Name: monitoring hippo signaling pathway activity using a luciferase-based large tumor suppressor (lats) biosensor
Uploaded: 2018-09-13T15:00:00
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この作品が助成金からカナダの健康研究所 (機構 #119325 148629) によって支えられた、XY にカナダ乳がんがん財団 (CBCF)。TA は、ヴァニエ カナダ大学院奨学金とオンタリオ州国際大学院奨学金によってサポートされます。HJJVR は、女王エリザベス II 大学院の奨学金科学技術によってサポートされます。

1。 カバはラッツ BS を使用して信号の推定レギュレータの調査
<ol><li>
めっきと細胞のトランスフェクション
	<ol>
<li>細胞培養の準備<ol>
<li>1x PBS、10 %fbs と 1% ペニシリン/ストレプトマイシンと約 30 分間水浴の 37 ° C に 0.25% トリプシン-EDTA を含む DMEM を温めます。</li>
			<li>70% のエタノールの安全キャビネットを徹底的に掃除します。</li>
			<li>必要に応じて、ティッシュ文化フー...

<ol>
	<li>Justice, R. W., Zilian, O., Woods, D. F., Noll, M., Bryant, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+tumor+suppressor+gene+warts+encodes+a+homolog+of+human+myotonic+dystrophy+kinase+and+is+required+for+the+control+of+cell+shape+and+proliferation.">The Drosophila tumor suppressor gene warts encodes a homolog of human myotonic dystrophy kinase and is required for the control of cell shape and proliferation.</a> Genes &amp; Development. 9 (5), 534-546 (1995).</li><li>Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+tumor+suppressors+in+genetic+mosaics:+the+Drosophila+lats+gene+encodes+a+putative+protein+kinase.">Identifying tumor suppressors in genetic mosaics: the Drosophila lats gene encodes a putative protein kinase.</a> Development. 121 (4), 1053-1063 (1995).</li><li>Taha, Z., Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+Pathway:+Immunity+and+Cancer.">The Hippo Pathway: Immunity and Cancer.</a> Cancers. 10 (4), 94 (2018).</li><li>Maugeri-Sacc&#224;, M., De Maria, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+pathway+in+normal+development+and+cancer.">The Hippo pathway in normal development and cancer.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 186, 60-72 (2018).</li><li>van Rensburg, H. J. J., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+the+Hippo+pathway+in+cancer+metastasis.">The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis.</a> Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).</li><li>Yeung, B., Yu, J., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+the+Hippo+pathway+in+lung+development+and+tumorigenesis.">Roles of the Hippo pathway in lung development and tumorigenesis.</a> International Journal of Cancer. 138 (3), 533-539 (2016).</li><li>Zhao, Y., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+pathway+in+chemotherapeutic+drug+resistance.">The Hippo pathway in chemotherapeutic drug resistance.</a> International Journal of Cancer. 137 (12), 2767-2773 (2015).</li><li>Yu, F. -. X., Guan, K. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+pathway:+regulators+and+regulations.">The Hippo pathway: regulators and regulations.</a> Genes &amp; Development. 27 (4), 355-371 (2013).</li><li>Yang, X., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+size+control+in+development+and+human+diseases.">Molecular mechanism of size control in development and human diseases.</a> Cell Research. 21 (5), 715 (2011).</li><li>Visser, S., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LATS+tumor+suppressor:+a+new+governor+of+cellular+homeostasis.">LATS tumor suppressor: a new governor of cellular homeostasis.</a> Cell Cycle. 9 (19), 3892-3903 (2010).</li><li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+YAP+oncoprotein+by+the+Hippo+pathway+is+involved+in+cell+contact+inhibition+and+tissue+growth+control.">Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control.</a> Genes &amp; Development. 21 (21), 2747-2761 (2007).</li><li>Hao, Y., Chun, A., Cheung, K., Rashidi, B., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+suppressor+LATS1+is+a+negative+regulator+of+oncogene+YAP.">Tumor suppressor LATS1 is a negative regulator of oncogene YAP.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (9), 5496-5509 (2008).