Name: purification of extracellular trypanosomes, including african, from blood by anion-exchangers (diethylaminoethyl-cellulose columns)
Uploaded: 2019-04-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers Diethylaminoethyl-cellulose Columns at JoVE.com

Vi tackar alla medlemmar i UMR 177 INTERTRYP IRD CIRAD Université de Bordeaux. Denna forskning stöddes av intern finansiering från universitetet i Bordeaux och stöd från ANR, LABEX ParaFrap ANR-11-LABX-0024, och föreningen pour le développement de la recherche sv Parasitologien et médecine tropicale och den Service de coopération et d'action culturelle de l'Ambassade de France à Bangui (Centrafrique).

Utredningar överensstämde till riktlinjerna för vård och användning av försöksdjur (NIH publikation nr 85±23, reviderad 1996). Protokoll godkändes av våra lokala etiska kommittén.
1. djur
<ol><li>Hålla Swiss (OF-1) honmöss i åldern åtta till tio veckor gammal, 20-25 g, i ett djur bostäder anläggning femton dagar före varje experiment. Hus i ventilerade lådor som hålls i en skyddad, rumstemperatur (22 ° C) och luftfuktighet (50%) kontrolleras med 12 timmar på/av ...

<ol>
	<li>B&#252;scher, P., Cecchi, G., Jamonneau, V., Priotto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+African+trypanosomiasis.">Human African trypanosomiasis.</a> Lancet. 390 (10110), 2397-2409 (2017).</li><li>Lejon, V., Bentivoglio, M., Franco, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+African+trypanosomiasis.">Human African trypanosomiasis.</a> Handbook of Clinical Neurology. 114, 169-181 (2013).</li><li>Giordani, F., Morrison, L. J., Rowan, T. G., De Koning, H. P., Barrett, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+animal+trypanosomiases+and+their+chemotherapy:+a+review.">The animal trypanosomiases and their chemotherapy: a review.</a> Parasitology. 143 (14), 1862-1889 (2016).</li><li>Aksoy, S., Buscher, P., Lehane, M., Solano, P., Van Den Abbeele, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+African+trypanosomiasis+control:+Achievements+and+challenges.">Human African trypanosomiasis control: Achievements and challenges.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (4), e0005454 (2017).</li><li>B&#252;scher, P., Deborggraeve, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+can+molecular+diagnostics+contribute+to+the+elimination+of+human+African+trypanosomiasis?.">How can molecular diagnostics contribute to the elimination of human African trypanosomiasis?.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (5), 607-615 (2015).</li><li>Truc, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atypical+human+infections+by+animal+trypanosomes.">Atypical human infections by animal trypanosomes.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (9), e2256 (2013).</li><li>Lumsden, W. H., Kimber, C. D., Evans, D. A., Doig, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosoma+brucei:+miniature+anion-exchange+centrifugation+technique+for+detection+of+low+parasitaemias:+adaptation+for+field+use.">Trypanosoma brucei: miniature anion-exchange centrifugation technique for detection of low parasitaemias: adaptation for field use.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (3), 312-317 (1979).</li><li>B&#252;scher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Models+of+Mini+Anion+Exchange+Centrifugation+Technique+(mAECT)+and+Modified+Single+Centrifugation+(MSC)+for+sleeping+sickness+diagnosis+and+staging.">Improved Models of Mini Anion Exchange Centrifugation Technique (mAECT) and Modified Single Centrifugation (MSC) for sleeping sickness diagnosis and staging.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (11), e471 (2009).</li><li>Lanham, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+trypanosomes+from+the+blood+of+infected+rats+and+mice+by+anion-exchangers.">Separation of trypanosomes from the blood of infected rats and mice by anion-exchangers.</a> Nature. 218 (5148), 1273-1274 (1968).</li><li>Lanham, S. M., Godfrey, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+salivarian+trypanosomes+from+man+and+other+mammals+using+DEAE-cellulose.">Isolation of salivarian trypanosomes from man and other mammals using DEAE-cellulose.</a> Experimental Parasitology. 28 (3), 521-534 (1970).</li><li>Humphrey, P. A., Ashraf, M., Lee, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+trypanosomes+in+vivo,+host+body+weight+gains,+and+food+consumption+in+zinc-deficient+mice.">Growth of trypanosomes in vivo, host body weight gains, and food consumption in zinc-deficient mice.