Name: purification of extracellular trypanosomes, including african, from blood by anion-exchangers (diethylaminoethyl-cellulose columns)
Uploaded: 2019-04-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers Diethylaminoethyl-cellulose Columns at JoVE.com

私たち UMR 177 INTERTRYP IRD CIRAD ユニヴェルシテ ・ ド ・ ボルドーのすべてのメンバーに感謝します。この研究は、ボルドー大学から内部の資金によって支えられた、サポート LABEX ParaFrap ANR-11-LABX-0024、ANR と協会から注ぐル開発銀行 de la recherche en parasitologie et médecine トロピカルとサービス deためら助成カンボジア ・ デ ・たいしかん・ ド ・ フランス アラカルト バンギ (Centrafrique)。

調査は、ケアと実験動物の使用 (NIH 出版番号 85±23、1996 の改正) のガイドラインに適合。プロトコルはローカル倫理委員会によって承認されました。
1. 動物
<ol><li>8 から 10 週古い、20-25 g は、住宅設備各実験の前に 15 日間動物を高齢者女性のスイス (の 1) マウスを保持します。保護、温度 (22 ° C) と湿度 (50%) に保持する換気ボックスに収容します。ルーム、12 時?...

<ol>
	<li>B&#252;scher, P., Cecchi, G., Jamonneau, V., Priotto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+African+trypanosomiasis.">Human African trypanosomiasis.</a> Lancet. 390 (10110), 2397-2409 (2017).</li><li>Lejon, V., Bentivoglio, M., Franco, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+African+trypanosomiasis.">Human African trypanosomiasis.</a> Handbook of Clinical Neurology. 114, 169-181 (2013).</li><li>Giordani, F., Morrison, L. J., Rowan, T. G., De Koning, H. P., Barrett, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+animal+trypanosomiases+and+their+chemotherapy:+a+review.">The animal trypanosomiases and their chemotherapy: a review.</a> Parasitology. 143 (14), 1862-1889 (2016).</li><li>Aksoy, S., Buscher, P., Lehane, M., Solano, P., Van Den Abbeele, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+African+trypanosomiasis+control:+Achievements+and+challenges.">Human African trypanosomiasis control: Achievements and challenges.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (4), e0005454 (2017).</li><li>B&#252;scher, P., Deborggraeve, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+can+molecular+diagnostics+contribute+to+the+elimination+of+human+African+trypanosomiasis?.">How can molecular diagnostics contribute to the elimination of human African trypanosomiasis?.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (5), 607-615 (2015).</li><li>Truc, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atypical+human+infections+by+animal+trypanosomes.">Atypical human infections by animal trypanosomes.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (9), e2256 (2013).</li><li>Lumsden, W. H., Kimber, C. D., Evans, D. A., Doig, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosoma+brucei:+miniature+anion-exchange+centrifugation+technique+for+detection+of+low+parasitaemias:+adaptation+for+field+use.">Trypanosoma brucei: miniature anion-exchange centrifugation technique for detection of low parasitaemias: adaptation for field use.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (3), 312-317 (1979).</li><li>B&#252;scher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Models+of+Mini+Anion+Exchange+Centrifugation+Technique+(mAECT)+and+Modified+Single+Centrifugation+(MSC)+for+sleeping+sickness+diagnosis+and+staging.">Improved Models of Mini Anion Exchange Centrifugation Technique (mAECT) and Modified Single Centrifugation (MSC) for sleeping sickness diagnosis and staging.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (11), e471 (2009).</li><li>Lanham, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+trypanosomes+from+the+blood+of+infected+rats+and+mice+by+anion-exchangers.">Separation of trypanosomes from the blood of infected rats and mice by anion-exchangers.</a> Nature. 218 (5148), 1273-1274 (1968).</li><li>Lanham, S. M., Godfrey, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+salivarian+trypanosomes+from+man+and+other+mammals+using+DEAE-cellulose.">Isolation of salivarian trypanosomes from man and other mammals using DEAE-cellulose.</a> Experimental Parasitology. 28 (3), 521-534 (1970).</li><li>Humphrey, P. A., Ashraf, M., Lee, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+trypanosomes+in+vivo,+host+body+weight+gains,+and+food+consumption+in+zinc-deficient+mice.">Growth of trypanosomes in vivo, host body weight gains, and food consumption in zinc-deficient mice.</a> Journal of the National Medical Association. 89 (1), 48-56 (1997).