Name: purification of extracellular trypanosomes, including african, from blood by anion-exchangers (diethylaminoethyl-cellulose columns)
Uploaded: 2019-04-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers Diethylaminoethyl-cellulose Columns at JoVE.com

Vi takker alle medlemmer av UMR 177 INTERTRYP IFU CIRAD Université de Bordeaux. Denne forskningen ble støttet av interne finansiering fra Universitetet i Bordeaux og støtte fra ANR, LABEX ParaFrap ANR-11-LABX-0024, og fra Association pour le développement de la recherche no parasitologie et médecine tropicale og tjenesten de coopération et d'action culturelle de l'Ambassade de France à Bangui (Centrafrique).

Undersøkelser likedannet retningslinjene og bruk av forsøksdyr (NIH publikasjonen nr. 85±23, revidert 1996). Protokollene ble godkjent av våre lokale etikk.
1. dyr
<ol><li>Holde kvinnelig sveitsisk (i-1) mus alderen åtte til ti ukens gamle, 20-25 g, i et dyr boliger anlegget femten dager før hvert eksperiment. Huset seg i ventilert boksene beholdes i en beskyttet, temperatur (22 ° C) og fuktighet (50%) kontrollerte rom med 12 timer på/av lyset sykle.</li>
	<li>Gi dyr gratis t...