</a> Journal of the National Medical Association. 89 (1), 48-56 (1997).</li><li>Lowry, J. E., Leonhardt, J. A., Yao, C., Belden, E. L., Andrews, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+C57BL/6+mice+by+Trypanosoma+musculi+modulates+host+immune+responses+during+Brucella+abortus+cocolonization.">Infection of C57BL/6 mice by Trypanosoma musculi modulates host immune responses during Brucella abortus cocolonization.</a> Journal of Wildlife Diseases. 50 (1), 11-20 (2014).</li><li>Vincendeau, P., Da&#235;ron, M., Daulouede, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+antibody+classes+and+Fc+receptors+responsible+for+phagocytosis+of+Trypanosoma+musculi+by+mouse+macrophages.">Identification of antibody classes and Fc receptors responsible for phagocytosis of Trypanosoma musculi by mouse macrophages.</a> Infection and Immunity. 53 (3), 600-605 (1986).</li><li>Vincendeau, P., Da&#235;ron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosoma+musculi+co-express+several+receptors+binding+rodent+IgM,+IgE,+and+IgG+subclasses.">Trypanosoma musculi co-express several receptors binding rodent IgM, IgE, and IgG subclasses.</a> Journal of Immunology. 142 (5), 1702-1709 (1989).</li><li>Holzmuller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+and+pathogenicity+patterns+of+Trypanosoma+bruceigambiense+field+isolates+in+experimentally+infected+mouse:+differences+in+host+immune+response+modulation+by+secretome+and+proteomics.">Virulence and pathogenicity patterns of Trypanosoma bruceigambiense field isolates in experimentally infected mouse: differences in host immune response modulation by secretome and proteomics.</a> Microbes and Infections. 10 (1), 79-86 (2008).</li><li>Holzmuller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+parasites+and+their+excreted-secreted+factors+modulate+the+inducible+metabolism+of+L-arginine+in+macrophages?.">How do parasites and their excreted-secreted factors modulate the inducible metabolism of L-arginine in macrophages?.</a> Frontiers in Immunology. 9, 778 (2018).</li><li>Abrahamson, I. A., Da Silva, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-dependent+cytotoxicity+against+Trypanosoma+cruzi.">Antibody-dependent cytotoxicity against Trypanosoma cruzi.</a> Parasitology. 75 (3), 317-323 (1977).</li><li>Herbert, W. J., Lumsden, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosoma+brucei:+a+rapid+&amp;#34;matching&amp;#34;+method+for+estimating+the+host's+parasitemia.">Trypanosoma brucei: a rapid &amp;#34;matching&amp;#34; method for estimating the host's parasitemia.</a> Experimental Parasitology. 40 (3), 427-431 (1976).</li><li>Dauchy, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosoma+brucei+CYP51:+Essentiality+and+Targeting+Therapy+in+an+Experimental+Model.">Trypanosoma brucei CYP51: Essentiality and Targeting Therapy in an Experimental Model.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (11), e0005125 (2016).</li><li>Raz, B., Iten, M., Grether-B&#252;hler, Y., Kaminsky, R., Brun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Alamar+Blue+assay+to+determine+drug+sensitivity+of+African+trypanosomes+(T.+b.+rhodesiense+and+T.+b.+gambiense)+in+vitro.">The Alamar Blue assay to determine drug sensitivity of African trypanosomes (T. b. rhodesiense and T. b. gambiense) in vitro.</a> Acta Tropica. 68 (2), 139-147 (1997).</li><li>Albright, J. W., Albright, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+growth+of+Trypanosoma+musculi+in+cell-free+medium+conditioned+by+rodent+macrophages+and+mercaptoethanol.">In vitro growth of Trypanosoma musculi in cell-free medium conditioned by rodent macrophages and mercaptoethanol.</a> International Journal for Parasitology. 10 (2), 137-142 (1980).</li><li>Gobert, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-Arginine+availability+modulates+local+nitric+oxide+production+and+parasite+killing+in+experimental+trypanosomiasis.">L-Arginine availability modulates local nitric oxide production and parasite killing in experimental trypanosomiasis.</a> Infection and Immunity. 68 (8), 4653-4657 (2000).</li><li>De Muylder, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Trypanosoma+brucei+kinesin+heavy+chain+promotes+parasite+growth+by+triggering+host+arginase+activity.">A Trypanosoma brucei kinesin heavy chain promotes parasite growth by triggering host arginase activity.</a> PLoS Pathogens. 9 (10), e1003731 (2013).