Name: monitoring hippo signaling pathway activity using a luciferase-based large tumor suppressor (lats) biosensor
Uploaded: 2018-09-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Hippo Signaling Pathway Activity Using a Luciferase-based Large Tumor Suppressor LATS Biosensor at JoVE.com

Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni dall'Istituto canadese di ricerca salute (CIHR n. 119325, 148629) e la Fondazione canadese per la cancro seno (CBCF) a XY. TA è supportato dalla borsa di studio di laurea Canada Vanier e Ontario International Graduate Scholarship. HJJVR è supportato da una regina Elizabeth II Graduate Scholarship in scienza e tecnologia.

1. indagine di un putativo regolatore di Hippo segnalazione utilizzando il LATS-BS
<ol><li>
Placcatura e transfezione delle celle
	<ol>
<li>Preparazione della coltura delle cellule<ol>
<li>Caldo, 1x PBS DMEM contenente 10% FBS e 1% di penicillina/streptomicina e 0,25% tripsina-EDTA a 37 ° C a bagnomaria per circa 30 min.</li>
			<li>Pulire un mobile di biosicurezza con etanolo al 70%.</li>
			<li>Piatti di coltura del tessuto, le pipette Pasteur, pipette sierologiche e puntali per inserire il cappucci...

<ol>
	<li>Justice, R. W., Zilian, O., Woods, D. F., Noll, M., Bryant, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+tumor+suppressor+gene+warts+encodes+a+homolog+of+human+myotonic+dystrophy+kinase+and+is+required+for+the+control+of+cell+shape+and+proliferation.">The Drosophila tumor suppressor gene warts encodes a homolog of human myotonic dystrophy kinase and is required for the control of cell shape and proliferation.</a> Genes &amp; Development. 9 (5), 534-546 (1995).</li><li>Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+tumor+suppressors+in+genetic+mosaics:+the+Drosophila+lats+gene+encodes+a+putative+protein+kinase.">Identifying tumor suppressors in genetic mosaics: the Drosophila lats gene encodes a putative protein kinase.</a> Development. 121 (4), 1053-1063 (1995).</li><li>Taha, Z., Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+Pathway:+Immunity+and+Cancer.">The Hippo Pathway: Immunity and Cancer.</a> Cancers. 10 (4), 94 (2018).</li><li>Maugeri-Sacc&#224;, M., De Maria, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+pathway+in+normal+development+and+cancer.">The Hippo pathway in normal development and cancer.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 186, 60-72 (2018).</li><li>van Rensburg, H. J. J., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+the+Hippo+pathway+in+cancer+metastasis.">The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis.</a> Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).</li><li>Yeung, B., Yu, J., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+the+Hippo+pathway+in+lung+development+and+tumorigenesis.">Roles of the Hippo pathway in lung development and tumorigenesis.</a> International Journal of Cancer. 138 (3), 533-539 (2016).</li><li>Zhao, Y., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+pathway+in+chemotherapeutic+drug+resistance.">The Hippo pathway in chemotherapeutic drug resistance.</a> International Journal of Cancer. 137 (12), 2767-2773 (2015).</li><li>Yu, F. -. X., Guan, K. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+pathway:+regulators+and+regulations.">The Hippo pathway: regulators and regulations.</a> Genes &amp; Development. 27 (4), 355-371 (2013).</li><li>Yang, X., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+size+control+in+development+and+human+diseases.">Molecular mechanism of size control in development and human diseases.</a> Cell Research. 21 (5), 715 (2011).</li><li>Visser, S., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LATS+tumor+suppressor:+a+new+governor+of+cellular+homeostasis.">LATS tumor suppressor: a new governor of cellular homeostasis.</a> Cell Cycle. 9 (19), 3892-3903 (2010).</li><li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+YAP+oncoprotein+by+the+Hippo+pathway+is+involved+in+cell+contact+inhibition+and+tissue+growth+control.">Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control.</a> Genes &amp; Development. 21 (21), 2747-2761 (2007).</li><li>Hao, Y., Chun, A., Cheung, K., Rashidi, B., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+suppressor+LATS1+is+a+negative+regulator+of+oncogene+YAP.">Tumor suppressor LATS1 is a negative regulator of oncogene YAP.