</li><li>Lowry, J. E., Leonhardt, J. A., Yao, C., Belden, E. L., Andrews, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+C57BL/6+mice+by+Trypanosoma+musculi+modulates+host+immune+responses+during+Brucella+abortus+cocolonization.">Infection of C57BL/6 mice by Trypanosoma musculi modulates host immune responses during Brucella abortus cocolonization.</a> Journal of Wildlife Diseases. 50 (1), 11-20 (2014).</li><li>Vincendeau, P., Da&#235;ron, M., Daulouede, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+antibody+classes+and+Fc+receptors+responsible+for+phagocytosis+of+Trypanosoma+musculi+by+mouse+macrophages.">Identification of antibody classes and Fc receptors responsible for phagocytosis of Trypanosoma musculi by mouse macrophages.</a> Infection and Immunity. 53 (3), 600-605 (1986).</li><li>Vincendeau, P., Da&#235;ron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosoma+musculi+co-express+several+receptors+binding+rodent+IgM,+IgE,+and+IgG+subclasses.">Trypanosoma musculi co-express several receptors binding rodent IgM, IgE, and IgG subclasses.</a> Journal of Immunology. 142 (5), 1702-1709 (1989).</li><li>Holzmuller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+and+pathogenicity+patterns+of+Trypanosoma+bruceigambiense+field+isolates+in+experimentally+infected+mouse:+differences+in+host+immune+response+modulation+by+secretome+and+proteomics.">Virulence and pathogenicity patterns of Trypanosoma bruceigambiense field isolates in experimentally infected mouse: differences in host immune response modulation by secretome and proteomics.</a> Microbes and Infections. 10 (1), 79-86 (2008).</li><li>Holzmuller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+parasites+and+their+excreted-secreted+factors+modulate+the+inducible+metabolism+of+L-arginine+in+macrophages?.">How do parasites and their excreted-secreted factors modulate the inducible metabolism of L-arginine in macrophages?.</a> Frontiers in Immunology. 9, 778 (2018).</li><li>Abrahamson, I. A., Da Silva, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-dependent+cytotoxicity+against+Trypanosoma+cruzi.">Antibody-dependent cytotoxicity against Trypanosoma cruzi.</a> Parasitology. 75 (3), 317-323 (1977).</li><li>Herbert, W. J., Lumsden, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosoma+brucei:+a+rapid+&amp;#34;matching&amp;#34;+method+for+estimating+the+host's+parasitemia.">Trypanosoma brucei: a rapid &amp;#34;matching&amp;#34; method for estimating the host's parasitemia.</a> Experimental Parasitology. 40 (3), 427-431 (1976).</li><li>Dauchy, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosoma+brucei+CYP51:+Essentiality+and+Targeting+Therapy+in+an+Experimental+Model.">Trypanosoma brucei CYP51: Essentiality and Targeting Therapy in an Experimental Model.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (11), e0005125 (2016).</li><li>Raz, B., Iten, M., Grether-B&#252;hler, Y., Kaminsky, R., Brun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Alamar+Blue+assay+to+determine+drug+sensitivity+of+African+trypanosomes+(T.+b.+rhodesiense+and+T.+b.+gambiense)+in+vitro.">The Alamar Blue assay to determine drug sensitivity of African trypanosomes (T. b. rhodesiense and T. b. gambiense) in vitro.</a> Acta Tropica. 68 (2), 139-147 (1997).</li><li>Albright, J. W., Albright, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+growth+of+Trypanosoma+musculi+in+cell-free+medium+conditioned+by+rodent+macrophages+and+mercaptoethanol.">In vitro growth of Trypanosoma musculi in cell-free medium conditioned by rodent macrophages and mercaptoethanol.</a> International Journal for Parasitology. 10 (2), 137-142 (1980).</li><li>Gobert, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-Arginine+availability+modulates+local+nitric+oxide+production+and+parasite+killing+in+experimental+trypanosomiasis.">L-Arginine availability modulates local nitric oxide production and parasite killing in experimental trypanosomiasis.</a> Infection and Immunity. 68 (8), 4653-4657 (2000).</li><li>De Muylder, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Trypanosoma+brucei+kinesin+heavy+chain+promotes+parasite+growth+by+triggering+host+arginase+activity.">A Trypanosoma brucei kinesin heavy chain promotes parasite growth by triggering host arginase activity.</a> PLoS Pathogens. 9 (10), e1003731 (2013).</li><li>Nzoumbou-Boko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosoma+musculi+Infection+in+Mice+Critically+Relies+on+Mannose+Receptor-Mediated+Arginase+Induction+by+a+TbKHC1+Kinesin+H+Chain+Homolog.">Trypanosoma musculi Infection in Mice Critically Relies on Mannose Receptor-Mediated Arginase Induction by a TbKHC1 Kinesin H Chain Homolog.