Name: monitoring hippo signaling pathway activity using a luciferase-based large tumor suppressor (lats) biosensor
Uploaded: 2018-09-13T15:00:00
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이 작품에서 캐나다 연구소의 건강 연구 (CIHR #119325, 148629) 교부 금에 의해 지원 되었다 고는 캐나다 유방암 암 재단 (CBCF) XY. TA는 Vanier 캐나다 대학원 장학금과 온타리오 국제 대학원 장학금에 의해 지원 됩니다. HJJVR 퀸 엘리자베스 II 대학원 장학금 과학 기술에 의해 지원 됩니다.

1. 마 라트-학사를 사용 하 여 신호의 Putative 레 귤 레이 터의 조사
<ol><li>
도금 및 세포의 transfection
	<ol>
<li>세포 배양의 준비<ol>
<li>1 x PBS, 10 %FBS 1% 페니실린/스, 및 0.25 %trypsin-EDTA 약 30 분 동안 물 욕조에 37 ° C에 포함 된 DMEM 따뜻한.</li>
			<li>철저 하 게 청소 70% 에탄올 biosafety 내각.</li>
			<li>필요에 따라 조직 문화 후드에 조직 문화 요리, 파스퇴르 펫, 혈 청 학적인 펫, 그리고 피 펫 팁?...