<ol>
	<li>B&#252;scher, P., Cecchi, G., Jamonneau, V., Priotto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+African+trypanosomiasis.">Human African trypanosomiasis.</a> Lancet. 390 (10110), 2397-2409 (2017).</li><li>Lejon, V., Bentivoglio, M., Franco, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+African+trypanosomiasis.">Human African trypanosomiasis.</a> Handbook of Clinical Neurology. 114, 169-181 (2013).</li><li>Giordani, F., Morrison, L. J., Rowan, T. G., De Koning, H. P., Barrett, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+animal+trypanosomiases+and+their+chemotherapy:+a+review.">The animal trypanosomiases and their chemotherapy: a review.</a> Parasitology. 143 (14), 1862-1889 (2016).</li><li>Aksoy, S., Buscher, P., Lehane, M., Solano, P., Van Den Abbeele, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+African+trypanosomiasis+control:+Achievements+and+challenges.">Human African trypanosomiasis control: Achievements and challenges.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (4), e0005454 (2017).</li><li>B&#252;scher, P., Deborggraeve, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+can+molecular+diagnostics+contribute+to+the+elimination+of+human+African+trypanosomiasis?.">How can molecular diagnostics contribute to the elimination of human African trypanosomiasis?.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (5), 607-615 (2015).</li><li>Truc, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atypical+human+infections+by+animal+trypanosomes.">Atypical human infections by animal trypanosomes.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (9), e2256 (2013).</li><li>Lumsden, W. H., Kimber, C. D., Evans, D. A., Doig, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosoma+brucei:+miniature+anion-exchange+centrifugation+technique+for+detection+of+low+parasitaemias:+adaptation+for+field+use.">Trypanosoma brucei: miniature anion-exchange centrifugation technique for detection of low parasitaemias: adaptation for field use.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (3), 312-317 (1979).</li><li>B&#252;scher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Models+of+Mini+Anion+Exchange+Centrifugation+Technique+(mAECT)+and+Modified+Single+Centrifugation+(MSC)+for+sleeping+sickness+diagnosis+and+staging.">Improved Models of Mini Anion Exchange Centrifugation Technique (mAECT) and Modified Single Centrifugation (MSC) for sleeping sickness diagnosis and staging.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (11), e471 (2009).</li><li>Lanham, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+trypanosomes+from+the+blood+of+infected+rats+and+mice+by+anion-exchangers.">Separation of trypanosomes from the blood of infected rats and mice by anion-exchangers.</a> Nature. 218 (5148), 1273-1274 (1968).</li><li>Lanham, S. M., Godfrey, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+salivarian+trypanosomes+from+man+and+other+mammals+using+DEAE-cellulose.">Isolation of salivarian trypanosomes from man and other mammals using DEAE-cellulose.</a> Experimental Parasitology. 28 (3), 521-534 (1970).</li><li>Humphrey, P. A., Ashraf, M., Lee, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+trypanosomes+in+vivo,+host+body+weight+gains,+and+food+consumption+in+zinc-deficient+mice.">Growth of trypanosomes in vivo, host body weight gains, and food consumption in zinc-deficient mice.</a> Journal of the National Medical Association. 89 (1), 48-56 (1997).</li><li>Lowry, J. E., Leonhardt, J. A., Yao, C., Belden, E. L., Andrews, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+C57BL/6+mice+by+Trypanosoma+musculi+modulates+host+immune+responses+during+Brucella+abortus+cocolonization.">Infection of C57BL/6 mice by Trypanosoma musculi modulates host immune responses during Brucella abortus cocolonization.</a> Journal of Wildlife Diseases. 50 (1), 11-20 (2014).</li><li>Vincendeau, P., Da&#235;ron, M., Daulouede, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+antibody+classes+and+Fc+receptors+responsible+for+phagocytosis+of+Trypanosoma+musculi+by+mouse+macrophages.">Identification of antibody classes and Fc receptors responsible for phagocytosis of Trypanosoma musculi by mouse macrophages.</a> Infection and Immunity. 53 (3), 600-605 (1986).</li><li>Vincendeau, P., Da&#235;ron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosoma+musculi+co-express+several+receptors+binding+rodent+IgM,+IgE,+and+IgG+subclasses.">Trypanosoma musculi co-express several receptors binding rodent IgM, IgE, and IgG subclasses.</a> Journal of Immunology. 142 (5), 1702-1709 (1989).</li><li>Holzmuller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+and+pathogenicity+patterns+of+Trypanosoma+bruceigambiense+field+isolates+in+experimentally+infected+mouse:+differences+in+host+immune+response+modulation+by+secretome+and+proteomics.">Virulence and pathogenicity patterns of Trypanosoma bruceigambiense field isolates in experimentally infected mouse: differences in host immune response modulation by secretome and proteomics.</a> Microbes and Infections. 10 (1), 79-86 (2008).</li><li>Holzmuller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+parasites+and+their+excreted-secreted+factors+modulate+the+inducible+metabolism+of+L-arginine+in+macrophages?.">How do parasites and their excreted-secreted factors modulate the inducible metabolism of L-arginine in macrophages?.</a> Frontiers in Immunology. 9, 778 (2018).</li><li>Abrahamson, I. A., Da Silva, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-dependent+cytotoxicity+against+Trypanosoma+cruzi.">Antibody-dependent cytotoxicity against Trypanosoma cruzi.</a> Parasitology. 75 (3), 317-323 (1977).</li><li>Herbert, W. J., Lumsden, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosoma+brucei:+a+rapid+&amp;#34;matching&amp;#34;+method+for+estimating+the+host's+parasitemia.">Trypanosoma brucei: a rapid &amp;#34;matching&amp;#34; method for estimating the host's parasitemia.</a> Experimental Parasitology. 40 (3), 427-431 (1976).</li><li>Dauchy, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosoma+brucei+CYP51:+Essentiality+and+Targeting+Therapy+in+an+Experimental+Model.">Trypanosoma brucei CYP51: Essentiality and Targeting Therapy in an Experimental Model.