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (9), 5496-5509 (2008).</li><li>Ozawa, T., Kaihara, A., Sato, M., Tachihara, K., Umezawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split+Luciferase+as+an+Optical+Probe+for+Detecting+Protein.">Split Luciferase as an Optical Probe for Detecting Protein.</a> Protein Interactions in Mammalian Cells Based on Protein Splicing. Analytical Chemistry. 73 (11), 2516-2521 (2001).</li><li>Hashimoto, T., Adams, K. W., Fan, Z., McLean, P. J., Hyman, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+oligomer+formation+of+amyloid-&#946;+peptide+using+a+split-luciferase+complementation+assay.">Characterization of oligomer formation of amyloid-&#946; peptide using a split-luciferase complementation assay.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (31), 27081-27091 (2011).</li><li>Decock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+by+a+highly+sensitive+split+luciferase+assay+of+the+regions+involved+in+APP+dimerization+and+its+impact+on+processing.">Analysis by a highly sensitive split luciferase assay of the regions involved in APP dimerization and its impact on processing.</a> FEBS Open Bio. 5 (1), 763-773 (2015).</li><li>Azad, T., Tashakor, A., Rahmati, F., Hemmati, R., Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillation+of+apoptosome+formation+through+assembly+of+truncated+Apaf-1.">Oscillation of apoptosome formation through assembly of truncated Apaf-1.</a> European Journal of Pharmacology. 760, 64-71 (2015).</li><li>Br&#252;ckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+two-hybrid,+a+powerful+tool+for+systems+biology.">Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology.</a> International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).</li><li>Pattnaik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+plasmon+resonance.">Surface plasmon resonance.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 126 (2), 79-92 (2005).</li><li>Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+resonance+energy+transfer.">Fluorescence resonance energy transfer.</a> Current Opinion in Biotechnology. 6 (1), 103-110 (1995).</li><li>Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-luciferase+complementary+assay:+applications,+recent+developments,+and+future+perspectives.">Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).</li><li>Hu, C. -. D., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+protein+interactions+in+living+cells+using+multicolor+fluorescence+complementation+analysis.">Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis.</a> Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).</li><li>Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+enigma+of+multicolor+bioluminescence+of+firefly+luciferase.">Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (7), 1167-1182 (2011).</li><li>Paulmurugan, R., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+library+screening+for+developing+an+improved+split-firefly+luciferase+fragment-assisted+complementation+system+for+studying+protein-protein+interactions.">Combinatorial library screening for developing an improved split-firefly luciferase fragment-assisted complementation system for studying protein-protein interactions.</a> Analytical Chemistry. 79 (6), 2346-2353 (2007).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+LATS+biosensor+screen+identifies+VEGFR+as+a+regulator+of+the+Hippo+pathway+in+angiogenesis.">A LATS biosensor screen identifies VEGFR as a regulator of the Hippo pathway in angiogenesis.</a> Nature Communications. 9 (1), 1061 (2018).</li><li>Moroishi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+YAP/TAZ-induced+feedback+mechanism+regulates+Hippo+pathway+homeostasis.">A YAP/TAZ-induced feedback mechanism regulates Hippo pathway homeostasis.</a> Genes &amp; Development. 29 (12), 1271-1284 (2015).</li></ol>

Mentre la via di Hippo svolge ruoli critici in vari processi biologici e disregolazione del pathway Hippo conduce a cancro6, come il pathway di Hippo è regolamentato in risposta a vari stimoli completamente non è capito. Inoltre, c' non è stato nessun sistema quantitativo e in tempo reale per valutare l'attività dei componenti di base di ippopotamo. Recentemente, abbiamo sviluppato e validato un biosensore romanzo per misurare l'attività della chinasi lettoni del Hippo pathway<sup class="xref...

