Name: monitoring hippo signaling pathway activity using a luciferase-based large tumor suppressor (lats) biosensor
Uploaded: 2018-09-13T15:00:00
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这项工作得到了加拿大卫生研究所 ( CIHR # 119325 , 148629 ) 和加拿腺癌基金会 ( CBCF ) 提供给 XY 的赠款的支持。TA 得到加拿大 Vanier 研究生奖学金和安大略省国际研究生奖学金的支持。HJJVR 获得伊丽莎白二世科技研究生奖学金的支持。

1. 对一个假定的河马信号调节器的调查用拉图-BS
<ol><li>
细胞的电镀和转染
	<ol>
<li>细胞培养的制备<ol>
<li>暖 1x PBS, DMEM 含有10% 的血清和1% 青霉素/链霉素, 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 到37°c 在一个水浴约30分钟。</li>
			<li>彻底清洁一个安全柜与70% 乙醇。</li>
			<li>将组织培养皿, 巴斯德吸管, 血清吸管, 和吸管提示进入组织培养罩, 根据需要。</li>
			<li>从水浴中取出 1x PBS、培养基和胰蛋白酶-EDTA,...

<ol>
	<li>Justice, R. W., Zilian, O., Woods, D. F., Noll, M., Bryant, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+tumor+suppressor+gene+warts+encodes+a+homolog+of+human+myotonic+dystrophy+kinase+and+is+required+for+the+control+of+cell+shape+and+proliferation.">The Drosophila tumor suppressor gene warts encodes a homolog of human myotonic dystrophy kinase and is required for the control of cell shape and proliferation.</a> Genes &amp; Development. 9 (5), 534-546 (1995).</li><li>Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+tumor+suppressors+in+genetic+mosaics:+the+Drosophila+lats+gene+encodes+a+putative+protein+kinase.">Identifying tumor suppressors in genetic mosaics: the Drosophila lats gene encodes a putative protein kinase.</a> Development. 121 (4), 1053-1063 (1995).</li><li>Taha, Z., Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+Pathway:+Immunity+and+Cancer.">The Hippo Pathway: Immunity and Cancer.</a> Cancers. 10 (4), 94 (2018).</li><li>Maugeri-Sacc&#224;, M., De Maria, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+pathway+in+normal+development+and+cancer.">The Hippo pathway in normal development and cancer.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 186, 60-72 (2018).</li><li>van Rensburg, H. J. J., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+the+Hippo+pathway+in+cancer+metastasis.">The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis.</a> Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).</li><li>Yeung, B., Yu, J., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+the+Hippo+pathway+in+lung+development+and+tumorigenesis.">Roles of the Hippo pathway in lung development and tumorigenesis.</a> International Journal of Cancer. 138 (3), 533-539 (2016).</li><li>Zhao, Y., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+pathway+in+chemotherapeutic+drug+resistance.">The Hippo pathway in chemotherapeutic drug resistance.</a> International Journal of Cancer. 137 (12), 2767-2773 (2015).</li><li>Yu, F. -. X., Guan, K. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+pathway:+regulators+and+regulations.">The Hippo pathway: regulators and regulations.</a> Genes &amp; Development. 27 (4), 355-371 (2013).</li><li>Yang, X., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+size+control+in+development+and+human+diseases.">Molecular mechanism of size control in development and human diseases.</a> Cell Research. 21 (5), 715 (2011).</li><li>Visser, S., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LATS+tumor+suppressor:+a+new+governor+of+cellular+homeostasis.">LATS tumor suppressor: a new governor of cellular homeostasis.</a> Cell Cycle. 9 (19), 3892-3903 (2010).</li><li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+YAP+oncoprotein+by+the+Hippo+pathway+is+involved+in+cell+contact+inhibition+and+tissue+growth+control.">Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control.</a> Genes &amp; Development. 21 (21), 2747-2761 (2007).</li><li>Hao, Y., Chun, A., Cheung, K., Rashidi, B., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+suppressor+LATS1+is+a+negative+regulator+of+oncogene+YAP.">Tumor suppressor LATS1 is a negative regulator of oncogene YAP.