</a> Journal of Immunology. 199 (5), 1762-1771 (2017).</li><li>Bonhivers, M., Nowacki, S., Landrein, N., Robinson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+the+trypanosome+endo-exocytotic+organelle+is+cytoskeleton+mediated.">Biogenesis of the trypanosome endo-exocytotic organelle is cytoskeleton mediated.</a> PLoS Biology. 6 (5), e105 (2008).</li><li>Albisetti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+the+flagellar+pocket+collar+and+the+hook+complex+via+a+novel+microtubule-binding+protein+in+Trypanosoma+brucei.">Interaction between the flagellar pocket collar and the hook complex via a novel microtubule-binding protein in Trypanosoma brucei.</a> PLoS Pathogens. 13 (11), e1006710 (2017).</li><li>Cross, G. A. M., Klein, R. A., Linstead, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+amino+acids+by+Trypanosoma+brucei+in+culture:+L-threonine+as+a+precursor+for+acetate.">Utilization of amino acids by Trypanosoma brucei in culture: L-threonine as a precursor for acetate.</a> Parasitology. 71 (2), 311-326 (1975).</li><li>Bringaud, F., Rivi&#232;re, L., Coustou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+of+trypanosomatids:+adaptation+to+available+carbon+sources.">Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 149 (1), 1-9 (2006).</li><li>Mazet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+central+metabolism+of+the+bloodstream+forms+of+Trypanosoma+brucei:+production+of+acetate+in+the+mitochondrion+is+essential+for+the+parasite+viability.">Revisiting the central metabolism of the bloodstream forms of Trypanosoma brucei: production of acetate in the mitochondrion is essential for the parasite viability.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (12), e2587 (2013).</li><li>Coutton, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+CFAP43+and+CFAP44+cause+male+infertility+and+flagellum+defects+in+Trypanosoma+and+human.">Mutations in CFAP43 and CFAP44 cause male infertility and flagellum defects in Trypanosoma and human.</a> Nature Communications. 9 (1), 686 (2018).</li><li>Cnops, J., Magez, S., De Trez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escape+mechanisms+of+African+trypanosomes:+Why+trypanosomosis+is+keeping+us+awake.">Escape mechanisms of African trypanosomes: Why trypanosomosis is keeping us awake.</a> Parasitology. 142 (3), 417-427 (2015).</li><li>Barrett, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-Based+Approaches+to+the+Isolation+of+African+Trypanosomes.">Microfluidics-Based Approaches to the Isolation of African Trypanosomes.</a> Pathogens. 6 (4), (2017).</li><li>Taylor, A. E., Lanham, S. M., Williams, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+methods+of+preparation+on+the+infectivity,+agglutination,+activity,+and+ultrastructure+of+bloodstream+trypanosomes.">Influence of methods of preparation on the infectivity, agglutination, activity, and ultrastructure of bloodstream trypanosomes.</a> Experimental Parasitology. 35 (2), 196-208 (1974).</li><li>Gutteridge, W. E., Cover, B., Gaborak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+blood+and+intracellular+forms+of+Trypanosoma+cruzi+from+rats+and+other+rodents+and+preliminary+studies+of+their+metabolism.">Isolation of blood and intracellular forms of Trypanosoma cruzi from rats and other rodents and preliminary studies of their metabolism.</a> Parasitology. 76 (2), 159-176 (1978).</li><li>Cruz-Saavedra, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Trypanosoma+cruzi+metacyclic+trypomastigotes+by+ion+exchange+chromatography+in+sepharose-DEAE,+a+novel+methodology+for+host-pathogen+interaction+studies.">Purification of Trypanosoma cruzi metacyclic trypomastigotes by ion exchange chromatography in sepharose-DEAE, a novel methodology for host-pathogen interaction studies.</a> Journal of Microbiological Methods. 142, 27-32 (2017).</li><li>Lemesre, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+protection+against+canine+visceral+leishmaniasis+using+the+LiESAp-MDP+vaccine+in+endemic+areas+of+France:+double-blind+randomised+efficacy+field+trial.">Long-lasting protection against canine visceral leishmaniasis using the LiESAp-MDP vaccine in endemic areas of France: double-blind randomised efficacy field trial.</a> Vaccine. 25 (21), 4223-4234 (2007).</li></ol>

