Name: purification of extracellular trypanosomes, including african, from blood by anion-exchangers (diethylaminoethyl-cellulose columns)
Uploaded: 2019-04-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers Diethylaminoethyl-cellulose Columns at JoVE.com

Wir danken allen Mitgliedern der UMR 177 INTERTRYP IRD CIRAD Université de Bordeaux. Diese Forschung wurde unterstützt durch die interne Finanzierung von Universität von Bordeaux und Unterstützung durch die ANR, LABEX ParaFrap ANR-11-LABX-0024, und von der Association pour le Développement De La recherche de Parasitologie et Médecine Tropicale und der Service de Coopération et d ' Action Culturelle de l'Ambassade de France À Bangui (Centrafrique).

Untersuchungen gemäß den Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren (NIH Publikation Nr. 85±23, revidiert 1996). Protokolle wurden von unseren lokalen Ethikkommission genehmigt.
(1) Tiere
<ol><li>Halten Sie weibliche Schweizer (von 1) Mäuse im Alter von acht bis zehn Wochen alt, 20-25 g, bei einem Tier Gehäuse Anlage 15 Tage vor jedem Experiment. Beherbergen sie in belüfteten Boxen, die in einem geschützten, Temperatur (22 ° C) und Luftfeuchtigkeit (50 %) gehal...

<ol>
	<li>B&#252;scher, P., Cecchi, G., Jamonneau, V., Priotto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+African+trypanosomiasis.">Human African trypanosomiasis.</a> Lancet. 390 (10110), 2397-2409 (2017).</li><li>Lejon, V., Bentivoglio, M., Franco, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+African+trypanosomiasis.">Human African trypanosomiasis.</a> Handbook of Clinical Neurology. 114, 169-181 (2013).</li><li>Giordani, F., Morrison, L. J., Rowan, T. G., De Koning, H. P., Barrett, M. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+protection+against+canine+visceral+leishmaniasis+using+the+LiESAp-MDP+vaccine+in+endemic+areas+of+France:+double-blind+randomised+efficacy+field+trial.">Long-lasting protection against canine visceral leishmaniasis using the LiESAp-MDP vaccine in endemic areas of France: double-blind randomised efficacy field trial.</a> Vaccine. 25 (21), 4223-4234 (2007).</li></ol>

Gereinigte Trypanosomen sind ein mächtiges Mittel, Immunologie, Biochemie, zelluläre und molekulare Biologie zu studieren. Große Flächen von Daten und Ergebnissen erhielten von Trypanosomen, die hat dann dazu beigetragen, andere eukaryotische Zellen30Informationen einzuholen. Trypanosomen sind auch Gegenstand der Forschung wichtig und interessant, weil sie zahlreiche Mechanismen, die ihnen ermöglichen entwickelt haben, zu überleben und wachsen in zwei sehr unterschiedlichen Umgebungen: die T...