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (9), 5496-5509 (2008).</li><li>Ozawa, T., Kaihara, A., Sato, M., Tachihara, K., Umezawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split+Luciferase+as+an+Optical+Probe+for+Detecting+Protein.">Split Luciferase as an Optical Probe for Detecting Protein.</a> Protein Interactions in Mammalian Cells Based on Protein Splicing. Analytical Chemistry. 73 (11), 2516-2521 (2001).</li><li>Hashimoto, T., Adams, K. W., Fan, Z., McLean, P. J., Hyman, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+oligomer+formation+of+amyloid-&#946;+peptide+using+a+split-luciferase+complementation+assay.">Characterization of oligomer formation of amyloid-&#946; peptide using a split-luciferase complementation assay.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (31), 27081-27091 (2011).</li><li>Decock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+by+a+highly+sensitive+split+luciferase+assay+of+the+regions+involved+in+APP+dimerization+and+its+impact+on+processing.">Analysis by a highly sensitive split luciferase assay of the regions involved in APP dimerization and its impact on processing.</a> FEBS Open Bio. 5 (1), 763-773 (2015).</li><li>Azad, T., Tashakor, A., Rahmati, F., Hemmati, R., Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillation+of+apoptosome+formation+through+assembly+of+truncated+Apaf-1.">Oscillation of apoptosome formation through assembly of truncated Apaf-1.</a> European Journal of Pharmacology. 760, 64-71 (2015).</li><li>Br&#252;ckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+two-hybrid,+a+powerful+tool+for+systems+biology.">Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology.</a> International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).</li><li>Pattnaik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+plasmon+resonance.">Surface plasmon resonance.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 126 (2), 79-92 (2005).</li><li>Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+resonance+energy+transfer.">Fluorescence resonance energy transfer.</a> Current Opinion in Biotechnology. 6 (1), 103-110 (1995).</li><li>Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-luciferase+complementary+assay:+applications,+recent+developments,+and+future+perspectives.">Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).</li><li>Hu, C. -. D., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+protein+interactions+in+living+cells+using+multicolor+fluorescence+complementation+analysis.">Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis.</a> Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).</li><li>Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+enigma+of+multicolor+bioluminescence+of+firefly+luciferase.">Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (7), 1167-1182 (2011).</li><li>Paulmurugan, R., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+library+screening+for+developing+an+improved+split-firefly+luciferase+fragment-assisted+complementation+system+for+studying+protein-protein+interactions.">Combinatorial library screening for developing an improved split-firefly luciferase fragment-assisted complementation system for studying protein-protein interactions.</a> Analytical Chemistry. 79 (6), 2346-2353 (2007).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+LATS+biosensor+screen+identifies+VEGFR+as+a+regulator+of+the+Hippo+pathway+in+angiogenesis.">A LATS biosensor screen identifies VEGFR as a regulator of the Hippo pathway in angiogenesis.</a> Nature Communications. 9 (1), 1061 (2018).</li><li>Moroishi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+YAP/TAZ-induced+feedback+mechanism+regulates+Hippo+pathway+homeostasis.">A YAP/TAZ-induced feedback mechanism regulates Hippo pathway homeostasis.</a> Genes &amp; Development. 29 (12), 1271-1284 (2015).</li></ol>

