fremmet, da disse DEAE cellulose renset parasitter kan opnås nemt, i store mængder fra naturligt eller eksperimentelt inficerede værter, og i særdeleshed gnavere.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1036px;" width="1036">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">10 mL Pipettes&#160;</td>
			<td style="width:381px;">Falcon</td>
			<td style="width:184px;">357,551</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">2 mL Pipettes&#160;</td>
			<td style="width:381px;">Falcon</td>
			<td style="width:184px;">352,507</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Centrifugation tube 50 mL</td>
			<td style="width:381px;">Falcon</td>
			<td style="width:184px;">352,070</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:381px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">4K15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">DEAE cellulose</td>
			<td style="width:381px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:184px;">s/c- 211213</td>
			<td>100 G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">filter paper&#160;</td>
			<td style="width:381px;">Whatman</td>
			<td style="width:184px;">1,001,125</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Flat bottom flask narrow neck</td>
			<td style="width:381px;">Duran</td>
			<td style="width:184px;">21 711 76</td>
			<td style="width:172px;">6000 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Glucose&#160;</td>
			<td style="width:381px;">VWR</td>
			<td style="width:184px;">101174Y</td>
			<td>500 G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Heparin</td>
			<td style="width:381px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">H3149-50KU</td>
			<td>5 000 U</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:299px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:381px;">VWR</td>
			<td style="width:184px;">120 26936.260</td>
			<td>500 G</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:299px;">Microscope</td>
			<td style="width:381px;">Olympus</td>
			<td style="width:184px;">CH-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope coverslips</td>
			<td style="width:381px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:184px;">CB00100RA020MNT0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:381px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:184px;">AGAA000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:299px;">Na2HPO4&#160;</td>
			<td style="width:381px;">VWR</td>
			<td style="width:184px;">100 28026;260</td>
			<td>500 G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">NaCl</td>
			<td style="width:381px;">VWR</td>
			<td style="width:184px;">27800.291</td>
			<td>1 KG</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:299px;">NaH2PO4&#160;</td>
			<td style="width:381px;">VWR</td>
			<td style="width:184px;">110 33616;262</td>
			<td>500 G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Nalgene Plastic Media Bottles size 125 mL</td>
			<td style="width:381px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:184px;">342024-0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Nalgene Plastic Media Bottles size 500 mL</td>
			<td style="width:381px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:184px;">342024-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Pasteur Pipette</td>
			<td style="width:381px;">VWR</td>
			<td style="width:184px;">BRND125400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Penicillin 10,000 UI/Streptomycin 10,000 &#181;g</td>
			<td style="width:381px;">EUROBIO</td>
			<td style="width:184px;">CABPES01 OU</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Phenol red</td>
			<td style="width:381px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">P0290</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Syringue&#160;</td>
			<td style="width:381px;">Dutscher</td>
			<td style="width:184px;">SS+10S21381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Tissue culture hood</td>
			<td style="width:381px;">Thermoelectro Corporation</td>
			<td style="width:184px;">MSC-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Trypanosoma brucei brucei</td>
			<td style="width:381px;">Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium).</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td>ANTAT 1.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Trypanosoma brucei gambiense</td>
			<td style="width:381px;">Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium).</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td>ITMAP 1893</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Trypanosoma musculi</td>
			<td>London School of Hygiene and Tropical Medicine (UK)</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td>Partinico II</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of extracellular trypanosomes, including african, from blood by anion-exchangers (diethylaminoethyl-cellulose columns)