浄化された trypanosomes は、免疫学、生化学、細胞および分子生物学を研究するための強力な手段を表しています。データと結果の大きい広がりは他の真核細胞の30から情報を取得するために貢献してきましたし、trypanosomes から得られています。彼らは存続し、2 つの非常に異なる環境で育つことを可能にする多数のメカニズムを考案しているので trypanosomes がまた重要で興味?...

手法説明ここで trypanosomes、寄生虫血から動物と人間アフリカ トリパノソーマ症 (帽子)、責任の分離を可能します。最初の段階の帽子の診断のための最善の方法で、さらにこの寄生虫の浄化方法により、堅牢な血清学の調査。
帽子はツェツェ バエ送信トリパノソーマ属 gambienseとt. b. rhodesiense1.によって引き起こされるこれらの原虫疾患 (hemolymphatic 展開ステージ) の最初の段階の間に、血流、リンパ、間質液細胞外を乗算します。第二期 (meningoencephalitic 期) 寄生虫クロス血液脳関門; ときに開始します。この病気はその名「睡眠病」を与えている、睡眠障害などの神経学的徴候はこの第 2 段階2の典型的であります。関連 trypanosomes (t. エバンシーいる、t. の vivax、t. b. グリコシルホスファチジルイノシトール) は、動物アフリカトリパノソーマ (AAT)3の病原です。
世界保健機関 (WHO) は、2020 年までに公衆衛生問題として帽子を排除して 20304伝送を停止するを目指します。迅速診断テストの最近の導入は、改善された血清学的診断1,4,5を持っています。いくつかの分子診断テストが開発されているが、フィールド診断におけるそれらの役割の確立5されていません。グリコシルホスファチジルイノシトールグループ、動物トリパノソ6担当の寄生虫によって引き起こされる非定型の治療法のサブ種を識別するために使用されます。
血清反応偽陽性と残念なことに偽陰性の結果1を与えることができる寄生虫の検出は診断・治療・ フォロー アップは欠かせません。これらの hemoflagellate の原生生物の直接顕微鏡観察によって引き起こされるt. b. gambiense、(95% 以上) 低 parasitemias ルールは、一方、 t. b. rhodesiense、大規模なによる帽子の帽子の場合はむずかしい寄生虫の数は頻繁に血の存在です。厚いドロップやキャピラリー チューブ遠心分離 (CTC) といった様々 な濃度の技術も使用されているが、寄生虫の陰イオン交換体 (DEAE セルロース) の列によって血液からの分離遠心分離して顕微鏡観察、ペレット、最も敏感な方法です (約 50 寄生虫/ミリリットルの血液を検出できる)1,7。その結果、この陰イオン交換器 (DEAE セルロース) 法による trypanosomes の浄化は最高とまでは、可視化および帽子の診断のための血液の寄生虫を分離するための参照方法。、フィールド条件で DEAE セルロースのミニ列が使用されています、いくつかの改善は、顕微鏡観察7、8を促進しました。
下記の血液からトリパノソーマ分離法は、寄生虫の表面電荷は、哺乳類の血液細胞9より小さい負に依存します。興味深いことに、このメソッドは、50 年前、博士シーラ ランハムによって 1968 年に開発された、検出と血流 trypanosomes の準備のためのゴールド スタンダードのまま。高速、両方の動物と人間のトリパノソーマ症10の診断を許可する哺乳類の広い範囲から salivarian trypanosomes の再現です。
生活、精製された寄生虫を得るためには、感染した血液が陰イオン交換カラムに追加されます。クロマトグラフィー条件 (主に pH、イオン強度のバッファー/メディア) は、哺乳類の血液細胞と trypanosomes10の各組み合わせに各トリパノソーマ種およびもっと一般を合わせられなければならないと。溶出バッファーは、ほとんどのアフリカの trypanosomes10の pH 8 に正確に調整されます。Parasitemias は単独で顕微鏡観察によって検出するのには低すぎるので、このメソッドが寄生、患者の血液中の濃度を優先し、検査することもできます。新鮮単離 trypanosomes とこのテクニックを使用して、感染した動物から血の上の作業は無期限研究室で無菌状態で培養されている寄生虫の研究よりも様々 な調査のより適切です。
宿主-寄生生物関係は最高、寄生虫、したがって、その自然なホストに感染するt. 筋、細胞外 trypanosomes の代表である、多くの利点は、マウスの感染に伴う自然マウス寄生虫に師事、実験小動物バイオハザード安全レベル (BSL) 条件を必要としません。T. 筋は人間の病原体を含む他の多くのトリパノソーマ種とは異なり、免疫マウスを殺さない。T. 筋がないマウスの T 細胞を奪われた排除され、食品や栄養素の摂取量の11を変更することにより感染したマウスの parasitemias を増やすことができます。この寄生虫は、12の他の病原体による共同感染の免疫応答を調節します。T. 筋培養t. 筋から感染したマウス展違いからたとえば、膜 Fc 受容体の発現t. 筋無菌共生栽培、感染マウス13から精製した寄生虫に比較で失われます,14. Excreted 分泌因子 (ESF) も定性的・定量的無菌トリパノソーマ文化小さい単位、流行地域15で分離された株の間で異なります。ESF は、宿主の免疫系に表示しのでの再生ホストの初期に重要な役割免疫応答16最初の抗原です。
実験室調査のための実験感染動物でこのプロトコルは寄生虫、特に免疫抑制動物を使用するときに必要なマウスの数を最小限に抑えることのより多くの実験を促進します。マス ・ スクリーニングのトリパノソーマ症 (CATT) のためにカード凝集テストで使用されるバリアント表面糖 (Vsg) はまだラットでは反映され trypanosomes から浄化されます。フィールドで使用可能な 2 つ迅速診断テスト (個別にラップされたカセット) はまだネイティブ Vsg およびない trypanosomesの in vitro培養1,ので4,の感染モデル ソースを使用して5. これら DEAE セルロースを精製した寄生虫は、特に齧歯動物、自然または実験的感染ホストから大量に簡単に取得できるので、トリパノソーマ免疫学と生物学の研究の進歩が促進されています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1036px;" width="1036">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">10 mL Pipettes&#160;</td>
			<td style="width:381px;">Falcon</td>
			<td style="width:184px;">357,551</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">2 mL Pipettes&#160;</td>
			<td style="width:381px;">Falcon</td>
			<td style="width:184px;">352,507</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Centrifugation tube 50 mL</td>
			<td style="width:381px;">Falcon</td>
			<td style="width:184px;">352,070</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:381px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">4K15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">DEAE cellulose</td>
			<td style="width:381px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:184px;">s/c- 211213</td>
			<td>100 G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">filter paper&#160;</td>
			<td style="width:381px;">Whatman</td>