<ol>
	<li>Justice, R. W., Zilian, O., Woods, D. F., Noll, M., Bryant, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+tumor+suppressor+gene+warts+encodes+a+homolog+of+human+myotonic+dystrophy+kinase+and+is+required+for+the+control+of+cell+shape+and+proliferation.">The Drosophila tumor suppressor gene warts encodes a homolog of human myotonic dystrophy kinase and is required for the control of cell shape and proliferation.</a> Genes &amp; Development. 9 (5), 534-546 (1995).</li><li>Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+tumor+suppressors+in+genetic+mosaics:+the+Drosophila+lats+gene+encodes+a+putative+protein+kinase.">Identifying tumor suppressors in genetic mosaics: the Drosophila lats gene encodes a putative protein kinase.</a> Development. 121 (4), 1053-1063 (1995).</li><li>Taha, Z., Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+Pathway:+Immunity+and+Cancer.">The Hippo Pathway: Immunity and Cancer.</a> Cancers. 10 (4), 94 (2018).</li><li>Maugeri-Sacc&#224;, M., De Maria, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+pathway+in+normal+development+and+cancer.">The Hippo pathway in normal development and cancer.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 186, 60-72 (2018).</li><li>van Rensburg, H. J. J., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+the+Hippo+pathway+in+cancer+metastasis.">The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis.</a> Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).</li><li>Yeung, B., Yu, J., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+the+Hippo+pathway+in+lung+development+and+tumorigenesis.">Roles of the Hippo pathway in lung development and tumorigenesis.</a> International Journal of Cancer. 138 (3), 533-539 (2016).</li><li>Zhao, Y., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+pathway+in+chemotherapeutic+drug+resistance.">The Hippo pathway in chemotherapeutic drug resistance.</a> International Journal of Cancer. 137 (12), 2767-2773 (2015).</li><li>Yu, F. -. X., Guan, K. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+pathway:+regulators+and+regulations.">The Hippo pathway: regulators and regulations.</a> Genes &amp; Development. 27 (4), 355-371 (2013).</li><li>Yang, X., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+size+control+in+development+and+human+diseases.">Molecular mechanism of size control in development and human diseases.</a> Cell Research. 21 (5), 715 (2011).</li><li>Visser, S., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LATS+tumor+suppressor:+a+new+governor+of+cellular+homeostasis.">LATS tumor suppressor: a new governor of cellular homeostasis.</a> Cell Cycle. 9 (19), 3892-3903 (2010).</li><li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+YAP+oncoprotein+by+the+Hippo+pathway+is+involved+in+cell+contact+inhibition+and+tissue+growth+control.">Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control.</a> Genes &amp; Development. 21 (21), 2747-2761 (2007).</li><li>Hao, Y., Chun, A., Cheung, K., Rashidi, B., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+suppressor+LATS1+is+a+negative+regulator+of+oncogene+YAP.">Tumor suppressor LATS1 is a negative regulator of oncogene YAP.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (9), 5496-5509 (2008).</li><li>Ozawa, T., Kaihara, A., Sato, M., Tachihara, K., Umezawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split+Luciferase+as+an+Optical+Probe+for+Detecting+Protein.">Split Luciferase as an Optical Probe for Detecting Protein.</a> Protein Interactions in Mammalian Cells Based on Protein Splicing. Analytical Chemistry. 73 (11), 2516-2521 (2001).</li><li>Hashimoto, T., Adams, K. W., Fan, Z., McLean, P. J., Hyman, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+oligomer+formation+of+amyloid-&#946;+peptide+using+a+split-luciferase+complementation+assay.">Characterization of oligomer formation of amyloid-&#946; peptide using a split-luciferase complementation assay.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (31), 27081-27091 (2011).</li><li>Decock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+by+a+highly+sensitive+split+luciferase+assay+of+the+regions+involved+in+APP+dimerization+and+its+impact+on+processing.">Analysis by a highly sensitive split luciferase assay of the regions involved in APP dimerization and its impact on processing.</a> FEBS Open Bio. 5 (1), 763-773 (2015).</li><li>Azad, T., Tashakor, A., Rahmati, F., Hemmati, R., Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillation+of+apoptosome+formation+through+assembly+of+truncated+Apaf-1.">Oscillation of apoptosome formation through assembly of truncated Apaf-1.</a> European Journal of Pharmacology. 760, 64-71 (2015).</li><li>Br&#252;ckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+two-hybrid,+a+powerful+tool+for+systems+biology.">Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology.</a> International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).</li><li>Pattnaik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+plasmon+resonance.">Surface plasmon resonance.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 126 (2), 79-92 (2005).</li><li>Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+resonance+energy+transfer.">Fluorescence resonance energy transfer.</a> Current Opinion in Biotechnology. 6 (1), 103-110 (1995).</li><li>Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-luciferase+complementary+assay:+applications,+recent+developments,+and+future+perspectives.">Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).</li><li>Hu, C. -. D., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+protein+interactions+in+living+cells+using+multicolor+fluorescence+complementation+analysis.">Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis.</a> Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).</li><li>Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+enigma+of+multicolor+bioluminescence+of+firefly+luciferase.">Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (7), 1167-1182 (2011).</li><li>Paulmurugan, R., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+library+screening+for+developing+an+improved+split-firefly+luciferase+fragment-assisted+complementation+system+for+studying+protein-protein+interactions.">Combinatorial library screening for developing an improved split-firefly luciferase fragment-assisted complementation system for studying protein-protein interactions.</a> Analytical Chemistry. 79 (6), 2346-2353 (2007).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+LATS+biosensor+screen+identifies+VEGFR+as+a+regulator+of+the+Hippo+pathway+in+angiogenesis.">A LATS biosensor screen identifies VEGFR as a regulator of the Hippo pathway in angiogenesis.</a> Nature Communications. 9 (1), 1061 (2018).</li><li>Moroishi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+YAP/TAZ-induced+feedback+mechanism+regulates+Hippo+pathway+homeostasis.">A YAP/TAZ-induced feedback mechanism regulates Hippo pathway homeostasis.</a> Genes &amp; Development. 29 (12), 1271-1284 (2015).</li></ol>

뚱 땡 통로 다양 한 생물학 과정에 중요 한 역할을 재생 하는 동안 뚱 땡 통로의 dysregulation 암6리드 어떻게 뚱 땡 통로 다양 한 자극에 대 한 응답에서 통제는 완전히 이해 되지. 또한, 코어 마 구성의 활동을 평가 하기 위해 아무 양적 및 실시간 시스템이 되었습니다. 최근, 우리 개발 하 고 검증 마 통로24에 라트 키 니 아 제 활동을 측정 하기 위한 새로운 바이오 ...