Denne metode giver mulighed for adskillelse af trypanosomes, parasitter ansvarlig for dyrs og menneskers afrikanske trypanosomiasis (HAT), fra inficeret blod. Dette er den bedste metode til diagnosticering af første etape HAT og desuden denne parasit rensning metode tillader serologiske og forskning undersøgelser.
HAT er forårsaget af tsetsefluen overføres Trypanosoma brucei gambiense og T. b. rhodesiense. Relaterede trypanosomes er animalske trypanosomiasis agenser. Registrering af trypanosome er afgørende for HAT diagnose, behandling og opfølgning. Den teknik beskrevet her er den mest følsomme parasit opdagelse teknik, tilpasset feltforhold til diagnosticering af T. b. gambiense HAT og kan afsluttes inden for en time. Blod er lagdelt en anionbytteren kolonne (DEAE cellulose) tidligere justeres til pH 8, og eluering buffer er tilføjet. Meget negativt ladede blodlegemer er adsorberet på kolonnen, mens de mindre negativt ladede trypanosomes passere gennem. Indsamlede trypanosomes er pelleted ved centrifugering og observeret ved mikroskopi. Desuden tilberedes parasitter uden cellulære skader, samtidig med at deres smitteevne.
Renset trypanosomes er nødvendige for immunologisk test; de bruges i trypanolysis assay, guldstandarden i HAT serologi. Farvede parasitter er udnyttet i kortet-agglutinationstest (Karina) for feltet serologi. Antigener fra renset trypanosomes, såsom variant overflade glykoprotein, exoantigens, er også brugt i forskellige immunassays. Proceduren beskrevet her er designet til afrikanske trypanosomes; kromatografi betingelser skal derfor tilpasses til hver trypanosome stamme, og mere generelt til blodet af hver art af vært pattedyr.
Disse fascinerende patogener er let renset og tilgængelig til brug i biokemiske, molekylære og Cellens biologi undersøgelser herunder Co kultur med værtsceller at undersøge vært-parasit relationer på niveauet af membranreceptorer, signalering og gen udtryk; Drug test in vitro; undersøgelsen af genet sletning, mutation eller overekspression på metaboliske processer, cytoskeletal Biogenese og parasit overlevelse.

Renset trypanosomes har været anvendt i farmaceutiske prøver. Parasitter der overføres til kultur wells indeholdende serielle fortyndinger af bestemte stoffer, enten alene eller blandet19. Mikroskopiske observationer, evaluere motilitet er en markør for levedygtighed, kan udføres, når kun få dugs er ved at blive testet, mens AlamarBlue celle levedygtighed assay er en fremragende metode for store motilitet assays under stof screening20...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers Diethylaminoethyl-cellulose Columns at JoVE.com

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers Diethylaminoethyl-cellulose Columns

Denne metode til trypanosome adskillelse fra blod afhænger deres overflade afgift er mindre negative end pattedyr blodlegemer. Inficeret blod er placeret og behandles på en anionbytteren kolonne. Denne metode, den mest passende diagnostiske for afrikanske trypanosomiasis, giver renset parasitter for immunologiske, biologiske, biokemiske, farmaceutiske og molekylærbiologiske undersøgelser.

Rensning af ekstracellulære Trypanosomes, herunder Afrika, fra blod af Anion-vekslere (Diethylaminoethyl-cellulose kolonner)

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is ...