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (11), e0005125 (2016).</li><li>Raz, B., Iten, M., Grether-B&#252;hler, Y., Kaminsky, R., Brun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Alamar+Blue+assay+to+determine+drug+sensitivity+of+African+trypanosomes+(T.+b.+rhodesiense+and+T.+b.+gambiense)+in+vitro.">The Alamar Blue assay to determine drug sensitivity of African trypanosomes (T. b. rhodesiense and T. b. gambiense) in vitro.</a> Acta Tropica. 68 (2), 139-147 (1997).</li><li>Albright, J. W., Albright, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+growth+of+Trypanosoma+musculi+in+cell-free+medium+conditioned+by+rodent+macrophages+and+mercaptoethanol.">In vitro growth of Trypanosoma musculi in cell-free medium conditioned by rodent macrophages and mercaptoethanol.</a> International Journal for Parasitology. 10 (2), 137-142 (1980).</li><li>Gobert, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-Arginine+availability+modulates+local+nitric+oxide+production+and+parasite+killing+in+experimental+trypanosomiasis.">L-Arginine availability modulates local nitric oxide production and parasite killing in experimental trypanosomiasis.</a> Infection and Immunity. 68 (8), 4653-4657 (2000).</li><li>De Muylder, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Trypanosoma+brucei+kinesin+heavy+chain+promotes+parasite+growth+by+triggering+host+arginase+activity.">A Trypanosoma brucei kinesin heavy chain promotes parasite growth by triggering host arginase activity.</a> PLoS Pathogens. 9 (10), e1003731 (2013).</li><li>Nzoumbou-Boko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosoma+musculi+Infection+in+Mice+Critically+Relies+on+Mannose+Receptor-Mediated+Arginase+Induction+by+a+TbKHC1+Kinesin+H+Chain+Homolog.">Trypanosoma musculi Infection in Mice Critically Relies on Mannose Receptor-Mediated Arginase Induction by a TbKHC1 Kinesin H Chain Homolog.</a> Journal of Immunology. 199 (5), 1762-1771 (2017).</li><li>Bonhivers, M., Nowacki, S., Landrein, N., Robinson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+the+trypanosome+endo-exocytotic+organelle+is+cytoskeleton+mediated.">Biogenesis of the trypanosome endo-exocytotic organelle is cytoskeleton mediated.</a> PLoS Biology. 6 (5), e105 (2008).</li><li>Albisetti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+the+flagellar+pocket+collar+and+the+hook+complex+via+a+novel+microtubule-binding+protein+in+Trypanosoma+brucei.">Interaction between the flagellar pocket collar and the hook complex via a novel microtubule-binding protein in Trypanosoma brucei.</a> PLoS Pathogens. 13 (11), e1006710 (2017).</li><li>Cross, G. A. M., Klein, R. A., Linstead, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+amino+acids+by+Trypanosoma+brucei+in+culture:+L-threonine+as+a+precursor+for+acetate.">Utilization of amino acids by Trypanosoma brucei in culture: L-threonine as a precursor for acetate.</a> Parasitology. 71 (2), 311-326 (1975).</li><li>Bringaud, F., Rivi&#232;re, L., Coustou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+of+trypanosomatids:+adaptation+to+available+carbon+sources.">Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 149 (1), 1-9 (2006).</li><li>Mazet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+central+metabolism+of+the+bloodstream+forms+of+Trypanosoma+brucei:+production+of+acetate+in+the+mitochondrion+is+essential+for+the+parasite+viability.">Revisiting the central metabolism of the bloodstream forms of Trypanosoma brucei: production of acetate in the mitochondrion is essential for the parasite viability.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (12), e2587 (2013).</li><li>Coutton, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+CFAP43+and+CFAP44+cause+male+infertility+and+flagellum+defects+in+Trypanosoma+and+human.">Mutations in CFAP43 and CFAP44 cause male infertility and flagellum defects in Trypanosoma and human.</a> Nature Communications. 9 (1), 686 (2018).</li><li>Cnops, J., Magez, S., De Trez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escape+mechanisms+of+African+trypanosomes:+Why+trypanosomosis+is+keeping+us+awake.">Escape mechanisms of African trypanosomes: Why trypanosomosis is keeping us awake.</a> Parasitology. 142 (3), 417-427 (2015).</li><li>Barrett, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-Based+Approaches+to+the+Isolation+of+African+Trypanosomes.">Microfluidics-Based Approaches to the Isolation of African Trypanosomes.</a> Pathogens. 6 (4), (2017).</li><li>Taylor, A. E., Lanham, S. M., Williams, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+methods+of+preparation+on+the+infectivity,+agglutination,+activity,+and+ultrastructure+of+bloodstream+trypanosomes.">Influence of methods of preparation on the infectivity, agglutination, activity, and ultrastructure of bloodstream trypanosomes.</a> Experimental Parasitology. 35 (2), 196-208 (1974).</li><li>Gutteridge, W. E., Cover, B., Gaborak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+blood+and+intracellular+forms+of+Trypanosoma+cruzi+from+rats+and+other+rodents+and+preliminary+studies+of+their+metabolism.">Isolation of blood and intracellular forms of Trypanosoma cruzi from rats and other rodents and preliminary studies of their metabolism.</a> Parasitology. 76 (2), 159-176 (1978).</li><li>Cruz-Saavedra, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Trypanosoma+cruzi+metacyclic+trypomastigotes+by+ion+exchange+chromatography+in+sepharose-DEAE,+a+novel+methodology+for+host-pathogen+interaction+studies.">Purification of Trypanosoma cruzi metacyclic trypomastigotes by ion exchange chromatography in sepharose-DEAE, a novel methodology for host-pathogen interaction studies.</a> Journal of Microbiological Methods. 142, 27-32 (2017).</li><li>Lemesre, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+protection+against+canine+visceral+leishmaniasis+using+the+LiESAp-MDP+vaccine+in+endemic+areas+of+France:+double-blind+randomised+efficacy+field+trial.">Long-lasting protection against canine visceral leishmaniasis using the LiESAp-MDP vaccine in endemic areas of France: double-blind randomised efficacy field trial.</a> Vaccine. 25 (21), 4223-4234 (2007).</li></ol>