신호 통로 세포 성장 및 동물 크기1,2의 소설 레 귤 레이 터로 초파리 에 처음 발견 되었다 하는 마 그것의 처음 발견부터 장착 증거 설득 나타났습니다 뚱 땡 통로 (예를 들어, 초기 미 발달 발달, 기관 크기 제어 및 3 차원 [3 차원] 형태학), 개발에 중요 한 역할을 재생 tumorigenesis ( 예를 들어, 종양 개발, 전이, 신생, 면역 회피, genomic 불안정성, 스트레스 반응, 그리고 약물 저항), 및 조직의 항상성 (예:줄기 세포 재생 및 분화, 부상 후 조직 재생) 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. 자주 다양 한 암7,8,9,10,,1112에 dysregulated는 hippo 신호. 따라서, 암 생물학과 치료제 및 재생 의학 히포 통로의 기능을 elucidating 되고있다 인기 있는 지역 중 하나 생물 의학 연구에.
에 짧은, (예를 들어, 셀 연락처, 영양 스트레스, 및 기질 [ECM]), 업스트림 레 귤 레이 터에 의해 활성화 시 마 통로에 MST1/2 (MST, 초파리 뚱 땡의 포유류 homologs) 떠들고/트레오닌 (S/T) kinases phosphorylate/활성화 접합 기 단백질 hMOB1 및 WW45는, 그 후, phosphorylate transcriptional 공동 활성 야프와 그것의 paralog 보존된 HX(H/R/K)XX(S/T) (H, 히스티딘;에 TAZ LATS1/2 (라트) kinases 뿐만 아니라 R, 아르기닌; K, lysine; S, 떠들고; T, 트레오닌; X, 어떤 아미노산) 모티프, 야프 S127와 TAZ S8911,12를 포함 하 여. S127 phosphorylated 얍 (YAP-pS127) S89 phosphorylated TAZ (TAZ-pS89)는 ubiquitination에 의해 타락 또는 세포질 단백질 14-3-3에 바인딩할 및 하류 transactivate를 핵에서 TEAD1 4 전사 인자와 상호 작용 수 없습니다. 유전자 세포 증식 및된 apoptosis (그림 1). Hippo 신호 측정을 위한 몇 가지 도구 존재 마 통로에 엄청난 관심에도 불구 하 고 그 할 얍/TAZ/TEAD transcriptional 출력의 기자 들에 게 역사적으로 제한 되었습니다. 실제로, 아주 최근까지, 역학 및 양적, 실시간, 높은 처리량 및 비-침략 적 방식으로 구성 요소를 신호 하는 마의 활동을 측정 하기 위한 도구가 있었다 둘 다 생체 외에서 그리고 에 비보.
양적 및 실시간 방식으로13, 이러한 상호 작용을 공부 하는 데 사용할 수 있는 도구의 개발에 큰 관심은 우리의 신흥 생리학과 병 리에 있는 단백질 단백질 상호 작용의 역할의 이해를 감안할 때, 14,,1516. 실제로, 효 모 2 잡종 (Y2H)17, 표면 플라스몬 공명 (SPR)18및 포스터 공명 에너지 전달 (무서 워)19 분석 실험, 바이오 분석 전략의 개발에 큰 진전을 계속 있다 단백질 단백질 상호 작용 평가 그러나, 이러한 방식을 수행 기자 오리엔테이션의 상당한 최적화를 필요로의 한계는 효율적인 하나를 찾아 많은 구조를 테스트 해야 합니다. 또한, 이러한 방법 또한 있다 상대적으로 낮은 신호 대 잡음 비율, 그런 진정한 긍정적인 신호 분별 도전적 일 수 있다.
단백질 보완성 분석 실험은 이러한 한계를 극복 하기 위해 개발 되었다. 단백질 보완성 분석 실험의 1 세대 분할 다 색 형광 단백질을 기반으로 했다 고 상기 제한20를 해결할 수 있습니다. 하나의 도메인, 낮은 선호도와 배경 잡음21두 개의 별도 안정 된 조각으로 그들을 분할 하 고 어려운 다 색 형광 단백질에 의하여 이루어져 있다. 그 후, 반딧불 luciferase 분할 단백질 보완성 분석 실험 개발에 사용 하기 위해 새로운 후보자로 확인 되었다. 이 방법에서는, 반딧불 luciferase 관심의 대상 단백질에 융합 하는 각 조각으로 2 개의 파편 (N-터미널 및 단자 luciferase [NLuc 및 CLuc])으로 분할 됩니다. 경우 NLuc 및 CLuc는 두 대상 단백질의 상호 작용에 따라 근접으로, luciferase 활동 재구성 하 고 발광 빛 소 기질과 ATP22존재 생성 됩니다. 2001 년에 수행 하 여 조합 심사 NLuc 및 CLuc 파편을 포함 하는 라이브러리를 사용 하 여 다양 한 사이트에서 잘라내어 다른 링커와 단백질에 연결 된, Paulmurugan 및 스탠포드 대학에서 Gambhir 개발 최적화 된 분할-반딧불 단백질 단백질 상호 작용23luciferase 보완성 조각 기반 시스템. 이 시스템에서 반딧불 luciferase 아미노산 (aa) 398 NLuc와 CLuc, 8 글리신 잔류물의 유연한 링커를 사용 하 여 관심사의 2 개의 단백질에 연결 하 고 두 떠들고 잔류물에서 잘라입니다.
비슷한 접근 방식을 사용 하 여, 우리 최근 개발한 새로운 라트-학사 15 NLuc 융합 S127에 라트 인 산화 사이트를 둘러싼 야프의 aa (YAP15) 및 CLuc 14-3-3. 다른 업스트림 레 귤 레이 터에 의해 (예를 들어, 다른 사이트와 ubiquitination 인 산화) 얍의 포스트 번역 상 수정에 의해 신호를 혼동 하지 않으려면 전체 길이 얍 단백질 사용 되지 않습니다 했다. 여기에 제시 된 라트 학사 비 접촉 모두 살아있는 세포에 생체 외에서 그리고 vivo에서 쥐20,24 (그림 2)에서 활동을 신호 하는 마를 모니터링할 수 있습니다. 여기, 우리가 라트 키 니 아 제 활동에서 생체 외에서 라트-학사를 사용 하 여 측정 하기 위한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 첫째, 우리는 라트 활동에 overexpressed 단백질의 효과 조사 하는 라트-BS을 사용 하는 방법을 보여줍니다. 다음, 우리는 바이오 센서를 사용 하 여 에이전트 뚱 땡 통로 규제와 치료 후 마 통로의 활동을 모니터링 하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜 식별 및 신호 경로 또는 라트 키 니 아 제 활동을 규제 하는 자극의 특성 사용 될 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="692">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:91px;">2520056</td>
			<td style="width:213px;">0.25%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:91px;">F1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DMEM</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:91px;">D6429-500ml</td>
			<td>DMEM with high glucose&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td style="width:121px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:91px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Signagen</td>
			<td style="width:91px;">SL100688.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">5x Passive lysis buffer</td>
			<td style="width:121px;">Promega</td>
			<td style="width:91px;">E194A</td>
			<td>30 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Dual-Glo&#174; Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:121px;">Promega</td>
			<td style="width:91px;">E2940</td>
			<td>100 ml kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">20/20 luminometer</td>
			<td style="width:121px;">Turner Biosystems</td>
			<td style="width:91px;">998-2036</td>
			<td>Single tube reader luminometer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">GloMax&#174;Navigator with dual injectors</td>
			<td style="width:121px;">Promega</td>
			<td style="width:91px;">GM2010</td>
			<td>96-well plates reader luminometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring hippo signaling pathway activity using a luciferase-based large tumor suppressor (lats) biosensor