L'ippopotamo signaling pathway è stato identificato in Drosophila come un romanzo regolatore di crescita delle cellule e animali dimensione1,2. Fin dalla sua scoperta iniziale, le prove crescenti ha dimostrato in modo convincente che il pathway di Hippo svolge ruoli critici nello sviluppo (per esempio, lo sviluppo embrionale precoce, controllo delle dimensioni dell'organo e morfologia tridimensionale [3D]), nella tumorigenesi ( ad esempio, lo sviluppo del tumore, metastasi, l'angiogenesi, evasione immune, instabilità genomica, risposta allo stress e resistenza ai farmaci) e dell'omeostasi tissutale (ad es., rinnovamento delle cellule staminali e differenziazione e rigenerazione dei tessuti dopo l'infortunio) 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. segnalazione hippo è frequentemente dysregulated in vari cancri7,8,9,10,11,12. Di conseguenza, delucidamento funzioni del pathway ippopotamo nella biologia del cancro e terapeutica e della medicina rigenerativa è diventata una delle aree più calde nella ricerca biomedica.
In breve, nella via dell'ippopotamo, al momento dell'attivazione di regolatori a Monte (ad es., contatto della cellula-cellula, lo stress nutritivo e matrice extracellulare [ECM]), chinasi serina/treonina (S/T) MST1/2 (MST; mammiferi omologhi di Drosophila Ippona) fosforilare/attivare adattatore proteine hMOB1 e WW45, così come chinasi di LATS1/2 (LATS) che, successivamente, fosforilano coattivatore trascrizionale YAP e relativo paralog TAZ a HX(H/R/K)XX(S/T) conservata (H, istidina; R, arginina; K, lisina; S, Serina; T, treonina; X, qualsiasi aminoacidi) motivi, tra cui YAP-S127 e TAZ-S8911,12. S127-fosforilato YAP (YAP-pS127) e TAZ S89-fosforilato (TAZ-pS89) sono degradati da ubiquitinazione o legarsi alla proteina citoplasmatica 14-3-3 e viene impedito che interagiscono con fattori di trascrizione di TEAD1-4 nel nucleo a transactivate a valle geni coinvolti nella proliferazione cellulare e apoptosi (Figura 1). Nonostante l'enorme interesse nella via dell'ippopotamo, esistono alcuni strumenti per la misurazione dell'ippopotamo di segnalazione e quelli che sono stati storicamente limitato ai giornalisti di output trascrizionale YAP/TAZ/TEAD. Infatti, fino a poco tempo fa, non c'erano nessun strumenti per misurare la dinamica e l'attività del Hippo segnalazione componenti in maniera quantitativa, in tempo reale, ad alta velocità e non invasivo sia in vitro che in vivo.
Data la nostra comprensione del ruolo delle interazioni proteina-proteina in fisiologia e patologia emergenti, c'è grande interesse nello sviluppo di strumenti che possono essere utilizzati per lo studio di queste interazioni in una maniera quantitativa e in tempo reale13, 14,15,16. Infatti, c'è stato un progresso significativo nello sviluppo di strategie bioanalitici, inclusi il lievito due-ibrido (Y2H)17, surface plasmon resonance (SPR)18e saggi di Förster risonanza energy transfer (FRET)19 , per valutare le interazioni proteina-proteina. Tuttavia, questi approcci portano la limitazione di che richiedono ottimizzazione significativa dell'orientamento reporter, tale che molti costrutti devono essere testati per trovare uno efficiente. Ulteriormente, questi approcci hanno anche un rapporto segnale-rumore relativamente basso, tale che può essere difficile discernere un vero positivo di segnalazione.
