Name: monitoring hippo signaling pathway activity using a luciferase-based large tumor suppressor (lats) biosensor
Uploaded: 2018-09-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Hippo Signaling Pathway Activity Using a Luciferase-based Large Tumor Suppressor LATS Biosensor at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ קנדי המכון לבריאות למחקר (CIHR #119325, 148629), את קנדי השד סרטן הקרן (CBCF) כדי XY. TA נתמך על ידי את המלגה לתואר שני של קנדה וניהר הבינלאומי אונטריו המלגה לתואר שני. HJJVR נתמך על ידי המלכה אליזבת השנייה במלגה ללימודי תואר שני במדע וטכנולוגיה.

1. חקירת מווסת בשם של היפו איתות באמצעות השרירים-BS
<ol><li>
ציפוי, תרביות תאים תאים
	<ol>
<li>הכנת תרבית תאים<ol>
<li>חמים 1 x PBS, DMEM המכיל 10% FBS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 0.25% טריפסין-EDTA עד 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים במשך כ 30 דקות.</li>
			<li>ניקוי יסודי ארון אבטחה עם 70% אתנול.</li>
			<li>הצב תרביות רקמה מנ?...

<ol>
	<li>Justice, R. W., Zilian, O., Woods, D. F., Noll, M., Bryant, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+tumor+suppressor+gene+warts+encodes+a+homolog+of+human+myotonic+dystrophy+kinase+and+is+required+for+the+control+of+cell+shape+and+proliferation.">The Drosophila tumor suppressor gene warts encodes a homolog of human myotonic dystrophy kinase and is required for the control of cell shape and proliferation.</a> Genes &amp; Development. 9 (5), 534-546 (1995).</li><li>Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+tumor+suppressors+in+genetic+mosaics:+the+Drosophila+lats+gene+encodes+a+putative+protein+kinase.">Identifying tumor suppressors in genetic mosaics: the Drosophila lats gene encodes a putative protein kinase.</a> Development. 121 (4), 1053-1063 (1995).</li><li>Taha, Z., Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+Pathway:+Immunity+and+Cancer.">The Hippo Pathway: Immunity and Cancer.</a> Cancers. 10 (4), 94 (2018).</li><li>Maugeri-Sacc&#224;, M., De Maria, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+pathway+in+normal+development+and+cancer.">The Hippo pathway in normal development and cancer.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 186, 60-72 (2018).</li><li>van Rensburg, H. J. J., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+the+Hippo+pathway+in+cancer+metastasis.">The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis.</a> Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).</li><li>Yeung, B., Yu, J., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+the+Hippo+pathway+in+lung+development+and+tumorigenesis.">Roles of the Hippo pathway in lung development and tumorigenesis.</a> International Journal of Cancer. 138 (3), 533-539 (2016).</li><li>Zhao, Y., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+pathway+in+chemotherapeutic+drug+resistance.">The Hippo pathway in chemotherapeutic drug resistance.</a> International Journal of Cancer. 137 (12), 2767-2773 (2015).</li><li>Yu, F. -. X., Guan, K. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+pathway:+regulators+and+regulations.">The Hippo pathway: regulators and regulations.</a> Genes &amp; Development. 27 (4), 355-371 (2013).</li><li>Yang, X., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+size+control+in+development+and+human+diseases.">Molecular mechanism of size control in development and human diseases.</a> Cell Research. 21 (5), 715 (2011).</li><li>Visser, S., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LATS+tumor+suppressor:+a+new+governor+of+cellular+homeostasis.">LATS tumor suppressor: a new governor of cellular homeostasis.</a> Cell Cycle. 9 (19), 3892-3903 (2010).</li><li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+YAP+oncoprotein+by+the+Hippo+pathway+is+involved+in+cell+contact+inhibition+and+tissue+growth+control.">Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control.</a> Genes &amp; Development. 21 (21), 2747-2761 (2007).</li><li>Hao, Y., Chun, A., Cheung, K., Rashidi, B., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+suppressor+LATS1+is+a+negative+regulator+of+oncogene+YAP.">Tumor suppressor LATS1 is a negative regulator of oncogene YAP.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (9), 5496-5509 (2008).</li><li>Ozawa, T., Kaihara, A., Sato, M., Tachihara, K., Umezawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split+Luciferase+as+an+Optical+Probe+for+Detecting+Protein.">Split Luciferase as an Optical Probe for Detecting Protein.</a> Protein Interactions in Mammalian Cells Based on Protein Splicing. Analytical Chemistry. 73 (11), 2516-2521 (2001).</li><li>Hashimoto, T., Adams, K. W., Fan, Z., McLean, P. J., Hyman, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+oligomer+formation+of+amyloid-&#946;+peptide+using+a+split-luciferase+complementation+assay.">Characterization of oligomer formation of amyloid-&#946; peptide using a split-luciferase complementation assay.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (31), 27081-27091 (2011).</li><li>Decock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+by+a+highly+sensitive+split+luciferase+assay+of+the+regions+involved+in+APP+dimerization+and+its+impact+on+processing.">Analysis by a highly sensitive split luciferase assay of the regions involved in APP dimerization and its impact on processing.</a> FEBS Open Bio. 5 (1), 763-773 (2015).</li><li>Azad, T., Tashakor, A., Rahmati, F., Hemmati, R., Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillation+of+apoptosome+formation+through+assembly+of+truncated+Apaf-1.">Oscillation of apoptosome formation through assembly of truncated Apaf-1.</a> European Journal of Pharmacology. 760, 64-71 (2015).</li><li>Br&#252;ckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+two-hybrid,+a+powerful+tool+for+systems+biology.">Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology.</a> International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).</li><li>Pattnaik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+plasmon+resonance.">Surface plasmon resonance.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 126 (2), 79-92 (2005).</li><li>Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+resonance+energy+transfer.">Fluorescence resonance energy transfer.</a> Current Opinion in Biotechnology. 6 (1), 103-110 (1995).</li><li>Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-luciferase+complementary+assay:+applications,+recent+developments,+and+future+perspectives.">Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).</li><li>Hu, C. -. D., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+protein+interactions+in+living+cells+using+multicolor+fluorescence+complementation+analysis.">Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis.</a> Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).</li><li>Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+enigma+of+multicolor+bioluminescence+of+firefly+luciferase.">Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (7), 1167-1182 (2011).</li><li>Paulmurugan, R., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+library+screening+for+developing+an+improved+split-firefly+luciferase+fragment-assisted+complementation+system+for+studying+protein-protein+interactions.">Combinatorial library screening for developing an improved split-firefly luciferase fragment-assisted complementation system for studying protein-protein interactions.</a> Analytical Chemistry. 79 (6), 2346-2353 (2007).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+LATS+biosensor+screen+identifies+VEGFR+as+a+regulator+of+the+Hippo+pathway+in+angiogenesis.">A LATS biosensor screen identifies VEGFR as a regulator of the Hippo pathway in angiogenesis.</a> Nature Communications. 9 (1), 1061 (2018).</li><li>Moroishi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+YAP/TAZ-induced+feedback+mechanism+regulates+Hippo+pathway+homeostasis.">A YAP/TAZ-induced feedback mechanism regulates Hippo pathway homeostasis.</a> Genes &amp; Development. 29 (12), 1271-1284 (2015).</li></ol>

ואילו השביל היפו משחק תפקידים חיוניים תהליכים ביולוגיים שונים, ומוביל dysregulation של הנתיב היפו סרטן6, איך מסלול היפו מוסדר בתגובה לגירויים שונים אינה מובנת לחלוטין. בנוסף, חלה לא כמותית ומערכת בזמן אמת כדי להעריך את הפעילות של רכיבי הליבה היפו. לאחרונה, אנחנו פיתח ואומת על ביוסנס?...