Die vorgestellte Methode beschrieben hier ermöglicht die Trennung von Trypanosomen, Parasiten verantwortlich für tierische und menschliche afrikanische Trypanosomiasis (Hut), aus Blut. Dies ist die beste Methode für die Diagnose der ersten Phase HAT und außerdem ermöglicht dieser Parasit Reinigungsverfahren robuste serologische und Forschung Untersuchung.
Hut, verursacht durch Tsetse-Fliege übertragen Trypanosomen Trypanosomen rhodesiense und T. B. Rhodesiense1. Diese Protozoen Parasiten vermehren extrazellulär in Blut, Lymphe und interstitiellen Flüssigkeiten in der ersten Phase der Erkrankung (hemolymphatic Stadium). Die zweite Stufe (meningoencephalitic Stadium) beginnt, wenn die Parasiten die Blut-Hirn-Schranke überqueren; neurologische Symptome, einschließlich einer Schlafstörung, die seinen Namen "Schlafkrankheit" dieser Krankheit gegeben hat, sind typisch für diese zweite Stufe2. Damit verbundenen Trypanosomen (T. Evansi, T. Congolense, T. Vivax, T. B. Trypanosomen) sind die Erreger der afrikanischen Trypanosomosen (AAT)3Tier.
Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) zielt darauf ab, Hut als Problem der öffentlichen Gesundheit bis zum Jahr 2020 zu beseitigen und Übertragung von 20304zu stoppen. Die kürzlich erfolgten Einführung der raschen Diagnosetests hat verbesserte serologische Diagnostik1,4,5. Wurden mehrere molekulare Diagnostik entwickelt, aber ihre Rolle im Bereich Diagnostik wurde noch nicht etablierten5. Sie werden verwendet, um die Unterarten der Trypanosomen -Gruppe und atypische Trypanosomiasis verursacht durch Parasiten verantwortlich für tierische Trypanosomosen6zu identifizieren.
Die Erkennung des Parasiten ist wichtig für die Diagnose, Behandlung und Nachsorge, da Serologie falsch positive und leider falsch-negative Ergebnisse1geben kann. Die direkte mikroskopische Beobachtung von diesen Hemoflagellate Protisten ist schwierig in Hut-Fällen, die von T. B. rhodesiense, (mehr als 95 % der Fälle) verursacht werden können, wie niedrige Parasitemias die Regel sind, während T. B. Rhodesiense, einen großen Hut durch Anzahl der Parasiten sind häufig im Blut vorhanden. Verschiedene Techniken der Konzentration verwendet worden sind, wie dicke Tropfen und Kapillarrohr Zentrifugation (CTC), aber die Trennung der Parasiten von Blut durch eine Spalte der Anionen-Austauscher (DEAE Zellulose) gefolgt von Zentrifugation und mikroskopische Beobachtung von der Pellet, ist die empfindlichste Methode (rund 50 Parasiten/mL Blut nachweisbar)1,7. Folglich ist die Reinigung der Trypanosomen Anionen-Austauscher (DEAE Zellulose) dadurch das beste und bis heute ist die Referenzmethode zur Visualisierung und Parasiten aus Blut für Hut-Diagnose zu isolieren. Unter Feldbedingungen eine Mini-Spalte der DEAE Cellulose erfolgreich eingesetzt und mehrere Verbesserungen konnten mikroskopischen Beobachtung7,8.
Die Methode der Trypanosomen Trennung von Blut, wie unten beschrieben, hängt Parasit Oberflächenladung, die weniger negativ als Blut Säugerzellen9ist. Interessanterweise ist diese Methode entwickelte sich vor 50 Jahren, im Jahr 1968 von Dr. Sheila Lanham, und bleibt der Goldstandard für Erkennung und Vorbereitung der Trypanosomen Blutbahn. Es ist schnell und reproduzierbar für Salivarian Trypanosomen aus einer Vielzahl von Säugetieren, erlaubt die Diagnose sowohl tierische und menschliche Trypanosomiasis10.
Um lebendige, gereinigten Parasiten zu erhalten, wird infiziertes Blut auf ein Anion-Exchanger-Spalte hinzugefügt. Chromatographie-Bedingungen (vor allem pH-Wert, Ionenstärke der Puffer/Medien) müssen für die einzelnen Trypanosomen-Arten, und ganz allgemein für jede Mischung von Säugerzellen Blut und Trypanosomen10angepasst werden. Elution Buffer ist genau auf pH 8 für die meisten afrikanischen Trypanosomen10eingestellt. Diese Methode begünstigt die Konzentration der Parasiten im Blut von Patienten gefunden, weil Parasitemias zu niedrig, um durch mikroskopische Beobachtung allein erkannt werden können, und es ermöglicht auch Laboruntersuchungen. Arbeiten mit frisch isolierte Trypanosomen und auf das Blut von infizierten Tieren, die mit dieser Technik ist mehr relevant für die verschiedenen Untersuchungen als Studien mit Parasiten, die in axenic Bedingungen im Labor auf unbestimmte Zeit kultiviert wurde.
Wirt-Parasit-Beziehungen sind am besten untersucht mit einem Parasiten infiziert seinen natürlichen Wirt, daher T. Musculi, einen natürlichen murinen Parasiten, die Vertreter der extrazellulären Trypanosomen, hat viele Vorteile, wie in murinen Infektion beinhaltet eine kleinen Versuchstier und erfordert keine Biohazard Sicherheitsbedingungen Niveau (BSL). T. Musculi tötet nicht immunkompetenten Mäusen, im Gegensatz zu vielen anderen Trypanosomen -Arten, einschließlich menschliche Krankheitserreger. T. Musculi entfallen nicht in T-Zell-beraubt Mäuse und Parasitemias kann bei infizierten Mäusen erhöht werden, indem Sie Nahrung und Nährstoff-Aufnahme11ändern. Dieser Parasit moduliert die Immunantwort bei Co-Infektionen mit anderen Krankheitserregern12. T. Musculi von infizierten Mäusen Ausstellung Unterschiede von kultivierten T. Musculi, z. B. der Ausdruck von Membranrezeptoren Fc T. Musculi axenic Kulturen, im Vergleich zu Parasiten gereinigt von infizierten Mäusen13 verliert , 14. Excreted abgesondert Faktoren (ESF) sind auch qualitativ und quantitativ weniger in axenic Trypanosomen Kulturen zum Ausdruck gebracht und unterscheiden sich zwischen den Stämmen in endemischen Gebieten15isoliert. ESF sind die ersten Antigene auf das Immunsystem des Wirts angezeigt werden und so eine wichtige Rolle in der ursprünglichen Host Immunantwort16.