통로 신호 하는 마 장기 크기의 보존된 레 귤 레이 터 이며, 개발 및 암 생물학에 있는 중요 한 역할을 했다. 기술 과제 때문이 신호 통로의 활동을 평가 하 고 생물학 컨텍스트 내에서 해석 하기 어려운 남아 있다. 큰 종양 억제기 (라트)에 기존 문학 심사에 대 한 질적 고 수 없습니다 쉽게 수 수직 방법에 의존 합니다. 최근, 우리 마 키 니 아 제 폭포의 라트는 핵심 구성 요소의 키 니 아 제 활동을 모니터링 하는 생물 발광 기반 바이오 센서를 개발 했습니다. 여기, 우리 뚱 땡 통로 레 귤 레이 터 하이 라트를 바이오 센서 (라트-학사)을 사용 하는 방법을 위한 절차를 설명 합니다. 첫째, 우리 라트-학사를 사용 하 여 라트 활동에 조사는 overexpressed 단백질 후보 (예, VEGFR2)의 효과 대 한 자세한 프로토콜을 제공 합니다. 다음, 우리는 소규모 kinase 억제제 화면 라트-BS을 사용 하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜 feasibly 수직 의심할 여 지 없이 마 통로의 소설 레 귤 레이 터를 식별 것입니다 더 큰 화면을 수행할 수 있습니다.