</li><li>Ozawa, T., Kaihara, A., Sato, M., Tachihara, K., Umezawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split+Luciferase+as+an+Optical+Probe+for+Detecting+Protein.">Split Luciferase as an Optical Probe for Detecting Protein.</a> Protein Interactions in Mammalian Cells Based on Protein Splicing. Analytical Chemistry. 73 (11), 2516-2521 (2001).</li><li>Hashimoto, T., Adams, K. W., Fan, Z., McLean, P. J., Hyman, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+oligomer+formation+of+amyloid-&#946;+peptide+using+a+split-luciferase+complementation+assay.">Characterization of oligomer formation of amyloid-&#946; peptide using a split-luciferase complementation assay.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (31), 27081-27091 (2011).</li><li>Decock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+by+a+highly+sensitive+split+luciferase+assay+of+the+regions+involved+in+APP+dimerization+and+its+impact+on+processing.">Analysis by a highly sensitive split luciferase assay of the regions involved in APP dimerization and its impact on processing.</a> FEBS Open Bio. 5 (1), 763-773 (2015).</li><li>Azad, T., Tashakor, A., Rahmati, F., Hemmati, R., Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillation+of+apoptosome+formation+through+assembly+of+truncated+Apaf-1.">Oscillation of apoptosome formation through assembly of truncated Apaf-1.</a> European Journal of Pharmacology. 760, 64-71 (2015).</li><li>Br&#252;ckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+two-hybrid,+a+powerful+tool+for+systems+biology.">Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology.</a> International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).</li><li>Pattnaik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+plasmon+resonance.">Surface plasmon resonance.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 126 (2), 79-92 (2005).</li><li>Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+resonance+energy+transfer.">Fluorescence resonance energy transfer.</a> Current Opinion in Biotechnology. 6 (1), 103-110 (1995).</li><li>Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-luciferase+complementary+assay:+applications,+recent+developments,+and+future+perspectives.">Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).</li><li>Hu, C. -. D., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+protein+interactions+in+living+cells+using+multicolor+fluorescence+complementation+analysis.">Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis.</a> Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).</li><li>Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+enigma+of+multicolor+bioluminescence+of+firefly+luciferase.">Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (7), 1167-1182 (2011).</li><li>Paulmurugan, R., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+library+screening+for+developing+an+improved+split-firefly+luciferase+fragment-assisted+complementation+system+for+studying+protein-protein+interactions.">Combinatorial library screening for developing an improved split-firefly luciferase fragment-assisted complementation system for studying protein-protein interactions.</a> Analytical Chemistry. 79 (6), 2346-2353 (2007).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+LATS+biosensor+screen+identifies+VEGFR+as+a+regulator+of+the+Hippo+pathway+in+angiogenesis.">A LATS biosensor screen identifies VEGFR as a regulator of the Hippo pathway in angiogenesis.</a> Nature Communications. 9 (1), 1061 (2018).</li><li>Moroishi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+YAP/TAZ-induced+feedback+mechanism+regulates+Hippo+pathway+homeostasis.">A YAP/TAZ-induced feedback mechanism regulates Hippo pathway homeostasis.</a> Genes &amp; Development. 29 (12), 1271-1284 (2015).</li></ol>

カバ経路は様々 な生物学的プロセスに重要な役割を果たしているが、カバ経路の制御不全癌6につながる、様々 な刺激への応答でカバの経路を調整する方法は完全にわかりません。また、カバのコア コンポーネントのアクティビティを評価する定量的およびリアルタイム システムはないずっと。最近、我々 は開発およびカバ経路24ラッツ キナーゼ活性を?...