</li><li>Nzoumbou-Boko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosoma+musculi+Infection+in+Mice+Critically+Relies+on+Mannose+Receptor-Mediated+Arginase+Induction+by+a+TbKHC1+Kinesin+H+Chain+Homolog.">Trypanosoma musculi Infection in Mice Critically Relies on Mannose Receptor-Mediated Arginase Induction by a TbKHC1 Kinesin H Chain Homolog.</a> Journal of Immunology. 199 (5), 1762-1771 (2017).</li><li>Bonhivers, M., Nowacki, S., Landrein, N., Robinson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+the+trypanosome+endo-exocytotic+organelle+is+cytoskeleton+mediated.">Biogenesis of the trypanosome endo-exocytotic organelle is cytoskeleton mediated.</a> PLoS Biology. 6 (5), e105 (2008).</li><li>Albisetti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+the+flagellar+pocket+collar+and+the+hook+complex+via+a+novel+microtubule-binding+protein+in+Trypanosoma+brucei.">Interaction between the flagellar pocket collar and the hook complex via a novel microtubule-binding protein in Trypanosoma brucei.</a> PLoS Pathogens. 13 (11), e1006710 (2017).</li><li>Cross, G. A. M., Klein, R. A., Linstead, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+amino+acids+by+Trypanosoma+brucei+in+culture:+L-threonine+as+a+precursor+for+acetate.">Utilization of amino acids by Trypanosoma brucei in culture: L-threonine as a precursor for acetate.</a> Parasitology. 71 (2), 311-326 (1975).</li><li>Bringaud, F., Rivi&#232;re, L., Coustou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+of+trypanosomatids:+adaptation+to+available+carbon+sources.">Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 149 (1), 1-9 (2006).</li><li>Mazet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+central+metabolism+of+the+bloodstream+forms+of+Trypanosoma+brucei:+production+of+acetate+in+the+mitochondrion+is+essential+for+the+parasite+viability.">Revisiting the central metabolism of the bloodstream forms of Trypanosoma brucei: production of acetate in the mitochondrion is essential for the parasite viability.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (12), e2587 (2013).</li><li>Coutton, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+CFAP43+and+CFAP44+cause+male+infertility+and+flagellum+defects+in+Trypanosoma+and+human.">Mutations in CFAP43 and CFAP44 cause male infertility and flagellum defects in Trypanosoma and human.</a> Nature Communications. 9 (1), 686 (2018).</li><li>Cnops, J., Magez, S., De Trez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escape+mechanisms+of+African+trypanosomes:+Why+trypanosomosis+is+keeping+us+awake.">Escape mechanisms of African trypanosomes: Why trypanosomosis is keeping us awake.</a> Parasitology. 142 (3), 417-427 (2015).</li><li>Barrett, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-Based+Approaches+to+the+Isolation+of+African+Trypanosomes.">Microfluidics-Based Approaches to the Isolation of African Trypanosomes.</a> Pathogens. 6 (4), (2017).</li><li>Taylor, A. E., Lanham, S. M., Williams, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+methods+of+preparation+on+the+infectivity,+agglutination,+activity,+and+ultrastructure+of+bloodstream+trypanosomes.">Influence of methods of preparation on the infectivity, agglutination, activity, and ultrastructure of bloodstream trypanosomes.</a> Experimental Parasitology. 35 (2), 196-208 (1974).</li><li>Gutteridge, W. E., Cover, B., Gaborak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+blood+and+intracellular+forms+of+Trypanosoma+cruzi+from+rats+and+other+rodents+and+preliminary+studies+of+their+metabolism.">Isolation of blood and intracellular forms of Trypanosoma cruzi from rats and other rodents and preliminary studies of their metabolism.</a> Parasitology. 76 (2), 159-176 (1978).</li><li>Cruz-Saavedra, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Trypanosoma+cruzi+metacyclic+trypomastigotes+by+ion+exchange+chromatography+in+sepharose-DEAE,+a+novel+methodology+for+host-pathogen+interaction+studies.">Purification of Trypanosoma cruzi metacyclic trypomastigotes by ion exchange chromatography in sepharose-DEAE, a novel methodology for host-pathogen interaction studies.</a> Journal of Microbiological Methods. 142, 27-32 (2017).</li><li>Lemesre, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting+protection+against+canine+visceral+leishmaniasis+using+the+LiESAp-MDP+vaccine+in+endemic+areas+of+France:+double-blind+randomised+efficacy+field+trial.">Long-lasting protection against canine visceral leishmaniasis using the LiESAp-MDP vaccine in endemic areas of France: double-blind randomised efficacy field trial.</a> Vaccine. 25 (21), 4223-4234 (2007).</li></ol>