Renset trypanosomes representerer en kraftig måte å studere immunologi, biokjemi, mobil og molekylærbiologi. Store flater og resultatene er anskaffet fra trypanosomes, som deretter har bidratt til å hente informasjon fra andre eukaryotic celler30. Trypanosomes er også gjenstand for viktig og interessant forskning fordi de har utformet flere mekanismer som tillater dem å overleve og vokse i to svært forskjellige miljøer: tsetse fly vektoren og pattedyr vert23,</...

Metoden presentert beskrevet her kan separasjon av trypanosomes, ansvarlig for dyr og menneskelige Sovesyke (HAT), blod parasitter. Dette er den beste metoden for diagnostisering av første etappe lue og videre denne parasite rensing metoden tillater robust serologisk og forskning etterforskning.
HAT er forårsaket av Tsetse fly overført Trypanosoma brucei gambiense og T. b. rhodesiense1. Parasittene protozoan multiplisere extracellularly i blodet, lymfe og interstitiell væske under den første fasen av sykdommen (hemolymphatic scenen). Den andre fasen (meningoencephalitic scenen) begynner når parasitter krysser blod-hjernebarrieren; nevrologiske tegn, inkludert en søvnforstyrrelse, som har gitt sitt navn "Sovesyke" denne sykdommen, er typisk for denne andre fase2. Relaterte trypanosomes (T. evansi, T. congolense, T. Samsung, T. b. brucei) er den utløsende agenter dyr afrikanske trypanosomosis (AAT)3.
World Health Organization (WHO) har som mål å eliminere HATTEN som et folkehelseproblem 2020 og unngå overføring av 20304. Den nylige lanseringen av rask diagnose tester har forbedret serologisk diagnose1,4,5. Flere molekylær diagnostiske tester har blitt utviklet, men deres rolle i feltet diagnostikk er ennå ikke etablert5. De brukes til å identifisere underarter av brucei grupper og atypiske trypanosomiasis skyldes parasitter ansvarlig for dyr trypanosomosis6.
Gjenkjenning av parasitten er viktig for diagnostisering, behandling og oppfølging, som serologi kan gi falske positive og dessverre falske negative resultater1. Direkte microscopical observasjon av disse hemoflagellate er vanskelig i HAT saker som er forårsaket av T. b. gambiense, (mer enn 95% av tilfellene) som lav parasitemias er regelen, mens for HAT forårsaket av T. b. rhodesiense, en stor antall parasitter er ofte tilstede i blodet. Ulike konsentrasjon teknikker har blitt brukt og tykk drop og kapillær tube sentrifugering (CTC), men separasjon av parasitter fra blod fra en kolonne av anion-veksler (DEAE cellulose) etterfulgt av sentrifugering og mikroskopiske observasjon av den pellets, er den mest sensitive metoden (rundt 50 parasitter/mL blod kan oppdages)1,7. Følgelig rensing av trypanosomes av denne anion-vekslere (DEAE cellulose) metoden er best, og til dags dato, metoden referanse for å visualisere og isolere parasitter fra blod for HAT diagnose. I feltforhold, en mini kolonne med DEAE cellulose har blitt brukt og flere forbedringer har tilrettelagt microscopical observasjon7,8.
Metoden trypanosome atskillelse fra blod, beskrevet nedenfor, avhengig av parasitten overflaten kostnad, som er mindre negativ enn blod pattedyrceller9. Interessant, denne metoden ble utviklet 50 år siden, i 1968 av Dr. Sheila Lanham, og fortsatt gullstandarden for deteksjon og utarbeidelse av blodet trypanosomes. Det er raskt og reproduserbar for salivarian trypanosomes fra et bredt spekter av pattedyr, tillater diagnostisering av både dyr og menneskelige trypanosomiasis10.
For å få levende, renset parasitter, er infisert blod lagt inn på en anion-veksler kolonne. Kromatografi forhold (hovedsakelig pH, ionisk styrke av buffere/media) må tilpasses til hver trypanosome arter, og mer generelt, til hver blanding av pattedyr blodceller og trypanosomes10. Elueringsbufferen justeres nøyaktig til pH 8 for de fleste afrikanske trypanosomes10. Denne metoden favoriserer konsentrasjonen av parasitter som finnes i blodet av pasienter, fordi parasitemias kan være for lav til å bli oppdaget av mikroskopiske observasjon alene, og det gjør også laboratorieundersøkelser. Arbeide med fersk isolerte trypanosomes og blod fra infiserte dyr, bruker denne teknikken, er mer relevant for ulike undersøkelser enn studier med parasitter som har vært kultivert i axenic forhold i laboratoriet på ubestemt tid.
Host-parasitten relasjoner er best studerte med en parasitt infeksjon naturlig verten, derfor T. musculi, en naturlig murine parasitten, som er representant for ekstracellulære trypanosomes, har mange fordeler som murine infeksjon innebærer i en lite laboratorium dyr og krever ikke biohazard sikkerhetsforhold nivå (BSL). T. musculi dreper ikke immunkompetente mus, i motsetning til mange andre Trypanosoma arter, inkludert mennesker. T. musculi er ikke eliminert i T celle-belastede mus og parasitemias kan økes i infiserte mus ved å endre mat og næringsstoff inntak11. Denne parasitten modulerer immunrespons i co infeksjoner med12andre patogener. T. musculi fra infiserte mus utstillingen forskjeller fra kulturperler T. musculi, for eksempel uttrykk for membran Fc reseptorer er tapt i T. musculi axenic kulturer, sammenlignet med parasitter renset fra infiserte mus13 , 14. Excreted-utskilles faktorer (ESF) er også kvalitativt og kvantitativt mindre uttrykt i axenic trypanosome kulturer og forskjellige stammer isolert i endemiske områder15. ESF er de første antigener vises for immunforsvaret vert og så spille en viktig rolle i første verten immunrespons16.