カバはシグナリング経路最初ショウジョウバエの細胞の成長と動物サイズ1,2の新規調節因子として同定されました。その最初の発見以来証拠説得力を示しているカバ経路が (例えば、初期胚、臓器サイズ制御、および三次元の [3-D] 形態)、開発に重要な役割を果たしていること腫瘍 (例えば腫瘍の開発、転移、血管新生、免疫回避、ゲノム不安定性、ストレス応答、および薬剤耐性)、および組織恒常性 (例えば、幹細胞の複製分化と損傷後の組織再生)3,4,5,6,7,8,9,10. カバがシグナル伝達は頻繁に様々 な癌7,8,9,10、11,12調節不全。したがって、がん生物学と治療と再生医療でカバ経路の機能を解明となっているホットな分野の生物医学研究における。
一言でいえば、カバ経路、上流のレギュレータ (例えば細胞間接触、養分ストレスは、細胞外マトリックス [ECM]) による活性化に MST1/2 (MST;ショウジョウバエカバの哺乳類ホモログ) セリン/スレオニンキナーゼ (S/T) 活性アダプター蛋白質 hMOB1 と WW45 をリン酸化/アクティブ化だけでなく、その後、転写コアクチベーター ヤップとその相同 (H、ヒスチジン; 保存 HX(H/R/K)XX(S/T) で TAZ をリン酸化するキナーゼを LATS1/2 (ラッツ)R、アルギニン。K, リジン;S、セリン;T, スレオニン;X の任意のアミノ酸) モチーフ、ヤップ S127 TAZ s89 デッドワカサギ11,12を含みます。S127 リン酸化ヤップ (ヤップ-pS127) および s89 デッドワカサギ リン酸化 TAZ (タズ pS89) ユビキチン化によって低下または細胞質タンパク質 14-3-3 にバインドし、下流 transactivate 核 TEAD1 4 転写因子との相互作用を防ぐ細胞の増殖とアポトーシス (図 1) にかかわる遺伝子。カバ経路の途方もない興味、にもかかわらずカバの信号を測定するためのいくつかのツールが存在してヤップ、タズ、TEAD 転写出力の記者に歴史的に限られているか。確かに、ごく最近までなかった定量的、リアルタイム、高スループット、および非侵襲的な方法でコンポーネントをシグナリング カバの状況やダイナミクスを測定するためのツールの in vitroとin vivoの両方。
私たち新興の生理学および病理学のタンパク質間相互作用の役割の理解を与え、定量的かつリアルタイム13、これらの相互作用を研究するためのツールの開発に大きな関心があります。 14,,1516。確かに、進展があった重要な酵母 2 ハイブリッド (Y2H)17、表面プラズモン共鳴 (SPR)18、蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET)19試金などのバイオ分析戦略の開発蛋白質蛋白質の相互作用を評価します。ただし、その多くの構造は、効率的な 1 つを見つけるテストする必要が、これらのアプローチはレポーター向きの大幅な最適化を必要とする制限を運ぶ。さらに、これらのアプローチもある比較的低い信号対雑音比など真の肯定的な信号を付けに挑戦することができます。
蛋白質否定回路試金は、これらの制限を克服するために開発されました。蛋白質否定回路試金の第一世代は、分割多色蛍光蛋白質に基づいていたし、前述の制限20を解決できなかった。多色蛍光タンパク質は、難しく低親和性とバック グラウンド ノイズ212 つの別々 の安定したフラグメントに分割する 1 つのドメインで構成されます。その後、ホタルのルシフェラーゼはスプリット蛋白質否定回路試金を開発するための新しい候補者として識別されました。このアプローチでは、ホタルのルシフェラーゼは興味のターゲット蛋白質に溶ける各フラグメントと共に 2 つのフラグメント ([NLuc と CLuc] の N 末端と C 末端のルシフェラーゼ) に分割されます。NLuc と CLuc は、2 つのターゲット蛋白質の相互作用の時に近くに持って来られる、ルシフェラーゼ活性を再構成し、ルシフェリン基板と ATP22存在下で発光光を生成します。2001 年を実行して様々 なサイトで NLuc と CLuc フラグメントを含むライブラリを使用して組合せスクリーニングをカット、異なるリンカー蛋白質に付け、Paulmurugan、スタンフォード大学の Gambhir が開発した最適化された分割-ホタル蛋白質蛋白質の相互作用23のルシフェラーゼ フラグメント支援補完システム。このシステムは、ホタルのルシフェラーゼはアミノ酸 (aa) 398 NLuc と CLuc、8 つのグリシン残基の適用範囲が広いリンカーを使用して興味の 2 つの蛋白質に付すを形成する、2 つのセリン残基でカットされます。
我々 は、15 NLuc を融合させることで新しいラッツ BS を最近開発同様のアプローチを使用して、S127 で背筋のリン酸化サイトを取り巻くヤップの aa (YAP15)、14-3-3 で CLuc。他の上流の規制当局がヤップ (例えば、他のサイトでユビキチン化リン酸化) の翻訳後修飾によるシグナルを交絡を避けるためには、実物大のヤップ蛋白質が使用できません。ここで紹介背筋 BS は、両方の細胞の体外および体内マウス20,24 (図 2) で非侵襲的信号活性カバを監視できます。ここでは、ラッツ キナーゼ活動の in vitroラッツ BS を使用して測定のための詳しいプロトコルについて述べる。まず、背筋活性発現タンパク質の効果を調べるための背筋 BS の使用方法を示します。その後、バイオ センサーを使用して、カバの経路を調整するエージェントと治療後カバ経路の活動を監視する方法を示す.このプロトコルは、識別し、シグナル伝達経路やラッツ キナーゼ活動を規制する刺激を分類する使用ことができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="692">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:91px;">2520056</td>
			<td style="width:213px;">0.25%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:91px;">F1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DMEM</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:91px;">D6429-500ml</td>
			<td>DMEM with high glucose&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td style="width:121px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:91px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Signagen</td>
			<td style="width:91px;">SL100688.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">5x Passive lysis buffer</td>
			<td style="width:121px;">Promega</td>
			<td style="width:91px;">E194A</td>
			<td>30 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Dual-Glo&#174; Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:121px;">Promega</td>
			<td style="width:91px;">E2940</td>
			<td>100 ml kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">20/20 luminometer</td>
			<td style="width:121px;">Turner Biosystems</td>
			<td style="width:91px;">998-2036</td>
			<td>Single tube reader luminometer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">GloMax&#174;Navigator with dual injectors</td>
			<td style="width:121px;">Promega</td>
			<td style="width:91px;">GM2010</td>
			<td>96-well plates reader luminometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring hippo signaling pathway activity using a luciferase-based large tumor suppressor (lats) biosensor