虽然河马通路在各种生物过程中起着关键作用, 失调的河马通路导致癌症6, 但如何根据各种刺激来调节河马通路是不完全理解的。此外, 还没有定量和实时系统来评估河马核心成分的活动。最近, 我们研制并验证了一种新的生物传感器, 用于测量河马通路24中的拉图激酶活性。这种生物传感器不仅可以定量和准确地监测活细胞中的河马信号活动, 而且还可用于针对?...

河马信号通路首先被确定在果蝇作为一个新的调节细胞生长和动物大小1,2。自初步发现以来, 越来越多的证据令人信服地表明, 河马通路在发展中起着关键作用 (如早期胚胎发育、器官大小控制和三维 [3 D] 形态学), 肿瘤发生 (例如, 肿瘤的发育、转移、血管生成、免疫逃逸、基因组不稳定、应激反应和耐药性, 以及组织稳态 (例如, 损伤后的干细胞更新和分化及组织再生)3,4,5,6,7,8,9,10. 河马信号频繁地失调在各种各样的癌症 7,8,9,10,11,12。因此, 阐明河马通路在肿瘤生物学、治疗和再生医学中的作用已成为生物医学研究中最热的领域之一。
简而言之, 在河马通路中, 在上游调控器 (例如, 细胞接触, 营养压力和细胞外基质 [ECM]) 激活后, MST1/2 (MST;果蝇河马的哺乳动物同系物) 丝氨酸/苏氨酸 (s-/T) 激酶phosphorylate/激活适配器蛋白 hMOB1 和 WW45, 以及 LATS1/2 (拉图) 激酶, 随后, phosphorylate 转录的联合激活剂狂吠和它的 paralog 在保存的黄叶 (h/R/K) XX (S/T) (h, 组氨酸;R、精氨酸;K, 赖氨酸;S, 丝氨酸;T, 苏氨酸;X, 任何氨基酸) 的图案, 包括 YAP-S127 和 TAZ-S8911,12。S127-phosphorylated 狂吠 (YAP-pS127) 和 S89-phosphorylated (TAZ-pS89) 被泛或绑定到细胞质蛋白 14-3-3, 并防止与 TEAD1-4 转录因子在细胞核中的 transactivate 下游的互动细胞增殖和凋亡相关的基因 (图 1)。尽管对河马的路径有极大的兴趣, 但很少有测量河马信号的工具, 那些在历史上仅限于狂吠/TEAD 转录输出的记者。事实上, 直到最近, 没有任何工具, 以定量, 实时, 高通量, 和非侵入性的方式测量河马信号成分在体外和体内的动态和活动。
鉴于我们对蛋白质-蛋白质相互作用在生理学和病理学中的作用的认识日益加深, 人们非常感兴趣的是开发可用于定量和实时方式研究这些相互作用的工具13, 14,15,16。事实上, 生物分析战略的发展取得了重大进展, 其中包括酵母双杂交 (Y2H)17、表面等离子体共振 (SPR)18和 Förster 共振能量转移 (烦恼)19化验,来评估蛋白质与蛋白质的相互作用。然而, 这些方法的局限性是要求对记者的定位进行重要的优化, 这样就必须对许多构造进行测试以找到一个有效的。此外, 这些方法也有一个相对较低的信噪比, 这样辨别一个真正的正面信号可能是挑战。
为了克服这些局限性, 研制了蛋白质互补测定。第一代蛋白质互补检测是基于分裂多色荧光蛋白, 不能解决上述限制20。多色荧光蛋白仅由一个域组成, 使得很难将它们分成两个独立的稳定片段, 它们的亲和力和背景噪声为21。随后, 萤火虫荧光素酶被确定为一种新的候选体, 用于发展分裂蛋白互补测定。在这种方法中, 萤火虫荧光素酶被分成两个片段 (N 终端和 C 末端荧光素酶 [NLuc 和 CLuc]), 每个片段融合到目标蛋白的兴趣。如果 NLuc 和 CLuc 在两个靶蛋白的相互作用附近被带入接近度, 荧光素酶活性被重组, 并且在荧光素基底和 ATP22的存在下产生发光光。在 2001年, 通过使用一个包含 NLuc 和 CLuc 片段的库进行组合筛选, 在不同的地点切割并附着在斯坦福大学不同连接器、Paulmurugan 和 Gambhir 的蛋白质上, 开发出了一种优化的分裂萤火虫荧光素酶片段辅助互补系统用于蛋白质-蛋白质相互作用23。在这个系统中, 萤火虫荧光素酶被切割在氨基酸 (aa) 398 形成 NLuc 和 CLuc, 这是附加到两个感兴趣的蛋白质, 使用一个灵活的链接八甘氨酸残留和两个丝氨酸残留。
采用类似的方法, 我们最近开发了一种新的拉图-BS, 通过融合 NLuc 到 15 aa 在 S127 (YAP15) 的拉图磷酸化部位和 CLuc 与 14-3-3。没有使用全长的狂吠蛋白, 以避免其他上游监管机构对狂吠 (如其他部位的磷酸化和泛) 进行后转化后的混杂信号。在这里提出的拉图 BS 可以无创监测河马信号活动的活体细胞和体内的小鼠20,24 (图 2)。在这里, 我们描述了一个详细的协议, 以测量的拉图激酶活性的体外使用的拉图 BS。首先, 我们展示了如何使用拉图 BS 来研究抗原蛋白对拉图活性的影响。然后, 我们展示了如何使用生物传感器来监测河马通路的治疗后, 与调控河马路径的活动。该协议可用于识别和表征信号通路或刺激调节拉图激酶活性。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="692">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:91px;">2520056</td>
			<td style="width:213px;">0.25%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:91px;">F1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DMEM</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:91px;">D6429-500ml</td>
			<td>DMEM with high glucose&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td style="width:121px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:91px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Signagen</td>
			<td style="width:91px;">SL100688.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">5x Passive lysis buffer</td>
			<td style="width:121px;">Promega</td>
			<td style="width:91px;">E194A</td>
			<td>30 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Dual-Glo&#174; Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:121px;">Promega</td>
			<td style="width:91px;">E2940</td>
			<td>100 ml kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">20/20 luminometer</td>
			<td style="width:121px;">Turner Biosystems</td>
			<td style="width:91px;">998-2036</td>
			<td>Single tube reader luminometer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">GloMax&#174;Navigator with dual injectors</td>
			<td style="width:121px;">Promega</td>
			<td style="width:91px;">GM2010</td>
			<td>96-well plates reader luminometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring hippo signaling pathway activity using a luciferase-based large tumor suppressor (lats) biosensor