Afrikanske trypanosoms er ansvarlige for humanafrikanske trypanosomiasis, eller sovesyge og dyr afrikanske trypanosomiasis. De trypanosomer, der forårsager sovesyge er tsetse flyve overføres protist parasitter til stede i mange geografiske foci i Afrika syd for Sahara. Påvisning af parasitten er afgørende for diagnose, behandling og opfølgning.En serologi kan give falske positive og desværre falske negative resultater. For at hjælpe afsløring i blodet, trypanosomes skal koncentreres. Forskellige parasitkoncentrationsteknikker er blevet anvendt.Den mest følsomme metode er adskillelsen af parasitter fra blod med en kolonne af anionbytter, DEAE cellulose efterfulgt af centrifugering og mikroskopisk observation. Derfor er DEAE cellulose metoden den bedste og rester til dato, referencemetoden til visualisering og isolering af parasitter fra blod til human afrikansk trypanosomiasis diagnose, især i feltbetingelser. Denne metode, den mest passende diagnostiske for afrikansk trypanosomiasis giver også renset parasitter til immunologiske, biologiske, biokemiske, farmaceutiske og molekylære biologiske undersøgelser.Alle undersøgelser er i overensstemmelse med vejledningen om pleje og anvendelse af laboratoriedyr, og de franske myndigheder har opnået enighed, og alle de anvendte protokoller er blevet godkendt af vores lokale etiske komité. Hvert stof afvejes i henhold til den skriftlige protokol. Tilsæt destilleret vand og juster præcist til pH 8 med kaliumdihydrogenphosphat for at gøre følgende bufferopløsninger, koncentreret fosfatbuffer saltvand 2X.Tilsæt destilleret vand og glukose til fosfat buffered saltvandsglose. For 100 milliliter elution buffer, tilsættes 100 enheder pr. milliliter penicillin, 100 mikrogram pr. milliliter streptomycin og fem mikrogram milliliter phenolrød til fosfat bufferet saltvandsglukose. 100 gram DEAE cellulose vaskes først med tre liter destilleret vand og derefter til venstre for at bosætte sig.Fine partikler kasseres. Vaskene gentages, indtil supernatanten er klar. Koncentreret fosfat buffered saltvand 2X tilsættes, og DEAE cellulose omrøres.PH justeres til otte med et kindtand kaliumphosphat. Cellulose vaskes derefter to gange med destilleret vand og to gange med fosfat buffered saltvandsglose. DEAE cellulose og fosfat buffered saltvandsglose blandes i lige store mængder.Legeret kvartet og opbevares ved stuetemperatur eller fire grader celsius eller ved minus 20 grader celsius til længerevarende opbevaring. Trypanosom inficeret blod er gemt i flydende kvælstof. En legeringsquart på en milliliter optøes ved stuetemperatur.Parasitter indsamles omhyggeligt fra kryotuben ved hjælp af en nål og en en milliliter sprøjte. Levedygtigheden af optøede parasitter vurderes ud fra motiliteten som visualiseret ved lysmikroskopiobservation før infektion. Parasitter injiceres i bughulen af to mus, 500 mikroliter pr mus.Hver dag efter infektion, parasitæmi vurderes ved at indsamle en dråbe blod fra halen med en nål og kontrolleres ved mikroskopi. Når parasitæmien er på et passende niveau, indsamles inficeret blod. En 10 milliliter sprøjte understøttes i en klemme eller holder og en precut stykke filterpapir tilsættes.Tilberedt DEAE cellulose hældes i sprøjten op til 8 eller 9 milliliter niveau. Kolonnen vaskes med elutionbufferen. To milliliter inficeret blod placeres omhyggeligt oven på kolonnen, og trypanosomer opsamles i kolonnen eluate i et 50 milliliter centrifugeringsrør.Elution buffer er regelmæssigt tilføjet i henhold til transit af trypanosomes. Transit af trypanosomes gennem kolonnen kontrolleres ved at tage en dråbe kolonne eluat med jævne mellemrum og observere for trypanosomes ved hjælp af lys mikroskopi. Når trypanosomer ikke længere observeres i eluatet, centrifugeres det koniske rør ved 1, 800 gange G i 10 minutter ved fire grader celsius.Supernatanten kasseres, og trypanosomer i pallen tælles med et hæmocytometer. Indsamlede trypisomer fortyndes efterfølgende i det medium, der kræves til den planlagte undersøgelse. Denne metode, den mest passende diagnostiske for afrikansk trypanosomiasis giver renset parasitter til immunologiske, biologiske, biokemiske, farmaceutiske og molekylære biologiske undersøgelser.Disse undersøgelser er blevet udviklet, fordi