Bei experimentell infizierten Tieren für Laboruntersuchungen erleichtert dieses Protokolls Experimente an einer größeren Anzahl von Parasiten, die Minimierung von Mäusen erforderlich, insbesondere bei Verwendung von immunsupprimierten Tieren. Die Variante Oberfläche Glykoproteine (VSGs), die in der Karte Agglutination Test für Trypanosomiasis (CATT) in Massen-Screening verwendet werden sind noch gereinigt von Trypanosomen, die bei Ratten übertragen werden. Die zwei diagnostische Schnelltests (einzeln verpackte Kassetten), die jetzt verfügbar sind für den Einsatz im Feld, sind immer noch mit einer infektiösen Modell Quelle der native VSGs und nicht in Vitro kultiviert Trypanosomen1,4, 5. der Fortschritt in der Studie der Trypanosomen Immunologie und Biologie wurde erleichtert, da diese DEAE Zellulose gereinigt Parasiten leicht in großen Mengen von natürlich oder experimentell infizierten Hosts und in bestimmten, Nagetiere erzielt werden können.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1036px;" width="1036">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">10 mL Pipettes&#160;</td>
			<td style="width:381px;">Falcon</td>
			<td style="width:184px;">357,551</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">2 mL Pipettes&#160;</td>
			<td style="width:381px;">Falcon</td>
			<td style="width:184px;">352,507</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Centrifugation tube 50 mL</td>
			<td style="width:381px;">Falcon</td>
			<td style="width:184px;">352,070</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:381px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">4K15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">DEAE cellulose</td>
			<td style="width:381px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:184px;">s/c- 211213</td>
			<td>100 G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">filter paper&#160;</td>
			<td style="width:381px;">Whatman</td>
			<td style="width:184px;">1,001,125</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Flat bottom flask narrow neck</td>
			<td style="width:381px;">Duran</td>
			<td style="width:184px;">21 711 76</td>
			<td style="width:172px;">6000 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Glucose&#160;</td>
			<td style="width:381px;">VWR</td>
			<td style="width:184px;">101174Y</td>
			<td>500 G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Heparin</td>
			<td style="width:381px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">H3149-50KU</td>
			<td>5 000 U</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:299px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:381px;">VWR</td>
			<td style="width:184px;">120 26936.260</td>
			<td>500 G</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:299px;">Microscope</td>
			<td style="width:381px;">Olympus</td>
			<td style="width:184px;">CH-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope coverslips</td>
			<td style="width:381px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:184px;">CB00100RA020MNT0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:381px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:184px;">AGAA000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:299px;">Na2HPO4&#160;</td>
			<td style="width:381px;">VWR</td>
			<td style="width:184px;">100 28026;260</td>
			<td>500 G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">NaCl</td>
			<td style="width:381px;">VWR</td>
			<td style="width:184px;">27800.291</td>
			<td>1 KG</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:299px;">NaH2PO4&#160;</td>
			<td style="width:381px;">VWR</td>
			<td style="width:184px;">110 33616;262</td>
			<td>500 G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Nalgene Plastic Media Bottles size 125 mL</td>
			<td style="width:381px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:184px;">342024-0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Nalgene Plastic Media Bottles size 500 mL</td>
			<td style="width:381px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:184px;">342024-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Pasteur Pipette</td>
			<td style="width:381px;">VWR</td>
			<td style="width:184px;">BRND125400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Penicillin 10,000 UI/Streptomycin 10,000 &#181;g</td>
			<td style="width:381px;">EUROBIO</td>
			<td style="width:184px;">CABPES01 OU</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Phenol red</td>
			<td style="width:381px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">P0290</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Syringue&#160;</td>
			<td style="width:381px;">Dutscher</td>
			<td style="width:184px;">SS+10S21381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Tissue culture hood</td>
			<td style="width:381px;">Thermoelectro Corporation</td>
			<td style="width:184px;">MSC-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Trypanosoma brucei brucei</td>
			<td style="width:381px;">Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium).</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td>ANTAT 1.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Trypanosoma brucei gambiense</td>
			<td style="width:381px;">Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium).</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td>ITMAP 1893</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Trypanosoma musculi</td>
			<td>London School of Hygiene and Tropical Medicine (UK)</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td>Partinico II</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of extracellular trypanosomes, including african, from blood by anion-exchangers (diethylaminoethyl-cellulose columns)