I eksperimentelt infiserte dyr for laboratorieundersøkelser forenkler denne protokollen eksperimenter på et større antall parasitter, minimere antall mus kreves særlig når benytter svekket immunapparat dyr. De varianten overflate glykoproteiner (VSGs) som brukes i kortet agglutinerende testen for Trypanosomiasis (CATT) i masse screening er fortsatt renset fra trypanosomes som gjennomføres i rotter. De to rask diagnostiske testene (individuelt pakket kassetter) som er nå tilgjengelig for bruk i feltet fortsatt bruker en infeksiøs modell kilde til opprinnelig VSGs og ikke i vitro kultivert trypanosomes1,4, 5. fremme i studiet av trypanosome immunologi og biologi har blitt lettere siden disse DEAE cellulose renset parasitter kan lett få store mengder fra naturlig eller eksperimentelt infiserte verter og spesielt gnagere.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1036px;" width="1036">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">10 mL Pipettes&#160;</td>
			<td style="width:381px;">Falcon</td>
			<td style="width:184px;">357,551</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">2 mL Pipettes&#160;</td>
			<td style="width:381px;">Falcon</td>
			<td style="width:184px;">352,507</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Centrifugation tube 50 mL</td>
			<td style="width:381px;">Falcon</td>
			<td style="width:184px;">352,070</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:381px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">4K15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">DEAE cellulose</td>
			<td style="width:381px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:184px;">s/c- 211213</td>
			<td>100 G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">filter paper&#160;</td>
			<td style="width:381px;">Whatman</td>
			<td style="width:184px;">1,001,125</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Flat bottom flask narrow neck</td>
			<td style="width:381px;">Duran</td>
			<td style="width:184px;">21 711 76</td>
			<td style="width:172px;">6000 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Glucose&#160;</td>
			<td style="width:381px;">VWR</td>
			<td style="width:184px;">101174Y</td>
			<td>500 G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Heparin</td>
			<td style="width:381px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">H3149-50KU</td>
			<td>5 000 U</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:299px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:381px;">VWR</td>
			<td style="width:184px;">120 26936.260</td>
			<td>500 G</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:299px;">Microscope</td>
			<td style="width:381px;">Olympus</td>
			<td style="width:184px;">CH-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope coverslips</td>
			<td style="width:381px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:184px;">CB00100RA020MNT0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:381px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:184px;">AGAA000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:299px;">Na2HPO4&#160;</td>
			<td style="width:381px;">VWR</td>
			<td style="width:184px;">100 28026;260</td>
			<td>500 G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">NaCl</td>
			<td style="width:381px;">VWR</td>
			<td style="width:184px;">27800.291</td>
			<td>1 KG</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:299px;">NaH2PO4&#160;</td>
			<td style="width:381px;">VWR</td>
			<td style="width:184px;">110 33616;262</td>
			<td>500 G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Nalgene Plastic Media Bottles size 125 mL</td>
			<td style="width:381px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:184px;">342024-0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Nalgene Plastic Media Bottles size 500 mL</td>
			<td style="width:381px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:184px;">342024-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Pasteur Pipette</td>
			<td style="width:381px;">VWR</td>
			<td style="width:184px;">BRND125400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Penicillin 10,000 UI/Streptomycin 10,000 &#181;g</td>
			<td style="width:381px;">EUROBIO</td>
			<td style="width:184px;">CABPES01 OU</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Phenol red</td>
			<td style="width:381px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">P0290</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Syringue&#160;</td>
			<td style="width:381px;">Dutscher</td>
			<td style="width:184px;">SS+10S21381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Tissue culture hood</td>
			<td style="width:381px;">Thermoelectro Corporation</td>
			<td style="width:184px;">MSC-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Trypanosoma brucei brucei</td>
			<td style="width:381px;">Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium).</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td>ANTAT 1.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Trypanosoma brucei gambiense</td>
			<td style="width:381px;">Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium).</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td>ITMAP 1893</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Trypanosoma musculi</td>
			<td>London School of Hygiene and Tropical Medicine (UK)</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td>Partinico II</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of extracellular trypanosomes, including african, from blood by anion-exchangers (diethylaminoethyl-cellulose columns)