シグナル伝達経路カバは臓器のサイズの節約されたレギュレータし、開発および癌の生物学で重要な役割を持っています。技術的な問題のため、このシグナル伝達経路のアクティビティを評価して、生物学的文脈の中で解釈することは困難残ります。大きな腫瘍サプレッサー (ラッツ) に関する既存の文献は、スクリーニングを質的、ことはできません簡単にするスケール アップ法に依存します。最近では、カバのキナーゼカスケードの背筋のコア コンポーネントのキナーゼ活動を監視する生物発光に基づくバイオ センサーを開発しました。ここでは、我々 はカバ経路レギュレータを特徴付けるためのこの背筋バイオ センサー (LATS BS) の使用方法について手順を説明します。まず、背筋 BS を使用して背筋活動発現タンパク質候補者 (例えばVEGFR2) の効果を調査するための詳しいプロトコルをいたします。その後、小規模なキナーゼ阻害剤スクリーンのための背筋 BS の使用方法を示す.このプロトコルはうまくカバ経路の新規規制当局が確認されます間違いなく大画面を実行するスケール アップをすることができます。

ラッツ BS は背筋活動 (図 3) に及ぼす影響を評価するための異なる遺伝子を持つ cotransfected だった。この実験では、 Renillaは内部統制として使用されました。ヤップ 5SA の一過性の発現、ヤップの構成アクティブ フォーム設立されたフィードバック経路25ラッツ キナーゼ活性のヤップ転写ターゲットとその後の増加のレベ?...