Diese Methode ermöglicht die Trennung von Trypanosomen, Parasiten verantwortlich für tierische und menschliche afrikanische Trypanosomiasis (Hut), von infiziertem Blut. Dies ist die beste Methode für die Diagnose der ersten Phase HAT und außerdem dieser Parasit Reinigungsverfahren ermöglicht serologische und Forschung Untersuchungen.
Hut wird durch Tsetse-Fliege übertragen Trypanosomen Trypanosomen rhodesiense verursacht und T. B. Rhodesiense. Damit verbundenen Trypanosomen sind die Erreger der Tier Trypanosomiasis. Trypanosomen-Erkennung ist essentiell für Hut-Diagnose, Behandlung und Nachsorge. Die hier beschriebene Technik ist die empfindlichste Parasit Erkennung Technik, angepasst auf Freilandbedingungen für die Diagnose von T. B. rhodesiense Hut und kann innerhalb einer Stunde abgeschlossen sein. Blut wird auf ein Anion-Exchanger Säule (DEAE Zellulose) vorher eingestellten pH-Wert 8 geschichtet und Elution Puffer hinzugefügt. Stark negativ geladenen Blutzellen werden auf die Säule adsorbiert, während die weniger negativ geladenen Trypanosomen durchlaufen. Gesammelten Trypanosomen sind pelleted durch Zentrifugation und beobachtet von Mikroskopie. Darüber hinaus sind Parasiten ohne Zellschädigung bereit, unter Beibehaltung ihrer Infektiosität.
Gereinigte Trypanosomen sind erforderlich für immunologische Tests; Sie sind in der Trypanolysis-Assay, der Goldstandard in der Hut Serologie eingesetzt. Gefärbte Parasiten sind in der Karte Agglutination Test (CATT) für Feld Serologie genutzt. Antigene von gereinigten Trypanosomen wie Variante Oberfläche Glykoprotein, Exoantigens, sind auch in verschiedenen Immunassays verwendet. Die hier beschriebene Vorgehensweise richtet sich an afrikanischen Trypanosomen; Infolgedessen haben Chromatographie Bedingungen zu jeder Trypanosomen-Stamm, und ganz allgemein an das Blut der einzelnen Arten der Host Säugetier angepasst werden.
Diese faszinierenden Krankheitserreger sind leicht gereinigt und zur Verfügung in biochemische, molekulare und Zelle Biologie Studien einschließlich Kokultur mit Wirtszellen zu untersuchen, Wirt-Parasit-Beziehungen auf der Ebene der Membranrezeptoren, Signal- und gen Ausdruck; Drogen Sie-Tests in Vitro; Untersuchung von gen-Löschung, Mutation oder Überexpression auf metabolische Prozesse, Zellskelett Biogenese und Parasiten überleben.