ההיפופוטם איתות לשביל זוהה לראשונה בדרוזופילה כרגולטור הרומן של צמיחת תאים ושל בעלי חיים בגודל1,2. מאז גילויו הראשונית, הרכבה ראיות בצורה משכנעת הראו כי מסלול היפו משחק תפקידים חיוניים לפיתוח (למשל, התפתחות עוברית מוקדמת, בקרת גודל האיבר, תלת-ממדית [תלת-ממד] מורפולוגיה), tumorigenesis ( למשל, התפתחות גידולים, גרורות, אנגיוגנזה, התחמקות המערכת החיסונית, אי יציבות גנומית, תגובת המתח, עמידות לתרופות), והומאוסטזיס רקמות (למשל, חידוש תאי גזע, בידול, התחדשות רקמות לאחר פציעה) 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. היפו איתות לעתים קרובות הוא dysregulated שונים סרטן7,8,9,10,11,12. לכן, שחקרתי פונקציות של מסלול היפו סרטן ביולוגיה ו הרפוי ורפואה רגנרטיבית הפך אחד האזורים החמים ביותר בתחום המחקר הביו-רפואי.
באופן קצר, בשביל היפו, בעת הפעלת ועדות נגד הזרם (למשל, תא-תא מגע, מזין דחק (סטרס) מטריצה חוץ-תאית [ECM]), MST1/2 (MST; homologs בתרבית של היפו דרוזופילה ) סרין/תראונין (S/T) kinases phosphorylate/להפעיל מתאם חלבונים hMOB1 ואת WW45, כמו גם kinases LATS1/2 (באמת), אשר, לאחר מכן, phosphorylate activator תעתיק שיתוף הפה, paralog שלה, טאז-HX(H/R/K)XX(S/T) שנשמרת (H, היסטידין; R, ארגינין; K, ליזין; S, סרין; T, תראונין; X, כל חומצות אמינו) מוטיבים, כולל11,הפה-S127 ו TAZ-S8912. S127 phosphorylated הפה (הפה-pS127), טאז S89-phosphorylated (טאז-pS89) הם נפגמים בשל ubiquitination או לאגד חלבון cytoplasmic 14-3-3, תימנע אינטראקציה עם גורמי שעתוק TEAD1-4 בגרעין כדי transactivate במורד הנהר גנים המעורבים התפשטות תאים, אפופטוזיס (איור 1). למרות האינטרס מסלול היפו עצומה, קיימים כמה כלים למדידת היפו איתות ואלו היו מוגבלים מבחינה היסטורית כתבים של פלט תעתיק הפה/טאז/TEAD. אכן, עד ממש לאחרונה, היו אין כלים למדידת את הדינמיקה ואת הפעילות של ההיפופוטם איתות רכיבים באופן כמותי, בזמן אמת, תפוקה גבוהה, לא פולשנית גם במבחנה וגם בתוך vivo.
בהתחשב שלנו מתעוררים הבנה של התפקיד של אינטראקציות חלבון פיזיולוגיה, פתולוגיה, יש עניין רב בפיתוח של כלים שבהם ניתן להשתמש כדי ללמוד אינטראקציות אלה באופן כמותי, בזמן אמת13, 14,15,16. אכן, חלה התקדמות משמעותית בפיתוח של אסטרטגיות ביו-אנליטית, כולל שמרים 2-היברידית (Y2H)17, משטח פלזמון תהודה (SPR)18ו פורסטר תהודה אנרגיה העברה (סריג)19 מבחני, להערכת אינטראקציות חלבון חלבון. עם זאת, גישות אלה נושאים המגבלה של דרישת אופטימיזציה משמעותית כיוון הכתב, כך מבנים רבים חייבים להיבדק כדי למצוא יעיל. עוד, גישות אלה יש גם יחס אות לרעש נמוכה יחסית, כך אניני טעם איתות חיובי אמיתי עשויה להיות מאתגרת.
חלבון קומפלמנטציה מבחני פותחו כדי להתגבר על מגבלות אלה. הדור הראשון של חלבון קומפלמנטציה מבחני התבססה על פיצול פלורסצנטיות ססגוניות חלבונים, לא יכלו לפתור את המגבלות הנ ל20. קרינה פלואורסצנטית ססגוניות חלבונים מורכבים של תחום אחד בלבד, ולכן קשה לפצל אותם שני קטעים יציב נפרד עם זיקה נמוכה, רעש רקע21. לאחר מכן, גחלילית לוציפראז מזוהה בתור מועמד חדש לשימוש בפיתוח מבחני קומפלמנטציה חלבון פיצול. בגישה זו, גחלילית לוציפראז מחולק שני קטעים (N-מסוף ו- C-מסוף לוציפראז [NLuc, CLuc]) עם כל שבר דבוקה חלבון המטרה של עניין. אם NLuc ואת CLuc מועברים אל תוך הקרבה על האינטראקציה של החלבונים שני היעד, פעילות לוציפראז הוא מחדש, אור