			<td style="width:184px;">1,001,125</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Flat bottom flask narrow neck</td>
			<td style="width:381px;">Duran</td>
			<td style="width:184px;">21 711 76</td>
			<td style="width:172px;">6000 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Glucose&#160;</td>
			<td style="width:381px;">VWR</td>
			<td style="width:184px;">101174Y</td>
			<td>500 G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Heparin</td>
			<td style="width:381px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">H3149-50KU</td>
			<td>5 000 U</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:299px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:381px;">VWR</td>
			<td style="width:184px;">120 26936.260</td>
			<td>500 G</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:299px;">Microscope</td>
			<td style="width:381px;">Olympus</td>
			<td style="width:184px;">CH-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope coverslips</td>
			<td style="width:381px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:184px;">CB00100RA020MNT0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:381px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:184px;">AGAA000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:299px;">Na2HPO4&#160;</td>
			<td style="width:381px;">VWR</td>
			<td style="width:184px;">100 28026;260</td>
			<td>500 G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">NaCl</td>
			<td style="width:381px;">VWR</td>
			<td style="width:184px;">27800.291</td>
			<td>1 KG</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:299px;">NaH2PO4&#160;</td>
			<td style="width:381px;">VWR</td>
			<td style="width:184px;">110 33616;262</td>
			<td>500 G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Nalgene Plastic Media Bottles size 125 mL</td>
			<td style="width:381px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:184px;">342024-0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Nalgene Plastic Media Bottles size 500 mL</td>
			<td style="width:381px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:184px;">342024-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Pasteur Pipette</td>
			<td style="width:381px;">VWR</td>
			<td style="width:184px;">BRND125400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Penicillin 10,000 UI/Streptomycin 10,000 &#181;g</td>
			<td style="width:381px;">EUROBIO</td>
			<td style="width:184px;">CABPES01 OU</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Phenol red</td>
			<td style="width:381px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">P0290</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Syringue&#160;</td>
			<td style="width:381px;">Dutscher</td>
			<td style="width:184px;">SS+10S21381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Tissue culture hood</td>
			<td style="width:381px;">Thermoelectro Corporation</td>
			<td style="width:184px;">MSC-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Trypanosoma brucei brucei</td>
			<td style="width:381px;">Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium).</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td>ANTAT 1.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Trypanosoma brucei gambiense</td>
			<td style="width:381px;">Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium).</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td>ITMAP 1893</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Trypanosoma musculi</td>
			<td>London School of Hygiene and Tropical Medicine (UK)</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td>Partinico II</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of extracellular trypanosomes, including african, from blood by anion-exchangers (diethylaminoethyl-cellulose columns)