河马信号通路是器官大小的守恒调节器, 在发育和肿瘤生物学中具有重要作用。由于技术上的挑战, 很难评估这一信号通路的活动, 并在生物环境中加以解释。现有的关于大肿瘤抑制物 (拉图) 的文献依赖于定性和不易放大的方法进行筛查。最近, 我们已经开发了一种生物发光传感器来监测拉图的激酶活性--河马激酶级联的核心成分。在这里, 我们描述了如何使用这种拉图生物传感器 (拉图 BS) 来描述河马通路调节器的过程。首先, 我们提供了一个详细的协议, 以调查抗原蛋白候选者 (例如, VEGFR2) 对拉图活动的影响, 使用拉图 BS。然后, 我们展示了如何使用的拉图 BS 可用于小规模激酶抑制剂屏幕。这项协议可以进行放大, 以执行更大的屏幕, 这无疑将确定新的管理者的河马路径。

cotransfected 用不同的基因对其对拉图活性的影响进行了评价 (图 3)。在本实验中, Renilla被用作内部控制。YAP-5SA 的瞬态表达是狂吠的本构活动形式, 它导致狂吠转录靶点的增加, 并通过建立的反馈通路25增加了拉图激酶活性。MST, 在河马路径中的拉图上游活化剂 (图 1), 也增加了生物传感器的信号强度。然而,...

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Monitoring Hippo Signaling Pathway Activity Using a Luciferase-based Large Tumor Suppressor LATS Biosensor

在这里, 我们提出一个基于荧光素酶的生物传感器, 以量化的激酶活性的大抑癌 (拉图)-一个中心激酶在河马信号通路。该生物传感器在基础和平移研究中有不同的应用, 目的是在体外和体内对河马通路调节器进行调查。

基于荧光素酶的大抑癌 (拉图) 生物传感器监测河马信号通路活动

The Hippo signaling pathway is a conserved regulator of organ size and has important roles in the development and cancer biology. Due to technical ...