Denne metoden tillater separasjon av trypanosomes, parasitter ansvarlig for dyr og menneskelige Sovesyke (HAT), fra infisert blod. Dette er den beste metoden for diagnostisering av første etappe lue og videre denne parasite rensing metoden tillater serologisk og forskning undersøkelser.
HAT er forårsaket av Tsetse fly overført Trypanosoma brucei gambiense og T. b. rhodesiense. Relaterte trypanosomes er den forårsaker agenter av dyr trypanosomiasis. Trypanosome påvisning er viktig for HAT diagnose, behandling og oppfølging. Teknikken er beskrevet her er det mest sensitive parasitten oppdagelsen teknikken, tilpasset feltforhold for diagnostisering av T. b. gambiense lue og kan fullføres innen én time. Blod er lagdelt på en anion-veksler kolonne (DEAE cellulose) tidligere justert til pH 8, og elueringsbufferen er lagt. Svært negativt ladde blod celler er adsorbert på kolonnen mens de mindre negativt ladde trypanosomes passerer gjennom. Samlet trypanosomes pelleted med sentrifugering og observert av mikroskopi. Videre er parasitter utarbeidet uten cellular skade samtidig som deres infectivity.
Renset trypanosomes kreves for immunologiske testing; de brukes i trypanolysis analysen, gullstandarden i HAT serologi. Farget parasitter benyttes i kortet agglutinerende test (CATT) for feltet serologi. Antigener fra renset trypanosomes, som variant overflaten glykoprotein, exoantigens, brukes også i ulike immunanalyser. Fremgangsmåten som er beskrevet her er beregnet for afrikanske trypanosomes; Følgelig må kromatografi forholdene tilpasses til hver trypanosome stamme, og mer generelt, blod hver art av verten pattedyr.
Disse fascinerende patogener er lett renset og tilgjengelig for bruk i biokjemiske, molekylære og cellen biologi studier inkludert co kultur med verten cellene til å undersøke vert-parasitten relasjoner på nivå med membran reseptorer, signalisering og genet uttrykk. Drug testing i vitro; undersøkelse av genet sletting, mutasjon eller overuttrykte på metabolske prosesser, cellen cytoskjelett biogenesis og parasitten overlevelse.