このメソッドでは、trypanosomes、寄生虫感染した血液から動物と人間アフリカ トリパノソーマ症 (帽子)、責任の分離をことができます。これは第一段階の帽子の診断のための最善の方法とさらにこの寄生虫の浄化方法により、血清学的調査研究します。
帽子はツェツェ バエ送信トリパノソーマ原虫 gambienseによって引き起こされるとt. b. rhodesiense.関連 trypanosomes ナガナ病の病原であります。トリパノソーマの検出は、帽子の診断、治療、フォロー アップに不可欠です。ここで説明する手法はt. b. gambiense帽子の診断のための圃場条件に合わせ、最も敏感な寄生虫検出手法を 1 時間以内に完了することができます。血液は ph 8、以前調整陰イオン交換カラム (DEAE セルロース) に階層化され溶出バッファーが追加されます。少ない負荷電の trypanosomes を通過するのに対し、高負荷電の血液細胞が列に吸着しました。収集した trypanosomes は、遠心分離によってペレットし、顕微鏡で観察。また、寄生虫は感染性を維持しながら、細胞損傷せずに用意しています。
精製 trypanosomes、免疫学的検査に必要です彼らは、trypanolysis のアッセイ帽子血清のゴールド スタンダードで使用されます。ステンド グラスの寄生虫は、フィールド血清カード凝集反応 (CATT) で利用されています。Exoantigens、バリアント表面糖などの精製された trypanosomes からの抗原は様々 なイムノアッセイでも使用されます。ここで説明した手順は、アフリカトリパノソーマ;その結果、クロマトグラフィー条件は、それぞれの種のホストの哺乳類の血をトリパノソーマ菌株、およびもっと一般を合わせられなければなりません。
これらの病原体を魅力的な簡単に精製されで使用する生化学的な分子と細胞膜受容体、シグナル伝達、遺伝子のレベルでホスト寄生虫の関係を調査するための宿主細胞との共培養を含む生物学研究式です。薬物テスト体外;遺伝子の削除、突然変異、または代謝プロセス、細胞骨格の生合成および寄生虫生存に過剰発現の調査。