Renat innebörder representerar ett kraftfullt medel för att studera immunologi, biokemi, cell- och molekylärbiologi. Stora vidder av data och resultat har erhållits från innebörder, som har sedan hjälpt till att få information från andra eukaryota celler30. Innebörder är också viktig och intressant forskning, eftersom de har utarbetat ett flertal mekanismer som tillåter dem att överleva och växa i två mycket olika miljöer: tsetseflugan vektorn och däggdjur värd...

Metoden presenteras beskrivs här tillåter separation av innebörder, parasiter ansvarar för djurs och människors afrikansk trypanosomiasis (HAT), från blodet. Detta är den bästa metoden för diagnostik av första etappen HAT och dessutom denna parasit reningsmetod tillstånd robust serologiska och forskning undersökning.
HATT är orsakade av tsetseflugan överförs Trypanosoma brucei gambiense och T. b. rhodesiense1. Dessa protozo parasiter multiplicera extracellularly i blodet, lymfan och interstitiell vätska under det första skedet av sjukdomen (hemolymphatic skede). Den andra etappen (meningoencephalitic skede) börjar när parasiter passera blod-hjärnbarriären; neurologiska symtom, inklusive en sömnstörning, som gett sitt namn ”sömnsjuka” till denna sjukdom, är typiska för denna andra etappen2. Relaterade innebörder (T. evansi, T. congolense, T. vivax, T. b. brucei) är smittämnen djur afrikanska trypanosomosis (AAT)3.
World Health organisation (WHO) syftar till att eliminera HAT som ett folkhälsoproblem 2020 och stoppa sändningen av 20304. Den nyligen införandet snabbdiagnos tester har förbättrad serologisk diagnos1,4,5. Flera molekylära diagnostiska tester har utvecklats men deras roll i fältet diagnostik har ännu inte etablerade5. De används för att identifiera underarter av brucei gruppen och atypiska trypanosomiasis orsakas av parasiter som är ansvarig för djurens trypanosomosis6.
Påvisande av parasiten är viktigt för diagnos, behandling och uppföljning, som serologi kan ge falska positiva och tyvärr falska negativa resultat1. Mikroskopiska direkt observation av dessa hemoflagellate protister är svårt i hatt fall som orsakas av T. b. gambiense, (mer än 95% av fallen) som låg parasitemias är regeln, för hatt orsakas av T. b. rhodesiense, en stor antal parasiter är ofta närvarande i blodet. Olika koncentration tekniker har använts, såsom tjock droppe och kapillärrör centrifugering (CTC), men separation av parasiter från blodet genom en kolonn av anjonbytaren (DEAE-cellulosa) följt av centrifugering och mikroskopisk observation av den pellets, är den känsligaste metoden (cirka 50 parasiter/mL blod kan upptäckas)1,7. Följaktligen, rening av innebörder av anjon-värmeväxlare (DEAE-cellulosa) metoden är bäst och hittills, referensmetod för visualisering och isolera parasiter från blod för HAT diagnos. I fältet villkor, en mini kolumn av DEAE-cellulosa har använts framgångsrikt och flera förbättringar har underlättat mikroskopiska observation7,8.
Metoden av trypanosome separation från blod, beskrivs nedan, är beroende av parasiten ytladdning, vilket är mindre negativa än blod däggdjursceller9. Intressant, denna metod utvecklades för 50 år sedan 1968 av Dr Sheila Lanham, och är fortfarande den gyllene standarden för upptäckt och beredning av blodomloppet innebörder. Det är snabbt och reproducerbara för salivarian innebörder från ett brett utbud av däggdjur, tillåter diagnos av både djur och människor trypanosomiasis10.
För att få levande, renat parasiter, läggs infekterat blod på en anjonbytaren kolumnen. Kromatografi förhållanden (främst pH, jonstyrka av buffertar/media) måste anpassas till varje trypanosome art och, mer allmänt, till varje blandning av blod däggdjursceller och innebörder10. Eluering buffert är exakt justerad till pH 8 för de flesta afrikanska innebörder10. Denna metod gynnar koncentrationen av parasiter i blodet hos patienter, eftersom parasitemias kan vara för låga för att upptäckas av mikroskopisk observation ensam, och det gör också laboratorieundersökningar. Arbeta med nymalen isolerade innebörder och på blod från infekterade djur, använder denna teknik, är mer relevant för olika utredningar än studier med parasiter som har varit odlade i axenic förhållanden i laboratoriet på obestämd tid.
Värd-parasit relationer studeras bäst med en parasiten infekterar sin naturliga värd, därför T. musculi, en naturlig murina parasit, som är representativt av extracellulära innebörder, har många fördelar som murina infektion innebär i en litet laboratorium djur och kräver inte biohazard säkerhet nivå (BSL) villkor. T. musculi dödar inte immunkompetenta möss, till skillnad från många andra arter, Trypanosoma , inklusive mänskliga patogener. T. musculi elimineras inte i T-cell-berövade möss och parasitemias kan ökas i infekterade möss genom att ändra mat och näring intag11. Denna parasit modulerar immunsvaret i samtidiga infektioner med andra patogener12. T. musculi från infekterade möss uppvisar skillnader från odlade T. musculi, till exempel uttrycket av membran Fc receptorer är förlorat i T. musculi axenic kulturer, jämfört med parasiter som renats från infekterade möss13 , 14. Excreted-utsöndras faktorer (ESF) är också kvalitativt och kvantitativt mindre uttryckt i axenic trypanosome kulturer och skiljer sig mellan stammar isolerade i endemiska områden15. ESF är de första antigenerna ska visas på värd immunsystemet och så spelar en viktig roll i den första värddatorn immunsvar16.