Renset trypanosomes har blitt brukt i farmasøytisk tester. Parasitter overføres i kultur brønner som inneholder føljetong fortynninger av konkrete narkotika, enten alene eller blandet19. Mikroskopiske observasjoner, evaluere motilitet er en markør for levedyktighet, kan utføres når bare noen dugs blir testet, mens AlamarBlue celle levedyktighet analysen er en utmerket metode for store motilitet analyser i narkotikarelaterte screening20</sup...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers Diethylaminoethyl-cellulose Columns at JoVE.com

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers Diethylaminoethyl-cellulose Columns

Denne metoden trypanosome separasjon fra blod avhenger sine overflaten kostnader blir mindre negativ enn blod pattedyrceller. Infisert blod er plassert og behandlet på en anion-veksler kolonne. Denne metoden, den mest passende diagnose på Sovesyke, gir immunologiske, biologiske, biokjemiske, farmasøytisk og molekylærbiologi undersøkelser renset parasitter.

Rensing av ekstracellulære Trypanosomes, inkludert afrikansk, fra blod av Anion-vekslere (Diethylaminoethyl innen kolonner)

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is ...

Afrikanske trypanosomer er ansvarlige for menneskelig afrikansk trypanosomiasis, eller sovesyke og dyr afrikansk trypanosomiasis. Trypanosomene som forårsaker sovesyke er tsetse fly overført protist parasitter tilstede i mange geografiske foci i Afrika sør for Sahara. Påvisning av parasitten er avgjørende for diagnose, behandling og oppfølging.En serologi kan gi falske positive og dessverre falske negative resultater. For å hjelpe deteksjon i blodet, trypanosomer må være konsentrert. Ulike parasittkonsentrasjonsteknikker har blitt brukt.Den mest følsomme metoden er separasjon av parasitter fra blod av en kolonne med anionveksler, DEAE cellulose etterfulgt av sentrifugering og mikroskopisk observasjon. Følgelig er DEAE cellulosemetoden den beste og forblir til dags dato, referansemetoden for å visualisere og isolere parasitter fra blod for menneskelig afrikansk trypanosomiasis diagnose, spesielt i feltforhold. Denne metoden gir den mest passende diagnostiske for afrikansk trypanosomiasis også rensede parasitter for immunologiske, biologiske, biokjemiske, farmasøytiske og molekylære biologiske undersøkelser.Alle undersøkelser som er i samsvar med veiledningen for omsorg og bruk av laboratoriedyr og enighet er innhentet fra franske myndigheter, og alle protokollene som brukes, er godkjent av vår lokale etikkkomité. Vei ut hvert stoff i henhold til den skriftlige protokollen. Tilsett destillert vann og juster nøyaktig til pH 8 med kaliumdihydrogenfosfat for å gjøre følgende bufrede løsninger, konsentrert fosfatbuffer saltvann 2X.Tilsett destillert vann og glukose for fosfatbufret saltvannsglukose. For 100 milliliter elution buffer, tilsett 100 enheter per milliliter penicillin, 100 mikrogram per milliliter streptomycin, og fem mikrogram milliliter fenol rød til fosfat bufret saltvannglukose. 100 gram DEAE cellulose vaskes først med tre liter destillert vann og deretter igjen for å bosette seg.Fine partikler kastes. Vaskene gjentas til supernatanten er klar. Konsentrert fosfatbufret saltvann 2X tilsettes og DEAE cellulose omrøres.PH justeres til åtte med ett molakaliumfosfat. Cellulosen vaskes deretter to ganger med destillert vann og to ganger med fosfatbufret saltvannsglukose. DEAE cellulose og fosfat bufret saltvannsglukose blandes i like store mengder.Legering quartered og lagret ved romtemperatur eller fire grader celsius eller ved minus 20 grader celsius for langvarig lagring. Trypanosom infisert blod lagres i flytende nitrogen. En legerings quart på en milliliter tines ved romtemperatur.Parasitter samles forsiktig fra kryorøret ved hjelp av en nål og en en milliliter sprøyte. Levedyktigheten til tinte parasitter vurderes av motiliteten som visualisert ved lett mikroskopiobservasjon før infeksjon. Parasitter injiseres i bukhinnehulene til to mus, 500 mikroliter per mus.Hver dag etter infeksjon vurderes parasittemi ved å samle en dråpe blod fra halen med en nål og sjekkes av mikroskopi. Når parasittemien er på et passende nivå, samles infisert blod. En 10 milliliter sprøyte støttes i en klemme eller holder, og et forhåndskuttet stykke filterpapir tilsettes.Forberedt DEAE cellulose helles i sprøyten opp til åtte eller ni milliliter nivå. Kolonnen vaskes med elutionbufferen. To milliliter infisert blod er nøye plassert på toppen av kolonnen og trypanosomer samles i kolonnen eluate i et 50 milliliter sentrifugasjonsrør.Elution buffer legges regelmessig i henhold til transitt av trypanosomer. Transitt av trypanosomer gjennom kolonnen kontrolleres ved å ta en dråpe kolonne eluate med jevne mellomrom