DEAE cellulose rensede parasitter let kan opnås i store mængder fra naturligt eller eksperimentelt inficerede værter og især gnavere. Trypanosome levedygtighed i nærværelse af farmaceutiske midler vurderes ved mikroskopisk observation. Parasit levedygtighed er forbundet med motilitet og derfor kan kontrolleres med øjet under et let mikroskop på 40 gange eller højere forstørrelse.Parasittens levedygtighed vurderes ved at måle procentdelen af motile former. Fortyndinger af testforbindelser tilsættes i hver brønd af en 96 godt væv kultur plade, mens kontrol brønde er mock behandlet. Hver koncentration vurderes i tre eksemplarer.Antallet af levedygtige parasitter for hver fortynding sammenlignes med antallet af parasitter i kontrolbb brønde. Virkningerne af Pentamidin, et referencestof, der anvendes i human afrikansk trypanosomiasis terapi vises i dette tal. Trypanosome makrofag co-kulturer tillader undersøgelse af vært parasit interaktion på celleniveau.I makrofag parasit co-kulturer, ekstra cellulære trypanosoms fremkalde produktion af makrofag arginase at hydrolyserer arginin til ornithin. Ornithin er forløberen for polyaminer og trypanothion, afgørende for parasit overlevelse og vækst. Desuden, arginin udtynding nedsætter produktionen af trypanocidal nitrogenoxid.Efterfølgende, tilsætning af en arginase hæmmer, S-L-Cystein til co-kulturer dramatisk reducerer makrofag induceret parasit vækst. Arginase induktion er medieret af trypanosom udskilles og eller udskilles faktorer. Denne arginase inducerende faktor er blevet identificeret som en orthine kinesin.Kinesinen binder sig til C-type lectin mannose bindende receptorer. Arginase er induceret og producerer ornithin, som favoriserer parasit vækst. Arginase er ikke induceret af kinesin i makrofager dyrket med 12,5 millimolar mannose eller i makrofager fra mus, hvor makrofagen mannose receptorer er blevet slettet.Yderligere eksempler på cellebiologi og biokemiske eksperimenter ved hjælp af DAEA cellulose renset trypanosoms er påvist i undersøgelser, hvor nye cytoskeletale proteiner såsom BILBO1 er blevet identificeret. BILBO1 er nødvendig for biogenese af vigtige cytoskeletale strukturer og parasit overlevelse. Således, BILBO1 repræsenterer et vigtigt mål for intervention i patogene trypanosoms.Et billede, der viser immunoflourescence mærkning af en blodbanen kultur form, trypanosoma brucei celle probed med en anti-BILBO1 antistof er vist i dette tal. Derudover er glukose og threonin metabolisme blevet beskrevet ved hjælp af DEAE cellulose renset trypanosoms og de enzymer, der er involveret i disse processer er blevet eksperimentelt valideret. En skematisk repræsentation af glukose og threonen metabolisme i blodbanen-dannede trypanosoms er vist i dette tal.Rensning af afrikanske trypanosoms fra blod ved anion udvekslinger DEAE cellulose kolonner med de seneste forbedringer er fortsat guldstandarden for trypanosom påvisning, ikke kun i naturlige værter med lav parasitæmi i endemiske områder, men også for kravet om parasitter i stort antal til eksperimentelle undersøgelser. Undersøgelser har gjort det muligt at identificere trypanosom molekyler spiller væsentlige roller i parasit overlevelse og vækst. Identificerede mål kan danne grundlag for en fremtidig vaccine med potentielle antigener for både mennesker og dyr i en én sundhedstilgang.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers (Diethylaminoethyl-cellulose Columns)

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Oprensning og visualisering af lipopolysaccharid fra Gram-negative bakterier ved varm vandig-phenolekstraktion

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Oprensning af Patogen vakuoler fra<em&gt; Legionella</em&gt;-Inficerede Fagocytter

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Antigener Beskyttet Funktionelle røde blodlegemer ved The Membrane podning af Compact hyperforgrenet Polyglyceroler

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Bioluminescens Imaging Detect Late Stage Infektion af afrikansk trypanosomiasis

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dextran effektiviserer Lentiviral transduktion af Murine og menneskelige primære NK-celler

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...