I experimentellt infekterade djur för laboratorieundersökningar underlättar detta protokoll experimenterande på ett större antal parasiter, minimering av antalet möss krävs särskilt när du använder immunsupprimerade djur. De variant yta glykoproteiner (VSGs) som används i det kortet agglutinationsprovet för Trypanosomiasis (CATT) massa screening fortfarande renas från innebörder som sprids i råttor. De två snabba diagnostiska tester (individuellt förpackade kassetter) som nu finns tillgängliga för användning i fältet fortfarande använder en infektiös modell källa av infödda VSGs och inte i vitro odlade innebörder1,4, 5. befordran i studien av trypanosome immunologi och biologi har underlättats eftersom parasiterna DEAE-cellulosa renat lätt kan erhållas i stora mängder från naturligt eller experimentellt infekterade värdar, och i synnerhet gnagare.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1036px;" width="1036">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">10 mL Pipettes&#160;</td>
			<td style="width:381px;">Falcon</td>
			<td style="width:184px;">357,551</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">2 mL Pipettes&#160;</td>
			<td style="width:381px;">Falcon</td>
			<td style="width:184px;">352,507</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Centrifugation tube 50 mL</td>
			<td style="width:381px;">Falcon</td>
			<td style="width:184px;">352,070</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:381px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">4K15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">DEAE cellulose</td>
			<td style="width:381px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:184px;">s/c- 211213</td>
			<td>100 G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">filter paper&#160;</td>
			<td style="width:381px;">Whatman</td>
			<td style="width:184px;">1,001,125</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Flat bottom flask narrow neck</td>
			<td style="width:381px;">Duran</td>
			<td style="width:184px;">21 711 76</td>
			<td style="width:172px;">6000 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Glucose&#160;</td>
			<td style="width:381px;">VWR</td>
			<td style="width:184px;">101174Y</td>
			<td>500 G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Heparin</td>
			<td style="width:381px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">H3149-50KU</td>
			<td>5 000 U</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:299px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:381px;">VWR</td>
			<td style="width:184px;">120 26936.260</td>
			<td>500 G</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:299px;">Microscope</td>
			<td style="width:381px;">Olympus</td>
			<td style="width:184px;">CH-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope coverslips</td>
			<td style="width:381px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:184px;">CB00100RA020MNT0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:381px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:184px;">AGAA000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:299px;">Na2HPO4&#160;</td>
			<td style="width:381px;">VWR</td>
			<td style="width:184px;">100 28026;260</td>
			<td>500 G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">NaCl</td>
			<td style="width:381px;">VWR</td>
			<td style="width:184px;">27800.291</td>
			<td>1 KG</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:299px;">NaH2PO4&#160;</td>
			<td style="width:381px;">VWR</td>
			<td style="width:184px;">110 33616;262</td>
			<td>500 G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Nalgene Plastic Media Bottles size 125 mL</td>
			<td style="width:381px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:184px;">342024-0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Nalgene Plastic Media Bottles size 500 mL</td>
			<td style="width:381px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:184px;">342024-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Pasteur Pipette</td>
			<td style="width:381px;">VWR</td>
			<td style="width:184px;">BRND125400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Penicillin 10,000 UI/Streptomycin 10,000 &#181;g</td>
			<td style="width:381px;">EUROBIO</td>
			<td style="width:184px;">CABPES01 OU</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Phenol red</td>
			<td style="width:381px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">P0290</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Syringue&#160;</td>
			<td style="width:381px;">Dutscher</td>
			<td style="width:184px;">SS+10S21381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Tissue culture hood</td>
			<td style="width:381px;">Thermoelectro Corporation</td>
			<td style="width:184px;">MSC-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Trypanosoma brucei brucei</td>
			<td style="width:381px;">Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium).</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td>ANTAT 1.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Trypanosoma brucei gambiense</td>
			<td style="width:381px;">Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium).</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td>ITMAP 1893</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Trypanosoma musculi</td>
			<td>London School of Hygiene and Tropical Medicine (UK)</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td>Partinico II</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification of extracellular trypanosomes, including african, from blood by anion-exchangers (diethylaminoethyl-cellulose columns)