라트-학사 라트 활동 (그림 3)에 미치는 영향을 평가 하는 다른 유전자와 cotransfected 했다. 이 실험에서 Renilla 는 내부 제어로 사용 되었다. 야프-5SA의 일시적 표현, 얍, 제정 활성 형태의 설립된 피드백 통로25통해 라트 키 니 아 제 활동에 야프 transcriptional 대상과 후속 증가의 레벨을 증가 하는 원인. MST, 뚱 땡 통로 (<strong class="x...

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Monitoring Hippo Signaling Pathway Activity Using a Luciferase-based Large Tumor Suppressor LATS Biosensor

여기에 우리가 현재 큰 종양 억제기 (라트)의 키 니 아 제 활동을 계량 luciferase 기반 바이오 센서-Hippo 신호 전달 경로에 중앙 니. 이 바이오 센서는 다양 한 응용 프로그램 기본 및 변환 연구 마 통로 레 귤 레이 터에서 생체 외에서 그리고 vivo에서조사 목적에 있다.

Hippo 신호 Luciferase 기반 큰 종양 억제기 (라트) 바이오 센서를 사용 하 여 경로 활동 모니터링

The Hippo signaling pathway is a conserved regulator of organ size and has important roles in the development and cancer biology. Due to technical ...

내 실험실은 유방암과 폐암에서 하마 통로의 역할을 연구하고있다, 최근에, 우리는 하마 신호 활동을 모니터링하는 새로운 바이오 센서를 개발했다. 이 방법은 하마 통로가 요인에 어떻게 반응하는지 및 다른 신호 경로와 상호 작용하는 방법과 같은 셀룰러 신호 네트워크에 대한 주요 질문에 답하는 데 사용할 수 있습니다. 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 큰 감도이며 많은 수의 샘플을 신속하고 동시에 처리할 수 있다는 것입니다.이 기술은 시험관 내 및 생체 내 하마 신호 경로의 조절기를 조사하기 위해 기본 및 번역 연구에서 다양한 응용 프로그램을 가지고 있습니다. 우선, DH5-알파 박테리아 액체 배양에서 신선한 미니 준비 LATS-BS 플라스미드. 트랜스펙트 1시간 전에 플레이트에서 배지를 흡인하고 각 웰에 500 마이크로리터의 성장 매체를 추가합니다.한 가지 중요한 점은 LATS 바이오센서가 최대의 발현과 활동을 얻기 위해 신선하게 준비되어야 한다는 것입니다. 또한, 항상 하마 경로의 업스트림 레귤레이터를 사용하는 것이 좋습니다, 같은 MSD등, luciferase 분석기를 수행 할 때 긍정적 인 제어로. 이 후 세포를 인큐베이터로 되돌리게 합니다.다음으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이, 액션 A, DNA 용액 및 용액 B, 희석된 폴리머 기반 형질 방출 시약을 준비한다. 그 후 즉시 솔루션 B를 솔루션 A에 추가하고 위아래로 부드럽게 파이펫을 섞습니다. 실온에서 15분 동안 샘플을 배양하여 형질 복합체가 형성되도록 합니다.그런 다음 부드러운 소용돌이와 접시의 각 우물에 드롭 현명한 경질 복합체의 총 볼륨을 추가합니다. 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 세포를 배양하십시오. 다음 날, 트랜스페션 복합체가 포함된 미디어를 제거하고 신선한 완전한 매체로 대체합니다.그런 다음 세포를 섭씨 37도에서 하루 더 배양합니다. 증류수로 적량의 5배 지속효과 리시스 버퍼를 희석시다. 그런 다음 접시에서 미디어를 완전히 흡인시합니다.각 웰에 PBS의 1 밀리리터를 추가하고, 분리 된 세포와 잔류 성장 매체를 제거하기 위해 부드럽게 접시를 소용돌이. 그런 다음 PBS를 완전히 흡인시합니다. 다음으로 각 웰에 1xPLB250 마이크로리터를 추가합니다.배양판을 15분 동안 흔들플랫폼에 배치하여 PLB로 셀 모노레이어의 커버리지를 보장합니다. 