浄化された trypanosomes は、医薬品のテストで使用されています。寄生虫は、特定の薬物、単独または混合19のシリアル希薄を含む文化井戸に転送されます。顕微鏡観察、運動を評価性マーカーである、のみいくつかの薬剤をテストするときに実行できる、AlamarBlue セル実行可能性の試金に対し創薬スクリーニング20中大運動アッセイ?...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers Diethylaminoethyl-cellulose Columns at JoVE.com

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers Diethylaminoethyl-cellulose Columns

トリパノソーマ血から分離のこの方法は、哺乳類の血液細胞よりも小さい負となりその表面電荷に依存します。感染した血は配置し、陰イオン交換カラムに扱われます。このメソッド、アフリカ睡眠病の最もフィッティング診断は、免疫学的、生物学的、生化学的、薬学・分子生物調査のため精製の寄生虫を提供します。

陰イオン交換器 (ジエチルアミノエチル セルロース列) による血中からのアフリカを含む細胞外の Trypanosomes の精製

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is ...

アフリカのトリパノソームは、ヒトアフリカのトリパノソマイア症、または睡眠病および動物アフリカのトリパノソイア症を担当しています。睡眠病を引き起こすトリパノソームは、サハラ以南のアフリカの多くの地理的な病巣に存在するツェツェハエ伝染性の原虫である。寄生虫の検出は、診断、治療、およびフォローアップに不可欠です。血清学は偽陽性を与え、残念ながら、偽陰性の結果を与えることができます。血液中の検出を助けるためには、トリパノソームを濃縮する必要があります。種々の寄生虫濃度技術が用いられてきた。最も敏感な方法は、アニオン交換器の列による血液からの寄生虫の分離であり、DEAEセルロースは遠心分離および顕微鏡観察が続く。その結果、DEAEセルロース法は、ヒトアフリカのトリパノソサイト症診断のために、特にフィールド条件において、血液から寄生虫を可視化および単離するための最良かつ現在に残っている。この方法は、アフリカのトリパノソミア症に最も適合する診断薬で、免疫学的、生物学的、生化学的、医薬的、および分子生物学的調査のための精製寄生虫を提供する。実験動物のケアと使用のためのガイドに準拠したすべての調査は、フランス当局から取得されており、使用されるすべてのプロトコルは、私たちの地元の倫理委員会によって承認されています。書かれたプロトコルに従って各物質を計量します。蒸留水を加え、pH 8に正確に調整し、リン酸二水素カリウムで、次の緩衝溶液、濃縮リン酸緩衝液生理食塩水2Xを作ります。リン酸緩衝生理食塩水グルコースに蒸留水とグルコースを加えます。溶出バッファーの 100 ミリリットルの場合は、ペニシリン 1 ミリリットルあたり 100 単位、ストレプトマイシンのミリリットルあたり 100 マイクログラム、フェノールレッドの 5 マイクログラムミリリットルをリン酸緩衝生理食塩水グルコースに追加します。100グラムのDEAEセルロースは、まず3リットルの蒸留水で洗浄し、次に沈静化する。微粒子は廃棄されます。上清がはっきりするまで、この清水を繰り返します。濃縮リン酸緩衝食塩水2Xを添加し、DEAEセルロースを攪拌する。pHは1つのリン酸モルカリウムで8に調節される。セルロースは、次いで蒸留水で2回洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水グルコースで2回洗浄する。DEAEセルロースとリン酸緩衝生理食塩水グルコースは等量で混合される。合金は四分の一し、長期貯蔵のために室温または4度摂氏またはマイナス20°Cで貯蔵される。トリパノソーム感染した血液は液体窒素に保存されます。1ミリリットルの合金クォートは室温で解凍されます。寄生虫は、針と1ミリリットルの注射器を使用してクライオチューブから慎重に収集されます。解凍された寄生虫の生存率は、感染前の光顕微鏡観察によって可視化された運動性によって評価される。寄生虫は、マウス1匹あたり500マイクロリットルの2匹のマウスの腹腔内に注入される。毎日感染後、寄生虫血症は針で尾から血液の滴を集めることによって評価され、顕微鏡検査によってチェックされる。寄生虫症が適切なレベルにある場合、感染した血液が収集される。10ミリリットルのシリンジはクランプまたはホルダーで支え、フィルターペーパーのプレカット部分が加えられている。調製されたDEAEセルロースは、8または9ミリリットルのレベルまでシリンジに注がれる。カラムは溶出バッファーで洗浄される。感染した血液の2ミリリットルは慎重にカラムの上に置かれ、トリパノソームは50ミリリットル遠心チューブのカラム溶出物中に集められる。溶出緩衝液は、トリパノソームの通過に応じて定期的に添加される。カラムを通るトリパノソームの通過は、一定の間隔でカラム溶出物を一滴採取し、光顕微鏡を用いてトリパノソームを観察することによってチェックされる。ルアート中にトリパノソームが観察されなくなると、円錐管は摂氏4度で10分間1,800倍Gで遠心する。上清は捨てられ、パレットのトリパノソームはヘモサイトメーターで数えられる。収集されたトリパノソームは、その後、計画的な調査に必要な培地で希釈される。この方法は、アフリカのトリパノソミア症に最も適合する診断薬で、免疫学的、生物学的、生化学的、医薬的、および分子生物学的調査のための精製寄生虫を提供する。