Denna metod kan separation av innebörder, parasiter ansvarar för djurs och människors afrikansk trypanosomiasis (HAT), från infekterat blod. Detta är den bästa metoden för diagnostik av första etappen HAT och dessutom denna parasit reningsmetod tillåter serologiska och forskning utredningar.
HATT är orsakade av tsetseflugan överförs Trypanosoma brucei gambiense och T. b. rhodesiense. Relaterade innebörder är smittämnen djur trypanosomiasis. Trypanosome identifiering är avgörande för HAT diagnos, behandling och uppföljning. Den teknik som beskrivs här är de mest känsliga parasit upptäckt teknik, anpassade till fältförhållanden för diagnos av T. b. gambiense HAT och kan slutföras inom en timme. Blod är skiktad på en anjonbytaren kolumnen (DEAE-cellulosa) tidigare justerat till pH 8 och eluering buffert tillsätts. Mycket negativt laddade blodkroppar är adsorberas på kolumnen medan de mindre negativt laddade innebörder passera. Insamlade innebörder är pelleterat genom centrifugering och observeras av mikroskopi. Parasiter är dessutom beredda utan cellulära skador samtidigt sin smittsamhet.
Renat innebörder krävs för immunologiska tester; de används i trypanolysis-analysen, guldmyntfoten i hatt serologi. Färgade parasiter utnyttjas i det kort agglutinationsprovet (CATT) för fältet serologi. Antigener från renat innebörder, såsom variant yta glykoprotein, exoantigens, används också i olika immunanalyser. Proceduren som beskrivs här är avsedd för afrikanska innebörder; kromatografi villkor måste därför anpassas till varje trypanosome stam, och mer allmänt, till blod av varje art värd däggdjur.
Dessa fascinerande patogener är enkelt renat och tillgänglig för användning i biokemiska, molekylär och cell biologi studier inklusive samtidig kultur med värdceller att undersöka värd-parasit relationer på nivån av membranreceptorer, signalering och gene uttryck; Drug test in vitro; utredning av genen borttagning, mutation eller överuttryck på metaboliska processer, cytoskeletal biogenes och parasit överlevnad.