Analisi di complementazione di proteina sono state sviluppate per superare queste limitazioni. La prima generazione di analisi di complementazione di proteina è stata basata sulle proteine di fluorescenza multicolore di Spalato e non riusciva a risolvere le limitazioni di cui sopra20. Fluorescenza multicolore proteine consistono di un solo dominio, rendendo difficile per dividerli in due frammenti separati stabile con bassa affinità e sfondo rumore21. Successivamente, luciferasi firefly è stato identificato come un nuovo candidato per l'utilizzo nello sviluppo di analisi di complementazione di proteina Spalato. In questo approccio, luciferasi firefly sono diviso in due frammenti (N-terminale e C-terminale luciferasi [NLuc e CLuc]) con ogni frammento fusa ad una proteina dell'obiettivo di interesse. Se il NLuc e CLuc sono portati in prossimità sull'interazione delle proteine due bersaglio, l'attività luciferasica è ricostituito e luce bioluminescente viene generata in presenza di substrato luciferina e ATP22. Nel 2001, eseguendo uno screening combinatorio utilizzando una libreria contenente frammenti NLuc e CLuc tagliato in vari siti e associata a proteine con differenti linkers, Paulmurugan e Giacon presso la Stanford University ha sviluppato un ottimizzato Spalato-lucciola sistema di complementazione frammento-assistita di luciferasi per di interazioni proteina-proteina23. In questo sistema, luciferasi firefly viene tagliata due residui di serina e dell'aminoacido (aa) 398 per formare NLuc e CLuc, fissate alle due proteine di interesse utilizzando un linker flessibile di otto residui di glicina.
Utilizzando un approccio simile, abbiamo recentemente sviluppato un nuovo LATS-BS fondendo NLuc a 15 aa di YAP che circondano il sito di fosforilazione lettoni al S127 (YAP15) e CLuc con 14-3-3. La proteina di YAP full-length non è stata utilizzata, per evitare di confondere i segnali di modificazioni post-traduzionali di YAP (ad es., fosforilazione in altri siti e ubiquitinazione) da altri regolatori a Monte. Il LATS-BS qui presentato non invadente può monitorare Hippo segnalazione attività sia in vitro in cellule viventi e in vivo in topi20,24 (Figura 2). Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la misurazione LATS chinasi attività in vitro utilizzando il LATS-BS. In primo luogo, vi mostriamo come il LATS-BS può essere utilizzato per studiare l'effetto di una proteina overexpressed sull'attività lettoni. Quindi, vi mostriamo come biosensore può essere utilizzato per monitorare l'attività del pathway ippopotamo dopo il trattamento con agenti che regolano il pathway di ippopotamo. Questo protocollo potrebbe essere usato per identificare e caratterizzare le vie di segnalazione o stimoli che regolano l'attività della chinasi LATS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="692">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:91px;">2520056</td>
			<td style="width:213px;">0.25%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:91px;">F1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DMEM</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:91px;">D6429-500ml</td>
			<td>DMEM with high glucose&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td style="width:121px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:91px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Signagen</td>
			<td style="width:91px;">SL100688.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">5x Passive lysis buffer</td>
			<td style="width:121px;">Promega</td>
			<td style="width:91px;">E194A</td>
			<td>30 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Dual-Glo&#174; Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:121px;">Promega</td>
			<td style="width:91px;">E2940</td>
			<td>100 ml kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">20/20 luminometer</td>
			<td style="width:121px;">Turner Biosystems</td>
			<td style="width:91px;">998-2036</td>
			<td>Single tube reader luminometer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">GloMax&#174;Navigator with dual injectors</td>
			<td style="width:121px;">Promega</td>
			<td style="width:91px;">GM2010</td>
			<td>96-well plates reader luminometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring hippo signaling pathway activity using a luciferase-based large tumor suppressor (lats) biosensor