Gereinigte Trypanosomen wurden in Arzneimitteltests verwendet. Parasiten sind in Kultur Brunnen mit Verdünnungsreihen von bestimmten Medikamenten, entweder allein oder gemischt19übertragen. Mikroskopische Beobachtungen auswerten Motilität ist ein Marker der Lebensfähigkeit, kann durchgeführt werden, wenn nur ein paar Enten getestet werden, während AlamarBlue Zelle Lebensfähigkeit Assay ist eine hervorragende Methode für große Beweglichkeit Assays während ...

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Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers Diethylaminoethyl-cellulose Columns

Diese Methode der Trypanosomen Trennung vom Blut hängt ihre Oberflächenladung wird weniger negativ als Blut Säugerzellen. Infiziertem Blut ist platziert und auf ein Anion-Exchanger Spalte behandelt. Diese Methode, die passende Diagnose für afrikanische Trypanosomiasis, bietet gereinigte Parasiten für immunologische, biologische, biochemische, pharmazeutische und molekularbiologischen Untersuchungen.

Reinigung der extrazellulären Trypanosomen, einschließlich Afrika, aus Blut von Anionen-Austauscher (Diethylaminoethyl-Zellulose Spalten)

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is ...

Afrikanische Trypanosomen sind verantwortlich für menschliche afrikanische Trypanosomiasis, oder Schlafkrankheit und tierische afrikanische Trypanosomiasis. Die Trypanosomen, die Schlafkrankheit verursachen, sind tsetse fliegen übertragene protistische Parasiten, die in vielen geographischen Brennpunkten in Subsahara-Afrika vorhanden sind. Der Nachweis des Parasiten ist für die Diagnose, Behandlung und Nachsorge unerlässlich.Eine Serologie kann falsche positive und leider falsche negative Ergebnisse liefern. Um die Erkennung im Blut zu unterstützen, müssen Trypanosomen konzentriert werden. Es wurden verschiedene Techniken zur Parasitenkonzentration eingesetzt.Die empfindlichste Methode ist die Trennung von Parasiten vom Blut durch eine Säule von Anionenaustauscher, DEAE-Zellulose gefolgt von Zentrifugation und mikroskopischer Beobachtung. Folglich ist die DEAE-Zellulose-Methode die beste und bleibt bis heute, die Referenzmethode zur Visualisierung und Isolierung von Parasiten aus dem Blut für die menschliche afrikanische Trypanosomiasis-Diagnose, insbesondere unter Felderkrankungen. Diese Methode, die am besten geeignete Diagnostik für afrikanische Trypanosomiasis bietet auch gereinigte Parasiten für immunologische, biologische, biochemische, pharmazeutische und molekularbiologische Untersuchungen.Alle Untersuchungen, die dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren entsprechen, und die Zustimmung wurde von den französischen Behörden eingeholt, und alle verwendeten Protokolle wurden von unserer lokalen Ethikkommission genehmigt. Wägen Sie jede Substanz nach dem schriftlichen Protokoll ab. Destilliertes Wasser hinzufügen und sich mit Kaliumdihydrogenphosphat präzise an pH8 anpassen, um die folgenden gepufferten Lösungen, konzentrierte Phosphatpuffersalze 2X, herzustellen.Destilliertes Wasser und Glukose für phosphatgepufferte Salzglukose hinzufügen. Für 100 Milliliter Elutionspuffer 100 Einheiten pro Milliliter Penicillin, 100 Mikrogramm pro Milliliter Streptomycin und fünf Mikrogramm Milliliter Phenolrot zu Phosphat gepufferter Kochstoffglukose hinzufügen. 