זוהרים נוצר בנוכחות סובסטרט luciferin ו- ATP22. בשנת 2001, על ידי ביצוע הקרנה קומבינטורית באמצעות ספריה המכילה שברי NLuc ו- CLuc באתרים שונים גזורה מחוברים חלבונים עם linkers שונים, Paulmurugan ו- Gambhir באוניברסיטת סטנפורד פיתחה של אופטימיזציה של פיצול-גחלילית לוציפראז קומפלמנטציה פרגמנט בסיוע מערכת עבור אינטראקציות חלבון-חלבון23. במערכת זו, נחתך גחלילית לוציפראז-חומצת אמינו (aa) 398 כדי ליצור NLuc ו CLuc, אשר מחוברים שני חלבונים עניין באמצעות מקשר (linker) גמיש של שמונה שאריות גליצין, שני סרין ומשקעים.
שימוש בגישה דומה, לאחרונה פיתחנו נצמדתי חדשה-תואר BS מאת פיוזינג NLuc ל-15 aa של הפה סביב אתר זרחון נצמדתי-S127 (YAP15), CLuc עם 14-3-3. החלבון הפה באורך מלא היה לא רגיל, כדי למנוע בלבול אותות על ידי שינויים post-translational של הפה (למשל, זרחון על אתרים אחרים, ubiquitination) על ידי הרגולטורים במעלה אחרים. נצמדתי-BS שהוצגו כאן לא-פולשנית לנטר היפו איתות פעילות הן חוץ גופית בתוך תאים חיים והן ויוו עכברים20,24 (איור 2). כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט למדידת נצמדתי קינאז הפעילות במבחנה באמצעות השרירים-BS. ראשית, אנו מראים איך נצמדתי-BS יכול לשמש כדי לחקור את השפעת חלבונים overexpressed בפעילות השרירים. לאחר מכן, אנו מראים איך החיישן יכול לשמש כדי לפקח על הפעילות של השביל היפופוטם לאחר הטיפול עם סוכנים להסדרת מסלול היפו. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לזהות ולאפיין איתות המסלולים או גירויים ויסות פעילות קינאז השרירים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="692">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:91px;">2520056</td>
			<td style="width:213px;">0.25%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:91px;">F1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DMEM</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:91px;">D6429-500ml</td>
			<td>DMEM with high glucose&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td style="width:121px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:91px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Signagen</td>
			<td style="width:91px;">SL100688.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">5x Passive lysis buffer</td>
			<td style="width:121px;">Promega</td>
			<td style="width:91px;">E194A</td>
			<td>30 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Dual-Glo&#174; Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:121px;">Promega</td>
			<td style="width:91px;">E2940</td>
			<td>100 ml kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">20/20 luminometer</td>
			<td style="width:121px;">Turner Biosystems</td>
			<td style="width:91px;">998-2036</td>
			<td>Single tube reader luminometer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">GloMax&#174;Navigator with dual injectors</td>
			<td style="width:121px;">Promega</td>
			<td style="width:91px;">GM2010</td>
			<td>96-well plates reader luminometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring hippo signaling pathway activity using a luciferase-based large tumor suppressor (lats) biosensor