Renat innebörder har använts i farmaceutiska tester. Parasiter överförs till kultur brunnar innehållande seriespädningar av specifika läkemedel, antingen ensamt eller blandat19. Mikroskopiska iakttagelser, utvärdera motilitet är en markör för lönsamhet, kan utföras när bara några dugs testas, medan AlamarBlue cell livskraft-analysen är en utmärkt metod för stora motilitet analyser under drug screening20. Effekten av Pentami...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers Diethylaminoethyl-cellulose Columns at JoVE.com

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers Diethylaminoethyl-cellulose Columns

Denna metod av trypanosome separation från blod beror på deras ytladdning vara mindre negativa än blod däggdjursceller. Infekterat blod placeras och behandlas på en anjonbytaren kolumn. Metoden, den mest passande diagnostik för afrikansk trypanosomiasis, ger renad parasiter för immunologiska, biologiska, biokemiska, läkemedels- och molekylärbiologiska undersökningar.

Rening av extracellulära innebörder, inklusive afrikanska, från blod av anjon-värmeväxlare (Diethylaminoethyl-cellulosa kolumner)

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is ...

Afrikanska trypanosomer är ansvariga för mänskliga afrikanska trypanosomiasis, eller sömnsjuka och djur afrikansk trypanosomiasis. De trypanosomer som orsakar sömnsjuka är tsetse flyga överförs protist parasiter som finns i många geografiska foci i Afrika söder om Sahara. Detektion av parasiten är avgörande för diagnos, behandling och uppföljning.En serologi kan ge falskt positiva och tyvärr, falska negativa resultat. För att hjälpa upptäckt i blodet, trypanosomer måste koncentreras. Olika parasitkoncentrationstekniker har använts.Den mest känsliga metoden är separationen av parasiter från blod genom en kolonn av anjonbytare, DEAE-cellulosa följt av centrifugering och mikroskopisk observation. Följaktligen är DEAE cellulosa metoden den bästa och återstår hittills, referensmetoden för visualisera och isolera parasiter från blod för mänskliga afrikanska trypanosomiasis diagnos, särskilt i fält villkor. Denna metod, den mest passande diagnostiska för afrikansk trypanosomiasis ger också renat parasiter för immunologiska, biologiska, biokemiska, farmaceutiska och molekylärbiologiska undersökningar.Alla undersökningar som överensstämde med vägledningen för skötsel och användning av försöksdjur och överenskommelse har erhållits från de franska myndigheterna och alla protokoll som används har godkänts av vår lokala etikkommitté. Väg ut varje ämne enligt det skriftliga protokollet. Tillsätt destillerat vatten och justera exakt till pH 8 med kaliumdivätefosfat för att göra följande buffrade lösningar, koncentrerad fosfatbuffert 2X.Tillsätt destillerat vatten och glukos för fosfatbuffrad koksalt glukos. För 100 milliliter eluer buffert, tillsätt 100 enheter per milliliter penicillin, 100 mikrogram per milliliter streptomycin, och fem mikrogram milliliter fenol röd till fosfatbuffrad saltlösning glukos. 100 gram DEAE cellulosa tvättas först med tre liter destillerat vatten och sedan lämnas att bosätta sig.Fina partiklar kasseras. Tvättar upprepas tills supernatanten är klar. Koncentrerad fosfatbuffrad saltlösning 2X tillsätts och DEAE-cellulosan omrörs.PH-värdet justeras till åtta med en molär kaliumfosfat. Cellulosan tvättas sedan två gånger med destillerat vatten och två gånger med fosfatbuffrad koksalt glukos. DEAE-cellulosa och fosfatbuffrad koksalt glukos blandas i lika stora volymer.Legering inkvarterad och lagrad i rumstemperatur eller fyra grader celsius eller vid minus 20 grader celsius för långvarig lagring. Trypanosom infekterat blod lagras i flytande kväve. En legeringskvart på en milliliter tinas i rumstemperatur.Parasiter samlas noggrant in från kryotuben med hjälp av en nål och en milliliter spruta. Livskraften hos tinade parasiter bedöms av motiliteten som visualiseras av ljusmikroskopi observation före infektion. Parasiter injiceras i peritoneal håligheterna hos två möss, 500 mikroliter per mus.Varje dag efter infektion, parasitemia bedöms genom att samla en droppe blod från svansen med en nål och kontrolleras av mikroskopi. När parasitmien är på en lämplig nivå samlas infekterat blod. En 10 milliliter spruta stöds i en klämma eller hållare och en förskuren bit filterpapper tillsätts.Beredd DEAE-cellulosa hälls i sprutan upp till åtta- eller nio milliliternivån. Kolonnen tvättas med elueringsbufferten. Två milliliter infekterat blod placeras försiktigt ovanpå kolonnen och trypanosomer samlas i kolonnen eluater i ett 50 milliliter centrifugationsrör.Elueringsbuffert tillsätts regelbundet enligt transit av trypanosomer. Transiteringen av trypanosomer genom kolonnen kontrolleras genom att ta en droppe kolumn eluatera med jämna mellanrum och observera för trypanosomer med hjälp av ljusmikroskopi. När trypanosomer inte längre observeras i eluatet centrifugeras det koniska röret vid 1, 800 gånger G i 10 minuter vid fyra grader celsius.Supernatanten