100 Gramm DEAE-Zellulose werden zunächst mit drei Litern destilliertem Wasser gewaschen und dann abgelassen.Feine Partikel werden entsorgt. Die Wasswerden werden wiederholt, bis der Überstand klar ist. Konzentrierte Phosphatgepufferte Saline 2X wird zugegeben und die DEAE-Zellulose gerührt.Der pH-Wert wird mit einem Molkaliumphosphat auf acht eingestellt. Die Zellulose wird dann zweimal mit destilliertem Wasser und zweimal mit Phosphat gepufferter Salzglukose gewaschen. Die DEAE-Zellulose und Phosphat gepufferte Saline-Glukose werden in gleichen Mengen gemischt.Legierung geviertelt und gelagert bei Raumtemperatur oder vier Grad Celsius oder bei minus 20 Grad Celsius für längere Lagerung. Trypanosome infiziertes Blut wird in flüssigem Stickstoff gespeichert. Ein Legierungsquart von einem Milliliter wird bei Raumtemperatur aufgetaut.Parasiten werden sorgfältig aus dem Kryotube mit einer Nadel und einer Ein-Milliliter-Spritze gesammelt. Die Lebensfähigkeit aufgetauter Parasiten wird durch die Beweglichkeit beurteilt, die durch Lichtmikroskopie-Beobachtung vor der Infektion visualisiert wird. Parasiten werden in die Peritonealhöhlen von zwei Mäusen injiziert, 500 Mikroliter pro Maus.Jeden Tag nach der Infektion wird die Parasitenämie durch Das Sammeln eines Tropfens Blut aus dem Schwanz mit einer Nadel bewertet und durch Mikroskopie überprüft. Wenn die Parasitenaufe auf einem geeigneten Niveau ist, wird infiziertes Blut gesammelt. Eine 10-Milliliter-Spritze wird in einer Klemme oder einem Halter unterstützt und ein vorgeschnittenes Stück Filterpapier hinzugefügt.Zubereitete DEAE-Zellulose wird bis zu acht oder neun Millilitern in die Spritze gegossen. Die Säule wird mit dem Elutionspuffer gewaschen. Zwei Milliliter infiziertes Blut werden sorgfältig auf die Säule gelegt und Trypanosomen werden in der Kolonne in einem 50 Milliliter Zentrifugationsrohr gesammelt.Der Elutionspuffer wird regelmäßig entsprechend dem Transit von Trypanosomen hinzugefügt. Der Transit der Trypanosomen durch die Säule wird überprüft, indem man in regelmäßigen Abständen einen Tropfen der Säuleneluate nimmt und Trypanosomen mittels Lichtmikroskopie beobachtet. Wenn Trypanosomen im Eluat nicht mehr beobachtet werden, wird das konische Rohr bei 1,800 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert.Der Überstand wird entsorgt und Trypanosomen in der Palette werden mit einem Hämozytometer gezählt. Gesammelte Trypanosomen werden anschließend in dem Medium verdünnt, das für die geplante Untersuchung erforderlich ist. Diese Methode, die passendste Diagnostik für afrikanische Trypanosomiasis, liefert gereinigte Parasiten für immunologische, biologische, biochemische, pharmazeutische und molekularbiologische Untersuchungen.Diese Studien wurden entwickelt, weil DEAE-Zellulose-gereinigte Parasiten leicht in großen Mengen von natürlich oder experimentell infizierten Wirten und insbesondere Nagetieren gewonnen werden können. Die Trypanosome-Lebensfähigkeit in Gegenwart pharmazeutischer Wirkstoffe wird durch mikroskopische Beobachtung beurteilt. Die Lebensfähigkeit von Parasiten ist mit der Beweglichkeit verbunden und kann daher mit einem Lichtmikroskop mit 40-facher oder höherer Vergrößerung per Auge überprüft werden.Die Lebensfähigkeit von Parasiten wird durch Messung des Prozentsatzes der motilen Formen bewertet. Verdünnungen von Testverbindungen werden in jeden Brunnen einer 96 Well-Gewebekulturplatte hinzugefügt, während Kontrollbrunnen mock behandelt werden. Jede Konzentration wird in Dreifachausführung beurteilt.Die Anzahl der lebensfähigen Parasiten für jede Verdünnung wird mit der Anzahl der Parasiten in Kontrollbrunnen verglichen. Die Wirkung von Pentamidin, einem Referenzmedikament, das in der humanafrikanischen Trypanosomiasis-Therapie verwendet wird, wird in dieser Abbildung dargestellt. Trypanosome Makrophagen-Kokulturen ermöglichen die Untersuchung der Wirtparasiten-Interaktion auf zellulärer Ebene.In Makrophagenparasiten-Kokulturen induzieren extrazelluläre Trypanosomen die Produktion von Makrophagenarginase, die Arginin zu Ornithin hydrolysieren. Ornithin ist der Vorläufer von Polyamen und Trypanothion, essentiell für das Überleben und