我的实验室一直在研究河马通路在乳腺癌和肺癌中的作用，最近，我们开发了一种新的生物传感器来监测河马信号活动。此方法可用于回答有关蜂窝信令网络的关键问题，例如 Hippo 通路如何响应因子，以及它如何与其他信令通路交互。与现有方法相比，该技术的主要优点在于其灵敏度高，而且样品数量也大量可快速、同时处理。该技术在基础和转化研究中具有多种应用，用于研究河马信号通路在体外和体内的调节器。首先，迷你准备LATS-BS质粒新鲜从DH5-阿尔法细菌液体培养。转染前一小时，从板中吸出介质，并在每井中加入500微升生长介质。一个重要的一点是，LATS生物传感器必须准备新鲜，以获得最大的表达和活动。此外，建议在进行荧光素酶测定时始终使用河马通路道的上游调节器（如 MSD）作为正对控制。在此之后，将细胞返回到培养箱。接下来，准备溶液 A、DNA 溶液和溶液 B，如文本协议中描述的稀释聚合物转染试剂。在此之后，立即将溶液 B 添加到解决方案 A 中，并轻轻地上下移液器进行混合。在室温下孵育样品15分钟，使转染复合物形成。然后，用柔和的旋转将转染复合物的总体积滴到板的每个井中。在37摄氏度下孵育细胞过夜。第二天，移除含有转染复合的介质，代之以全新介质。然后在37摄氏度下培养细胞一天。用蒸馏水稀释适当量的5倍无源解液缓冲液。然后，从板中完全吸气介质。在每个井中加入一毫升 PBS，轻轻旋转板以去除分离的细胞和残留的生长介质。然后完全吸气 PBS。接下来，向每井添加 250 微升 1xPLB。将培养板放在摇杆上 15 分钟，以确保使用 PLB 均匀覆盖电池单层。在此之后，将利沙酸盐转移到1.5毫升微离心管中。从 80 摄氏度的存储中去除 LAR-2，并将其与室温平衡。然后，为适当数量的检测准备雷尼拉检测试剂。将Renilla检测试剂加入50x基板及其缓冲液。接下来，将每个细胞的10微升水切成1.5毫升管。然后，对一个发光计进行编程，以执行两秒钟的预测量延迟，然后是 10 秒的测量周期。小心地将 20 微升 LAR-2 试剂转移到一个管中，然后快速上下移液器混合。然后，立即将管放在发光计中并启动读数。读取后，从发光仪上取出样品管，加入 20 微升的 Renilla 试剂，上下移液器混合。然后，将样品放在亮度计中，然后开始下一个读数。首先，培养、分离、计数和板 HEK293 广告单元，如文本协议中所述。然后，在转染前一小时，从板中吸出介质，然后用五毫升的新鲜完整生长介质代替。最后，将稀释溶液B添加到溶液 A 中，并上下移液器混合。然后，在室温下孵育样品15分钟，然后将转染复合物的总体积添加到板中，同时轻轻旋转。在37摄氏度下孵育细胞过夜。第二天，对细胞进行三分位化并计数。板1万至2万个细胞进入每一个96井板的井，每井的介质总体积为100微升。在此之后，孵育细胞一天。在进行荧光素酶测定前一到四个小时，添加可能调节河马通路剂的剂剂，最终浓度为每井10微摩尔。接下来，从细胞中完全吸出介质，用 100 微升 PBS 清洗每个井中的细胞。然后，在每井中加入20微升的PLB。将文化板放在摇杆上 15 分钟。然后，将 20 微升 LAR-2 试剂转移到板的每个井中，并上下移液器进行混合。在此之后，立即将板放入板读数发光计中并启动读数。在该协议的第一部分，LATS-BS与不同的基因共同移植，以评估它们对LATS激酶活性的影响。在第二个协议中，LATS-BS被转染到 HEK293-Ad 中，细胞被传递到 96 孔板中。转染40小时后，用河马信号的不同已知小分子调节器对细胞进行治疗，然后进行荧光素酶测定。在解释这些测定的结果时，应该注意，蛋白质和药物治疗可能会激活影响生物传感器活性的反馈途径。需要进一步的实验，以确认候选人和河马信号通路之间的关系。按照此过程，其他方法（如定量实时 PCR 或西 Blot）可用于回答有关 LATS 激酶活性的其他问题。该技术开发后，为癌症生物学领域的研究人员在许多生物和生化过程中探索LATS激酶和河马信号通路的动态和活性铺平了道路。不要忘记，用于筛查的药物可能极其危险，在执行此程序时应始终采取适当的预防措施。

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Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

Live Cell Imaging of the TGF-	&beta;/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

Live Cell Imaging of the TGF-	ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

腺病毒报告系统 TGF β/Smad3 信号通路的活体细胞成像

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

数字聚合酶链反应法测定零星家族性腺瘤性息肉病患者的基因变异

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

基于 crispr-cas9 的竞争检测对遗传依赖性的调查

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

三维肿瘤球体的纵向形态和生理监测

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish

利用血脑肿瘤屏障在盘中进行活体有效载荷传递预测

Highly selective by nature, the blood-brain barrier (BBB) is essential for the brain homeostasis in physiological conditions. However, in the context of ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

患者生物流体中肿瘤相关循环DNA的检测与监测

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

使用一套实用可行的方法,描述英国皇家空军家族激酶与疾病相关的突变体

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

使用阵列库的中等通量筛选和基于双 Luciferase 的分录报告器识别转录因子稳压器

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...