L'ippopotamo via di segnalazione è un regolatore conservato della dimensione dell'organo e ha ruoli importanti nella biologia sviluppo e cancro. A causa di problemi tecnici, resta difficile valutare l'attività di questa via di segnalazione e interpretarla all'interno di un contesto biologico. La letteratura esistente sulla grande oncosoppressore (LATS) si basa su metodi qualitativi e non possono facilmente essere su vasta scala per lo screening. Recentemente, abbiamo sviluppato un biosensore basato su bioluminescenza per monitorare l'attività della chinasi di componente di LATS-a base della cascata della chinasi di ippopotamo. Qui, descriviamo le procedure per come questo biosensore LATS (LATS-BS) può essere utilizzato per caratterizzare i regolatori della via di ippopotamo. In primo luogo, forniamo un protocollo dettagliato per lo studio dell'effetto di un candidato di proteina overexpressed (ad es., VEGFR2) sull'attività LATS utilizzando il LATS-BS. Quindi, vi mostriamo come il LATS-BS può essere utilizzato per uno schermo di inibitore di chinasi su piccola scala. Questo protocollo può essere concretamente su vasta scala per eseguire schermi più grandi, che senza dubbio individuerà nuovi regolatori del pathway di ippopotamo.

Il LATS-BS è stato cotransfected con geni differenti per valutare il loro effetto sull'attività LATS (Figura 3). In questo esperimento, Renilla è stato utilizzato come controllo interno. L'espressione transitoria di YAP-5SA, una forma attiva costitutiva di YAP, cause aumentando i livelli di target trascrizionali YAP e un successivo incremento nell'attività della chinasi lettoni attraverso un feedback stabiliti percorso25. ...

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Monitoring Hippo Signaling Pathway Activity Using a Luciferase-based Large Tumor Suppressor LATS Biosensor

Qui presentiamo un biosensore basato su luciferase per quantificare l'attività della chinasi del soppressore del tumore grande (LATS)-una centrale chinasi della via di segnalazione di Ippona. Questo biosensore ha diverse applicazioni nella ricerca di base e traslazionale, volta ad indagare Hippo pathway regolatori in vitro e in vivo.

Monitoraggio di Hippo segnalazione attività di via utilizzando un biosensore di basati su Luciferase grande tumore soppressore (LATS)

The Hippo signaling pathway is a conserved regulator of organ size and has important roles in the development and cancer biology. Due to technical ...