Wachstum von Parasiten. Darüber hinaus verringert Arginin-Erschöpfung die Produktion von Trypanocidal-Stickstoffmonoxid.In der Folge reduziert die Zugabe eines Arginase-Inhibitors, S-L-Cystein zu Kokulturen dramatisch das Makrophagen-induzierte Parasitenwachstum. Arginase Induktion wird durch Trypanosome ausgeschieden und oder sezerniert Faktoren vermittelt. Dieser Arginase-induzierende Faktor wurde als Orthin-Kinesin identifiziert.Die Kinesin bindet an C-Typ Lektin-Mannose-Bindungsrezeptoren. Arginase wird induziert und produziert Ornithin, das Das Parasitenwachstum begünstigt. Arginase wird nicht durch Kinesin in Makrophagen mit 12,5 Millimolar Mannose oder in Makrophagen von Mäusen, wo die Makrophagen-Mannose-Rezeptoren gelöscht wurden, induziert.Weitere Beispiele für Zellbiologie und biochemische Experimente mit DAEA-Zellulose gereinigten Trypanosomen werden in Studien gezeigt, in denen neuartige Zytoskelettproteine wie BILBO1 identifiziert wurden. FÜR die Biogenese wichtiger Zytoskelettstrukturen und das Überleben von Parasiten ist BILBO1 erforderlich. Damit ist BILBO1 ein wichtiges Ziel für interventionelle Interventionen bei pathogenen Trypanosomen.In dieser Abbildung ist ein Bild zu sehen, das die Immunofloureszenz-Kennzeichnung einer Blutkreislaufkulturform zeigt, trypanosoma brucei cell sondiert mit einem Anti-BILBO1-Antikörper. Zusätzlich wurden Glukose- und Threoninstoffwechsel mit DEAE-Zellulose-gereinigten Trypanosomen beschrieben und die an diesen Prozessen beteiligten Enzyme experimentell validiert. Eine schematische Darstellung des Glukose- und Threoninstoffwechsels in den blutdurchströmten Trypanosomen ist in dieser Abbildung dargestellt.Die Reinigung afrikanischer Trypanosomen aus Blut durch Anionenaustauschen von DEAE-Zellulosesäulen mit jüngsten Verbesserungen bleibt der Goldstandard für den Trypanosomennachweis, nicht nur bei natürlichen Wirten mit geringen Parasitemien in endemischen Gebieten, sondern auch für den Bedarf an Parasiten in großer Zahl für experimentelle Untersuchungen. Untersuchungen haben die Identifizierung von Trypanosome-Molekülen ermöglicht, die eine wesentliche Rolle beim Überleben und Wachstum von Parasiten spielen. Identifizierte Ziele könnten die Grundlage für einen zukünftigen Impfstoff mit potenziellen Antigenen für Mensch und Tier in einem einen Gesundheitsansatz darstellen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers (Diethylaminoethyl-cellulose Columns)

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

Depletion spezifischer Zellpopulationen durch Ergänzung Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

Isolierung von Maus Bauchhöhle Cells

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Reinigung von spezifischen Zellpopulation durch Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Expansion, Reinigung und Functional Assessment of Human peripheren Blut NK-Zellen

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Reinigung und Visualisierung von Lipopolysaccharid aus Gram-negativen Bakterien durch heiße wäßrige-Phenol-Extraktion

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Die Reinigung von Pathogen Vakuolen aus<em&gt; Legionellen</em&gt;-Infizierten Phagozyten

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Antigene geschützten funktionellen Red Blood Cells durch die Membran Pfropfung von Compact hyperverzweigten Polyglycerinen

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Biolumineszenz-Bildgebung zur Erkennung von Late Stage-Infektion der afrikanischen Trypanosomiasis

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dextran erhöht die Effizienz der Lentivirale Transduktion von murinen und menschliche primäre NK-Zellen

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...