これらの研究は、DEAEセルロース精製寄生虫が、自然にまたは実験的に感染した宿主、特にげっ歯類から大量に得られやすいために開発された。医薬薬剤の存在下でのトリパノソームの生存率は、顕微鏡観察によって評価される。寄生虫の生存率は運動性に関連しており、したがって、40倍以上の倍率で光顕微鏡下で眼でチェックすることができる。寄生虫の生存率は、運動形態の割合を測定することによって評価される。試験化合物の希釈は96ウェル組織培養プレートの各ウェルに添加され、対照ウェルはmock処理される。各濃度は三重で評価される。各希釈のための生存可能な寄生虫の数は、コントロールウェル内の寄生虫の数と比較されます。ヒトアフリカのトリパノソマイア症療法で使用される参照薬であるペンタミジンの効果をこの図に示す。トリパノソームマクロファージ共培養は、細胞レベルでの宿主寄生虫相互作用の調査を可能にする。マクロファージパラサイトの共同培養では、細胞外トリパノソームはアルギニンをオルニチンに加水分解するマクロファージアルギナーゼの産生を誘導する。オルニチンは、ポリアミンとトリパノチオンの前駆体であり、寄生虫の生存と成長に不可欠です。さらに、アルギニン枯渇はトリパノサイド一酸化窒素の生成を減少させる。続いて、アルギナーゼ阻害剤を添加し、共培養にS-L-システインを添加すると、マクロファージ誘導寄生虫の増殖が劇的に減少する。アルギナーゼ誘導は、トリパノソーム排泄および分泌因子によって媒介される。このアルギナーゼ誘導因子は、オルチンキネシンとして同定されている。キネシンはC型レクチンマンノース結合受容体に結合する。アルギナーゼは誘導され、寄生虫の成長を支持するオルニチンを生成します。.アルギナーゼは、12.5ミリモルマンノースで培養されたマクロファージや、マクロファージマンノース受容体が削除されたマウスのマクロファージにおいてキネシンによって誘導されない。さらに、Bilbo1などの新規細胞骨格タンパク質が同定された研究で、DAEAセルロース精製トリパノソームを用いた細胞生物学および生化学的実験の例が実証されている。BILBO1は、重要な細胞骨格構造および寄生虫生存の生物形成に必要である。したがって、BILBO1は病原性トリパノソームへの介入の重要な標的を表す。血流培養形態の免疫蛍光標識を示す画像を、抗BILBO1抗体でプローブしたトリパノソーマ・ブセオシ細胞をこの図に示す。さらに、糖およびスレオンニン代謝は、DEAEセルロース精製トリパノソームを用いて説明されており、これらのプロセスに関与する酵素が実験的に検証されている。血流形成トリパノソームにおけるグルコースおよびスレオンニン代謝の概略表現をこの図に示す。最近の改善とDEAEセルロースカラムを交換することにより、血液からアフリカのトリパノソームを精製することは、固有の領域で低い寄生虫を持つ天然宿主だけでなく、実験的な調査のために多数の寄生虫の要件においても、トリパノソーム検出のゴールドスタンダードのままです。調査は、寄生虫の生存と成長に不可欠な役割を果たしているトリパノソーム分子の同定を可能にしました。同定された標的は、1つの健康アプローチでヒトと動物の両方に潜在的な抗原を持つ将来のワクチンの基礎を表す可能性がある。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers (Diethylaminoethyl-cellulose Columns)

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

補体の枯渇により特定の細胞集団の枯渇

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

マウス腹腔細胞の分離

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

蛍光活性化細胞選別（FACS）によって特定の細胞集団の精製

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

拡大、精製、及びヒト末梢血NK細胞の機能的評価

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

ホット水 - フェノール抽出によるグラム陰性菌からの精製とリポ多糖の可視化

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

病原体胞の精製から<em&gt;レジオネラ菌</em&gt;感染した食細胞

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

抗原は、コンパクトな多分岐ポリグリセロールのグラフト膜によって機能赤血球を保護

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

アフリカトリパノソーマ症の後期感染を検出するための生物発光イメージング

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

デキストランは、マウスとヒト NK 細胞のレンチ ウイルスの伝達効率を向上します。

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

陰イオン交換器 (ジエチルアミノエチル セルロース列) による血中からのアフリカを含む細胞外の Trypanosomes の精製

陰イオン交換器 (ジエチルアミノエチルセルロース列) による血中からのアフリカを含む細胞外の Trypanosomes の精製