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Monitoring Hippo Signaling Pathway Activity Using a Luciferase-based Large Tumor Suppressor LATS Biosensor

大きな腫瘍サプレッサー (ラッツ) のキナーゼ活動を定量化するルシフェラーゼを用いたバイオ センサーの紹介-中央キナーゼ シグナル伝達経路カバで。このバイオ センサーには、カバ経路レギュレータの in vitroとin vivoの調査を目的とした基礎やトランスレーショナル研究の多様なアプリケーションがあります。

信号経路活性ルシフェラーゼ ベースの大きい腫瘍のサプレッサー (ラッツ) バイオ センサーを用いたカバを監視

The Hippo signaling pathway is a conserved regulator of organ size and has important roles in the development and cancer biology. Due to technical ...

私の研究室では、乳癌や肺癌におけるカバ経路の役割を研究しており、最近ではカバのシグナリング活性を監視する新しいバイオセンサーを開発しました。この方法は、Hippo経路が因子にどのように反応するか、および他のシグナル伝達経路とどのように相互作用するかなど、細胞信号ネットワークに関する重要な質問に答えるために使用できます。既存の方法よりもこの技術の主な利点は、その大きな感度とサンプルの多数を迅速かつ同時に処理することができます。この技術は、インビトロとインビボの両方のHippoシグナル伝達経路の調節因子を調査するための基礎的および翻訳研究において多様な応用を有する。まず、DH5-アルファ菌液培養から新鮮なミニプレップLATS-BSプラスミド。トランスフェクションの1時間前に、プレートから培地を吸引し、各ウェルに500マイクロリットルの成長培地を加える。1つの重要なポイントは、最大の発現と活性を得るためにLATSバイオセンサーを新鮮に準備する必要があります。また、ルシファーゼアッセイを行う際には、MSDなどのヒッポ経路の上流レギュレータを正のコントロールとして常に使用することをお勧めします。この後、細胞をインキュベーターに戻す。次に、溶液A、DNA溶液、及び溶液Bを、テキストプロトコルに記載される、希釈ポリマー系トランスフェクション試薬を調製する。この後、溶液Bを溶液Aに直ちに添加し、ピペットを上下に軽く混ぜ合わせます。サンプルを室温で15分間インキュベートし、トランスフェクション複合体を形成させます。次に、穏やかな渦巻きでプレートの各ウェルに滴下トランスフェクション複合体の総体積を追加します。細胞を摂氏37度で一晩インキュベートする。翌日、トランスフェクション複合体含有培地を取り出し、新しい完全な培地に交換します。その後、さらに1日摂氏37度で細胞を培養します。5倍の受動リシスバッファーを蒸留水で適切な量の希釈します。その後、プレートから培地を完全に吸引する。各ウェルにPBSを1ミリリットル加え、プレートをそっと旋回させて、剥離した細胞と残留成長培地を取り除きます。その後、PBSを完全に吸引します。次に、各ウェルに250マイクロリットルの1xPLBを加えます。15分間ロッキングプラットフォーム上に培養プレートを置き、PLBで細胞単層のカバレッジを均等にします。この後、1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブにリゼートを移します。80°CのストレージからLAR-2を取り出し、室温に平衡化します。次に、レニラ検出試薬を適量のアッセイ用に調製します。50x基板とそのバッファーにレニラ検出試薬を加えます。次に、各細胞の10マイクロリットルを1.5ミリリットルのチューブに分配する。次いで、2秒前測定遅延を行い、続いて10秒の測定期間を実行するようにルミノメーターをプログラムする。慎重に、LAR-2試薬の20マイクロリットルを1つのチューブに移し、ピペットを上下に素早く混合します。その後、すぐにチューブをルミノメーターに入れ、読み取りを開始します。読み取り後、ルミノメーターからサンプルチューブを取り出し、20マイクロリットルのレニラ試薬を加え、ピペットを上下に混ぜます。次に、サンプルをルミノメーターに入れ、次の読み取りを開始します。まず、テキストプロトコルに記載されているように、培養、剥離、カウント、およびプレートHEK293 Ad-Cells。次いで、トランスフェクションの1時間前に、プレートから培地を吸引し、5ミリリットルの新鮮な完全成長培地に交換する。最後に、希釈溶液Bを溶液Aに加え、ピペットを上下に加え、混合する。次に、サンプルを室温で15分間インキュベートしてから、トランスフェクション複合体の総体積をプレートに加え、穏やかに旋回しながら行います。細胞を摂氏37度で一晩インキュベートする。翌日、細胞をトリプシン化して数えます。プレート10,000〜20,000細胞は、ウェルあたり100マイクロリットルの培地の合計体積で96ウェルプレートの各ウェルに入る。この後、細胞をもう1日インキュベートします。ルシファーゼアッセイを行う1〜4時間前に、カバ経路を調節する可能性のある薬剤を、井戸当たり10マイクロモルの最終濃度で添加する。次に、培地を細胞から完全に吸引し、各ウェルの細胞を100マイクロリットルのPBSで洗浄する。その後、各ウェルにPLBの20マイクロリットルを追加します。15分間、ロッキングプラットフォームの上に培養プレートを置きます。次いで、20マイクロリットルのLAR-2試薬をプレートの各ウェルに移し、ピペットを上下に混合した。この直後にプレートをプレート読み取りルミノ計に入れ、読み取りを開始します。このプロトコルの最初の部分では、LATS-BSは、LATSキナーゼ活性に対するその効果を評価するために、異なる遺伝子と共感染した。第2のプロトコルでは、LATS-BSをHEK293-Adにトランスフェクションし、細胞を96ウェルプレートに渡した。トランスフェクションの40時間後、細胞を、ヒッポシグナル伝達の異なる既知の小分子調節因子で処理し、続いてルシファーゼアッセイを行った。これらのアッセイの結果を解釈する場合、タンパク質および薬物治療は、バイオセンサ活性に影響を与えるフィードバック経路を活性化し得る。候補とカバのシグナル伝達経路との関係を確認するためには、さらなる実験が必要となる。この手順に従って、定量的リアルタイムPCR、またはウェスタンブロットのような他の方法を使用して、LATSキナーゼ活性に関する追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、がん生物学の分野の研究者が、多くの生物学的および生化学的プロセスにおけるLATSキナーゼおよびカバシグナル伝達経路のダイナミクスと活性を探求する道を開いた。スクリーニングのための薬物は非常に危険であり、この手順を実行している間は常に適切な予防措置を講じるべきであることを忘れないでください。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Monitoring Hippo Signaling Pathway Activity Using a Luciferase-based Large Tumor Suppressor (LATS) Biosensor