og observere for trypanosomer ved hjelp av lett mikroskopi. Når trypanosomer ikke lenger observeres i eluatet, sentrifugeres konisk rør ved 1, 800 ganger G i 10 minutter ved fire grader celsius.Det supernatante kastes og trypanosomer i pallen telles med et hemocytometer. Innsamlede trypanosomer fortynnes deretter i mediet som kreves for den planlagte undersøkelsen. Denne metoden gir den mest passende diagnostiske for afrikansk trypanosomiasis rensede parasitter for immunologiske, biologiske, biokjemiske, farmasøytiske og molekylære biologiske undersøkelser.Disse studiene er utviklet fordi DEAE cellulose rensede parasitter lett kan oppnås i store mengder fra naturlig eller eksperimentelt infiserte verter og spesielt gnagere. Trypanosom levedyktighet i nærvær av farmasøytiske midler vurderes ved mikroskopisk observasjon. Parasitt levedyktighet er forbundet med motilitet og kan derfor kontrolleres med øye under et lett mikroskop ved 40 ganger eller høyere forstørrelse.Parasitt levedyktighet vurderes ved å måle prosentandelen av motile former. Fortynninger av testforbindelser legges til hver brønn av en 96 brønnvevskulturplate mens kontrollbrønner blir latterligbehandlet. Hver konsentrasjon vurderes i triplicate.Antall levedyktige parasitter for hver fortynning sammenlignes med antall parasitter i kontrollbrønner. Effekten av Pentamidin, et referansestoff, som brukes i human afrikansk trypanosomiasis terapi vises i denne figuren. Trypanosome makrofagskokulturer tillater undersøkelse av vertsparasittinteraksjon på cellenivå.I makrofag parasitt co-kulturer, ekstra cellulære trypanosomer indusere produksjon av makrofag arginase som hydrolyser arginin til ornitin. Ornitin er forløperen til polyaminer og trypanothione, avgjørende for parasittoverlevelse og vekst. Videre reduserer argininuttømming produksjonen av trypanocidale nitrogenoksid.Deretter, tillegg av en arginasehemmer, reduserer S-L-cystein til co-kulturer dramatisk makrofagindusert parasittvekst. Arginase induksjon er mediert ved trypanosom utskilt og eller utskilt faktorer. Denne arginaseinduserende faktoren er identifisert som en orthine kinesin.Kinesin binder seg til C-type lectin mannose bindende reseptorer. Arginase er indusert og produserer ornitin som favoriserer parasittvekst. Arginase induseres ikke av kinesin i makrofager dyrket med 12,5 millimolar mannose eller i makrofager fra mus der makrofagene mannosereseptorer har blitt slettet.Ytterligere eksempler på cellebiologi og biokjemisk eksperimentering ved hjelp av DAEA cellulose renset trypanosomer er demonstrert i studier der nye cytoskeletale proteiner som BILBO1 er identifisert. BILBO1 er nødvendig for biogenese av viktige cytoskeletale strukturer og parasittoverlevelse. Dermed representerer BILBO1 et viktig mål for intervensjon i patogene trypanosomer.Et bilde som viser immunoflourescence merking av en blodbanen kultur form, trypanosoma brucei celle probed med en anti-BILBO1 antistoff er vist i denne figuren. I tillegg har glukose og treganginmetabolisme blitt beskrevet ved hjelp av DEAE cellulose renset trypanosomer og enzymer involvert i disse prosessene har blitt eksperimentelt validert. En skjematisk representasjon av glukose og treonin metabolisme i blodet-dannet trypanosomer er vist i denne figuren.Rensing av afrikanske trypanosomer fra blod ved anionutveksling DEAE cellulose kolonner med nylige forbedringer forblir gullstandarden for trypanosom deteksjon, ikke bare i naturlige verter med lave parasitter i endemiske områder, men også for kravet om parasitter i stort antall for eksperimentelle undersøkelser. Undersøkelser har tillatt identifisering av trypanosommolekyler som spiller viktige roller i parasittoverlevelse og vekst. Identifiserte mål kan representere grunnlaget for en fremtidig vaksine med potensielle antigener for både mennesker og dyr i en helsetilnærming.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers (Diethylaminoethyl-cellulose Columns)

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Rensing og Visualisering av lipopolysakkarid fra Gram-negative bakterier ved Hot Vandig-fenol Extraction

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Rensing av Patogen vakuoler fra<em&gt; Legionella</em&gt;-Infiserte fagocytter

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Antigener Beskyttet Funksjonell røde blodceller av membranen Pode av kompakt hyperforgrenede Polyglycerols

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Bioluminesens Imaging å oppdage sent stadium smitte av sovesyke

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dekstran forbedrer Lentiviral signaltransduksjon effektiviteten av Murine og menneskelig primære NK celler

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...