kasseras och trypanosomer i pallen räknas med en hemocytometer. Insamlade trypanosomer späds därefter ut i det medium som krävs för den planerade undersökningen. Denna metod, den mest passande diagnostiska för afrikanska trypanosomiasis ger renat parasiter för immunologiska, biologiska, biokemiska, farmaceutiska och molekylärbiologiska undersökningar.Dessa studier har utvecklats eftersom DEAE cellulosa renat parasiter lätt kan erhållas i stora mängder från naturligt eller experimentellt infekterade värdar och i synnerhet, gnagare. Trypanosom livskraft i närvaro av farmaceutiska medel bedöms genom mikroskopisk observation. Parasitens livskraft är associerad med motilitet och därför, kan kontrolleras med ögat under ett ljus mikroskop vid 40 gånger eller högre förstoring.Parasitens viabilitet bedöms genom att mäta andelen motila former. Utspädningar av testföreningar läggs till varje brunn av en 96 väl vävnad kultur tallrik medan kontroll brunnar är mock behandlas. Varje koncentration bedöms i tre exemplar.Antalet livskraftiga parasiter för varje utspädning jämförs med antalet parasiter i kontroll brunnar. Effekterna av Pentamidine, en referens läkemedel, som används i mänskliga afrikanska trypanosomiasis terapi visas i denna figur. Trypanosome makrofag co-kulturer tillåta undersökningen av värd parasit interaktion på cellnivå.I makrofag parasiten co-kulturer, extra cellulära trypanosomer inducera produktion av makrofag arginas som hydrolyserar arginin till ornitin. Ornitin är föregångaren till polyaminer och trypanothione, viktigt för parasitens överlevnad och tillväxt. Vidare minskar arginin utarmningen produktionen av trypanocidal kväveoxid.Därefter, tillägg av en arginase inhibitor, S-L-cystein till co-kulturer minskar dramatiskt makrofag inducerad parasit tillväxt. Arginase induktion medieras av trypanosome utsöndras och eller utsöndras faktorer. Denna arginas inducerande faktor har identifierats som en orthine kinesin.Kinesinrören till C-typlectin-mannosbindande receptorer. Arginas induceras och producerar ornitin som gynnar parasittillväxt. Arginase induceras inte av kinesin i makrofager odlade med 12,5 millimolar mannos eller i makrofager från möss där makrofagbenbesanceptorerna har raderats.Ytterligare exempel på cellbiologi och biokemiska experiment med hjälp av DAEA cellulosa renad trypanosomer påvisas i studier där nya cytoskeletal proteiner som BILBO1 har identifierats. BILBO1 krävs för biogenes av viktiga cytoskelettala strukturer och parasit överlevnad. Således representerar BILBO1 ett viktigt mål för intervention i patogena trypanosomer.En bild som visar immunoflourescence märkning av en blodomloppet kultur form, trypanosoma brucei cell sonderade med en anti-BILBO1 antikropp visas i denna figur. Dessutom har glukos och treonin metabolism beskrivits med hjälp av DEAE cellulosa renas trypanosomer och de enzymer som deltar i dessa processer har experimentellt validerats. En schematisk representation av glukos och treonin metabolism i blodomloppet-bildade trypanosomer visas i denna figur.Rening av afrikansk trypanosomer från blod genom anjon utbyten DEAE cellulosa kolumner med senaste förbättringar förblir guldmyntfoten för trypanosome upptäckt, inte bara i naturliga värdar med låga parasitemias i endemiska områden, men också för kravet på parasiter i stort antal för experimentella undersökningar. Undersökningar har gjort det möjligt att identifiera trypanosome molekyler spelar viktiga roller i parasit överlevnad och tillväxt. Identifierade mål kan utgöra grunden för ett framtida vaccin med potentiella antigener för både människor och djur i en hälsostrategi.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers (Diethylaminoethyl-cellulose Columns)

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

Utarmning av specifika cellpopulationer med Komplettera Utarmning

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

Isolering av Mouse bukhålan celler

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Rening av specifik cell Befolkningen efter Fluorescens Aktivt cellsortering (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Expansion, rening och Functional Assesment of Human Peripheral Blood NK-celler

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Rening och visualisering av lipopolysackarid från Gram-negativa bakterier genom varm vattenhaltig fenol Extraktion

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Rening av patogener vakuoler från<em&gt; Legionella</em&gt;-Infekterade Fagocyter

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Antigener skyddade funktionella röda blodkroppar av membranet Ympning av kompakt Hyperförgrenade Polyglyceroler

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Bioluminescence Imaging för att upptäcka sent stadium Infektion av afrikansk sömnsjuka

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dextran effektiviserar Lentiviral transduktion murina och mänskliga primära NK-celler

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...