ההיפופוטם איתות הוא מווסת ההכפלה של גודל איבר ויש לו תפקידים חשובים לביולוגיה סרטן ופיתוח. בשל האתגרים הטכניים, זה נשאר קשה להעריך את הפעילות של מסלול איתות זה ומפרשים בתוך הקשר הביולוגי. הספרות הקיימת על מדכאי גדולים (באמת) מסתמך על שיטות הינן איכותיות, לא יכול בקלות להיות קנה המידה להמציא להקרנה. לאחרונה, פיתחנו ביוסנסור מבוססי ביולומינסנציה כדי לפקח על הפעילות קינאז של רכיב מרכזי נצמדתי-a של המפל קינאז היפו. כאן, אנו מתארים את נהלי איך הזה ביוסנסור נצמדתי (השרירים-BS) יכול לשמש כדי לאפיין היפו מסלול הרגולטורים. ראשית, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור חוקרים את השפעת מועמד חלבונים overexpressed (למשל, VEGFR2) על פעילות השרירים באמצעות השרירים-BS. לאחר מכן, אנו מראים איך נצמדתי-BS יכול לשמש עבור מסך מעכבי קינאז בקנה מידה קטן. פרוטוקול זה יתכן כבניין יכול להיות קנה המידה-up כדי לבצע במסכים גדולים יותר, אשר ללא ספק יזהה הרגולטורים הרומן של הנתיב היפו.