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

マウス同所性膀胱腫瘍モデルおよび腫瘍検出システム

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

循環腫瘍細胞を取り込むため医療用ワイヤー線を用いた腫瘍細胞の特性解析: 蛍光抗体法や DNA 魚に基づく 3 D アプローチ

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

Live Cell Imaging of the TGF-	&beta;/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

Live Cell Imaging of the TGF-	ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

TGF-β/Smad3 シグナリング経路の in VitroおよびIn Vivoアデノ ウイルス レポーター システムを使用しての細胞イメージングをライブします。

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

チップ チューブ形式を使用して散発的な家族性大腸腺腫症患者の遺伝的変異のデジタル ポリメラーゼ連鎖反応分析

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

CRISPR ベース Cas9 の競争の試金を使用して遺伝的依存関係の調査

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

光コヒーレンストモグラフィーを用いた三次元腫瘍回転楕円体の縦断的形態学的および生理学的監視

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish

皿に血液脳腫瘍-障壁を使用して生体ペイロード配信で予測

Highly selective by nature, the blood-brain barrier (BBB) is essential for the brain homeostasis in physiological conditions. However, in the context of ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

患者の生体流体における腫瘍関連循環DNAの検出とモニタリング

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

実用的で実現可能な方法のセットを使用してRAFファミリーキナーゼの疾患関連変異体を特徴付けます

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

アレイ化されたライブラリの中スループットスクリーニングとデュアルルシファーゼベースレポーターを用いた転写因子レギュレータの同定

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...

信号経路活性ルシフェラーゼ ベースの大きい腫瘍のサプレッサー (ラッツ) バイオ センサーを用いたカバを監視

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