Il mio laboratorio ha studiato il ruolo del percorso di Ippopotamo nel cancro al seno e ai polmoni, e recentemente, abbiamo sviluppato un nuovo biosensore per monitorare l'attività di segnalazione di Ippopotamo. Questo metodo può essere utilizzato per rispondere a domande chiave sulle reti di segnalazione cellulare, come il modo in cui il percorso Ippopotamo risponde ai fattori e come interagisce con altri percorsi di segnalazione. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è la sua grande sensibilità e anche il gran numero di campioni può essere elaborato rapidamente e simultaneamente.Questa tecnica ha diverse applicazioni nella ricerca di base e traslazione per indagare i regolatori della via di segnalazione dell'Ippopotamo sia in vitro che in vivo. Per iniziare, i plasmidi mini-prep LATS-BS freschi di coltura liquida dei batteri DH5-Alpha. Un'ora prima della trasfezione, aspirare il mezzo dalla piastra e aggiungere 500 microlitri di mezzo di crescita ad ogni pozzo.Un punto importante è che il biosensore LATS deve essere preparato fresco per ottenere la massima espressione e attività. Inoltre, si consiglia di utilizzare sempre un regolatore a monte del percorso Ippopotamo, come msd, come controllo positivo quando si esegue il saggio luciferasi. Dopo questo, riportare le cellule nell'incubatrice.Successivamente, preparare la soluzione A, una soluzione di DNA, e la soluzione B, un reagente di trasfezione diluito a base polimerica, come descritto nel protocollo di testo. Successivamente, aggiungere immediatamente la soluzione B alla soluzione A e pipettare delicatamente su e giù per mescolare. Incubare il campione a temperatura ambiente per 15 minuti per consentire la forma dei complessi di trasfezione.Quindi aggiungere il volume totale dei complessi di trasfezione a goccia ad ogni pozzetto della piastra con un delicato vortice. Incubare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, rimuovere il supporto contenente complessi di trasfezione e sostituirlo con nuovi supporti completi.Quindi coltura le cellule a 37 gradi Celsius per un altro giorno. Diluire una quantità appropriata di tampone di lisi passiva 5x con acqua distillata. Quindi, aspirare completamente il supporto dalla piastra.Aggiungere un millilitro di PBS a ciascun pozzo e ruotare delicatamente la piastra per rimuovere le cellule staccate e i mezzi di crescita residui. Quindi aspirare completamente il PBS. Quindi, aggiungere 250 microlitri da 1xPLB a ciascun pozzo.Posizionare la piastra di coltura su una piattaforma a dondolo per 15 minuti per garantire una copertura uniforme del monostrato cellulare con PLB. Successivamente, trasferire il lysate in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri. Rimuovere il LAR-2 dallo stoccaggio di 80 gradi Celsius ed equilibrarlo a temperatura ambiente.Quindi, preparare il reagente di rilevamento renilla per una quantità appropriata di saggi. Aggiungere il reagente di rilevamento Renilla al substrato 50x e al suo buffer. Quindi, erogare 10 microlitri di ogni litolato cellulare in tubi da 1,5 millilitri.Quindi, programmare un luminometro per eseguire un ritardo di pre-misurazione di due secondi, seguito da un periodo di misurazione di 10 secondi. Con attenzione, trasferire 20 microlitri di reagente LAR-2 in un unico tubo e pipettare rapidamente su e giù per mescolare. Quindi, posizionare immediatamente il tubo nel luminometro e iniziare la lettura.Dopo la lettura, rimuovere il tubo campione dal luminometro, aggiungere 20 microlitri di reagente di Renilla e pipettare su e giù per mescolare. Quindi, posizionare il campione nel luminometro e iniziare la lettura successiva. In primo luogo, le celle di coltura, disconnetti, conteggio e piastra HEK293 Ad come descritto nel protocollo di testo.Quindi, un'ora prima della trasfezione, aspirare il supporto dalla piastra e sostituirlo con cinque millilitri di nuovi mezzi di crescita completi. Infine, aggiungere la soluzione diluita B alla soluzione A e pipettare su e giù per mescolare. Quindi, incubare il campione a temperatura ambiente per 15 minuti prima di aggiungere il volume totale dei complessi di trasfezione alla piastra, ruotando delicatamente.Incubare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno dopo, tripinare e contare le celle. Piastra da 10.000 a 20.000 celle in ogni pozzo di una piastra da 96 porri in un volume totale di 100 microlitri di supporti per pozzo.Dopo questo, incubare le cellule per un altro giorno. Da una a quattro ore prima di eseguire il saggio di luciferasi, aggiungere agenti che potenzialmente regolano la via dell'Ippopotamo, ad una concentrazione finale di 10 micromolari per pozzo. Successivamente, aspirare completamente il supporto dalle cellule e lavare le cellule in ogni pozzo con 100 microlitri di PBS.Quindi, aggiungere 20 microlitri di PLB ad ogni pozzo. Posizionare il piatto di coltura su una piattaforma a dondolo per 15 minuti. Quindi, trasferire 20 microlitri di reagente LAR-2 in ogni pozzo della piastra e pipettare su e giù per mescolare.Subito dopo, posizionare la piastra in un luminometro di lettura della piastra e iniziare la lettura. Nella prima parte di questo protocollo, il LATS-BS è stato cotrasfetto con diversi geni per valutarne l'effetto sull'attività della chinasi LATS. Nel secondo protocollo, la LATS-BS è stata trasfettata in HEK293-Ad, e le cellule sono state passate in piastre da 96 pozzi.40 ore dopo la trasfezione, le cellule sono state trattate con diversi regolatori di piccole molecole noti della segnalazione di Ippopotamo, seguiti da un saggio di luciferasi. Quando si interpretano i risultati di questi test, va notato che proteine e trattamenti farmacologici possono attivare percorsi di feedback che influenzano l'attività del biosensore. Ulteriori esperimenti saranno necessari per confermare una relazione tra il candidato e il percorso di segnalazione dell'Ippopotamo.Seguendo questa procedura, altri metodi come la PCR quantitativa in tempo reale, o Western Blot, possono essere utilizzati per rispondere a domande aggiuntive sull'attività lats chinasi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della biologia del cancro per esplorare la dinamica e l'attività della chinasi LATS e della via di segnalazione di Ippopotamo in molti processi biologici e biochimici. Non dimenticare che i farmaci per lo screening possono essere estremamente pericolosi e dovrebbero sempre essere prese precauzioni appropriate durante l'esecuzione di questa procedura.

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