נצמדתי-BS היה cotransfected עם גנים שונים כדי להעריך את השפעתם על פעילות השרירים (איור 3). בניסוי זה, שימש Renilla בקרה פנימית. הביטוי ארעית של הפה-5SA, צורה פעילה המכונן של הפה, גורם להגברת רמות של מטרות תעתיק הפה עלייה עוקבות נצמדתי פעילות קינאז דרך מסלול משוב הוקמ...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Hippo Signaling Pathway Activity Using a Luciferase-based Large Tumor Suppressor LATS Biosensor at JoVE.com

Monitoring Hippo Signaling Pathway Activity Using a Luciferase-based Large Tumor Suppressor LATS Biosensor

כאן אנו מציגים ביוסנסור מבוססי לוציפראז לכמת את פעילות קינאז מדכאי גדולים (באמת)-קינאז המרכזית בההיפופוטם איתות. ביוסנסור הזה יש יישומים שונים ומגוונים במחקר בסיסי והתרגום שמטרתה לחקור היפו מסלול הרגולטורים במבחנה וב -vivo.

ניטור היפו איתות לשביל פעילות באמצעות ביוסנסור משתיק קול (באמת) מבוסס-לוציפראז הגידול גדול

The Hippo signaling pathway is a conserved regulator of organ size and has important roles in the development and cancer biology. Due to technical ...

המעבדה שלי כבר לומדת את התפקיד של מסלול היפו בסרטן השד והריאות, ולאחרונה, פיתחנו biosensor הרומן כדי לפקח על פעילות איתות היפופוטם. שיטה זו יכולה לשמש כדי לענות על שאלות מפתח על רשתות איתות סלולרי, כגון כיצד מסלול היפו מגיב לגורמים וכיצד הוא מקיים אינטראקציה עם מסלולי איתות אחרים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא הרגישות הגדולה שלה וגם את המספר הגדול של הדגימות ניתן לעבד במהירות ובו זמנית.טכניקה זו יש יישומים מגוונים במחקר בסיסי ותרגום כדי לחקור את הרגולטורים של מסלול איתות היפו הן במבחנה והן במבחנה. בתור התחלה, מיני הכנה LATS-BS plasmids טרי מתרבות נוזלית חיידקים DH5-אלפא. שעה לפני ההטעה, שאפו את המדיום מהצלחת, והוסיפו 500 מיקרוליטרים של צמיחה בינונית לכל באר.נקודה חשובה אחת היא כי BIOSENSor LATS חייב להיות מוכן טרי על מנת לקבל ביטוי מקסימלי ופעילות. כמו כן, מומלץ תמיד להשתמש ברגולטור במעלה הזרם של מסלול היפו, כגון MSD, כבקרה חיובית בעת ביצוע בדיקות לוציפראז. לאחר מכן, להחזיר את התאים לאנקובטור.לאחר מכן, הכינו פתרון א', פתרון דנ"א ופתרון ב', רהט דואלי המבוסס על פולימר, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, מיד להוסיף פתרון B לפתרון A, בעדינות pipette למעלה ולמטה לערבב. הדגירה את המדגם בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות כדי לאפשר קומפלקסים transfection להיווצר.לאחר מכן מוסיפים את הנפח הכולל של קומפלקסים transfection טיפה חכם לכל באר של הצלחת עם מערבולת עדינה. דגירה התאים לילה ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת, הסר את המדיה המכילה את ההטרמפקציה והחלף אותה במדיה שלמה ורעננה.ואז לתרבת את התאים ב 37 מעלות צלזיוס ליום אחד יותר. מדללים כמות מתאימה של חיץ תזה פסיבי פי 5 עם מים מזוקקים. לאחר מכן, שאף לחלוטין את התקשורת מהצלחת.מוסיפים מיליליטר אחד של PBS לכל באר, ומערבבים את הצלחת בעדינות כדי להסיר תאים מנותקים ומדיית צמיחה שיורית. ואז שאף PBS לחלוטין. לאחר מכן, להוסיף 250 microliters של 1xPLB לכל באר.מניחים את צלחת התרבות על פלטפורמת נדנדה במשך 15 דקות כדי להבטיח כיסוי שווה של monolayer התא עם PLB. לאחר מכן, להעביר את lysate לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר. מוציאים את ה-LAR-2 מאחסון של 80 מעלות צלזיוס, ומאיים אותו לטמפרטורת החדר.לאחר מכן, הכינו את רניה לכמות מתאימה של תדהמה. הוסף את הריג'נט לזיהוי רנילה למצע 50x ואת המאגר שלו. לאחר מכן, מחלקים 10 מיקרוליטרים של כל תא lysate לתוך צינורות 1.5 מיליליטר.לאחר מכן, תכנת מד זוהר לביצוע השהיה של שתי שניות לפני המדידה, ולאחר מכן תקופת מדידה של 10 שניות. בזהירות, להעביר 20 microliters של LAR-2 reagent לתוך צינור אחד, במהירות פיפטה למעלה ולמטה לערבב. לאחר מכן, מיד למקם את הצינור בלומינומטר וליזום את הקריאה.לאחר הקריאה, להסיר את הצינור מדגם מן הזוהר, להוסיף 20 microliters של רנילה reagent, ו pipette למעלה ולמטה לערבב. לאחר מכן, מניחים את הדגימה בלומינומטר ויוזם את הקריאה הבאה. ראשית, תאי מודעות של תרבות, ניתוק, ספירה וצלחת HEK293 כמתואר בפרוטוקול הטקסט.ואז, שעה לפני ההתהפוכים, שאפו את התקשורת מהצלחת והחליפו אותה בחמישה מיליליטר של מדיה חדשה ומלאה. לבסוף, הוסיפו פתרון B מדולל לפתרון א', ו-pipette למעלה ולמטה כדי לערבב. לאחר מכן, הדגירה את המדגם בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות לפני הוספת הנפח הכולל של קומפלקסים transfection לצלחת, תוך מערבולת בעדינות.דגירה התאים לילה ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת, נסה וספיר את התאים. צלחת 10, 000 עד 20, 000 תאים לתוך כל באר של צלחת 96 באר בנפח כולל של 100 microliters של מדיה לגם.לאחר מכן, הדגירה את התאים ליום אחד נוסף. שעה עד ארבע שעות לפני ביצוע בדיקה luciferase, להוסיף סוכנים פוטנציאל ויסות מסלול היפו, בריכוז סופי של 10 micromolar לכל באר. לאחר מכן, שאפו את המדיה לחלוטין מהתאים ושטפו את התאים בכל באר עם 100 מיקרוליטרים של PBS.לאחר מכן, להוסיף 20 microliters של PLB לכל באר. מניחים את צלחת התרבות על פלטפורמת נדנדה במשך 15 דקות. לאחר מכן, להעביר 20 microliters של LAR-2 reagent לכל באר של הצלחת, ואת פיפטה למעלה ולמטה לערבב.מיד לאחר מכן, מניחים את הצלחת לתוך לומינומטר קריאת צלחת וליזום את הקריאה. בחלק הראשון של פרוטוקול זה, LATS-BS היה cotransfected עם גנים שונים כדי להעריך את השפעתם על פעילות LATS קינאז. בפרוטוקול השני, LATS-BS נותב לתוך HEK293-Ad, והתאים הועברו לתוך לוחות 96 בארות.40 שעות לאחר ההמרה, התאים טופלו עם מולקולות קטנות ידועות שונות של איתות היפו, ואחריו משגיח לוציפראז. כאשר מפרשים את התוצאות של בדיקות אלה, יש לציין כי חלבונים וטיפולים תרופתיים עשויים להפעיל מסלולי משוב המשפיעים על פעילות biosensor. ניסויים נוספים יהיו נחוצים כדי לאשר מערכת יחסים בין המועמד לבין מסלול איתות היפופוטם.בעקבות הליך זה, שיטות אחרות כמו כמותית בזמן אמת PCR, או כתם מערבי, ניתן להשתמש כדי לענות על שאלות נוספות על פעילות LATS קינאז. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של הסרטן לחקור את הדינמיקה והפעילות של מסלול איתות LATS kinase והיפו בתהליכים ביולוגיים וביוכימיים רבים. אל תשכח כי תרופות להקרנה יכול להיות מסוכן מאוד, אמצעי זהירות מתאימים תמיד יש לנקוט בעת ביצוע הליך זה.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Monitoring Hippo Signaling Pathway Activity Using a Luciferase-based Large Tumor Suppressor (LATS) Biosensor

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

מודל גידול Murine Orthotopic שלפוחית ​​השתן סרטן מערכת איתור

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

איפיון תאים סרטניים באמצעות חוט רפואי עבור לכידת מחזורי תאים סרטניים: בגישה 3D בהתבסס על Immunofluorescence ודגים דנ א

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

Live Cell Imaging of the TGF-	&beta;/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

Live Cell Imaging of the TGF-	ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

חיים תא הדמיה של TGF-β/Smad3 איתות לשביל במבחנה , In Vivo באמצעות מערכת הכתב אדנו

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

פולימראז דיגיטלי Assay תגובת שרשרת עבור הווריאציה גנטי לחולה סדיר פוליפוזיס באמצעות התבנית שבב-ב--שפופרת

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

החקירה של תלות גנטית באמצעות מבחני תחרות המבוססות על CRISPR-Cas9

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

האורך פיזיולוגיים מורפולוגיים ניטור של Spheroids תלת מימדי הגידול באמצעות טומוגרפיה אופטית קוהרנטית

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish

Predicting ב Vivo מטענים משלוח באמצעות הגידול-מחסום דם-מוח בקערה

Highly selective by nature, the blood-brain barrier (BBB) is essential for the brain homeostasis in physiological conditions. However, in the context of ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

איתור וניטור של DNA הקשורים במחזור הגידול ב ביולואידים חולה

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

אפיון מוטציות הקשורות למחלות של חיל המשפחה באמצעות קבוצה של שיטות מעשיות ושימושיות

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

זיהוי של שעתוק מקדם ווסת באמצעות הקרנת תפוקה בינונית של ספריות מסודר וכתבת המבוססת על כפול-לוציפראז

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...