그 후, 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 lysate를 전송합니다. 80°C의 저장온도에서 LAR-2를 제거하고 실온에 상평합니다.그런 다음 적절한 양의 에세이를 위해 Renilla 검출 시약을 준비하십시오. Renilla 검출 시약을 50배 기판과 버퍼에 추가합니다. 다음으로, 각 세포의 10 마이크로리터를 1.5 밀리리터 튜브로 분배합니다.그런 다음 2초 사전 측정 지연을 수행하기 위해 광미계를 프로그래밍한 다음 10초 측정 기간을 수행합니다. 조심스럽게, LAR-2 시약의 20 마이크로 리터를 하나의 튜브로 옮기고, 빠르게 위아래로 파이펫을 섞어 넣습니다. 그런 다음 즉시 튜브를 발광계에 넣고 판독을 시작합니다.판독 후, 광미계에서 샘플 튜브를 제거하고, 렌닐라 시약의 20 마이크로 리터를 추가하고, 파이펫을 위아래로 섞어 넣습니다. 그런 다음 샘플을 발광계에 넣고 다음 판독을 시작합니다. 첫째, 텍스트 프로토콜에 기재된 바와 같이 HEK293 광고세포배양, 분리, 카운트 및 플레이트.그런 다음, 트랜스퍼션 1시간 전에 접시에서 미디어를 흡인하고 5밀리리터의 신선한 완전한 성장 매체로 대체하십시오. 마지막으로, 액솔루션 A에 희석된 용액 B를 추가하고 파이펫을 위아래로 섞어 넣습니다. 그런 다음, 샘플을 15분 동안 실온에서 배양한 후 경질하면서 플레이트에 십부전 복합체의 총 부피를 첨가합니다.섭씨 37도에서 하룻밤 동안 세포를 배양하십시오. 다음 날, 트립시니화하고 세포를 계산합니다. 플레이트 10, 000 ~ 20, 000 셀은 96웰 플레이트의 각 웰내로, 우물당 100 마이크로리터의 총 부피로 한다.이 후, 하루 더 세포를 배양. 루시파라아제를 수행하기 1~4시간 전에 하마 통로를 조절할 수 있는 에이전트를 추가하여, 최종 농도인 10 마이크로몰러를 잘 한다. 다음으로, 세포에서 미디어를 완전히 흡인하고 PBS의 100 마이크로 리터로 각각의 우물에서 세포를 씻는다.그런 다음 각 웰에 20 마이크로리터의 PLB를 추가합니다. 15분 동안 흔들리는 플랫폼에 문화판을 놓습니다. 그런 다음, LAR-2 시약 20 마이크로리터를 플레이트의 각 웰로 옮기고 파이펫을 위아래로 혼합합니다.이 직후 플레이트 를 읽는 광미계에 접시를 놓고 읽기를 시작합니다. 이 프로토콜의 첫 번째 부분에서 LATS-BS는 LATS 키나아제 활동에 미치는 영향을 평가하기 위해 다른 유전자와 결합되었습니다. 두 번째 프로토콜에서 LATS-BS는 HEK293-AD로 변형되었고 세포는 96웰 플레이트로 전달되었습니다.40 회광 후, 세포는 하마 신호의 다른 알려진 작은 분자 조절으로 처리되었다, 루시파아제 분석다음. 이러한 연구 결과의 해석을 해석할 때, 단백질과 약물 치료가 바이오 센서 활동에 영향을 미치는 피드백 경로를 활성화할 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 후보자와 하마 신호 경로 사이의 관계를 확인하기 위해 추가 실험이 필요합니다.이 절차에 따라 양적 실시간 PCR 또는 웨스턴 블롯과 같은 다른 방법을 사용하여 LATS 키나아제 활동에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 많은 생물학 및 생화학 프로세스에 있는 LATS 키나아제와 하마 신호 통로의 역학 그리고 활동을 탐구하는 암 생물학의 필드에 있는 연구원을 위한 도로를 포장했습니다. 스크리닝을 위한 약이 극단적으로 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오, 적절한 예방 조치는 항상 이 절차를 수행하는 동안 취해야 합니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Monitoring Hippo Signaling Pathway Activity Using a Luciferase-based Large Tumor Suppressor (LATS) Biosensor

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

쥐 동소 이식 방광 종양 모델 및 종양 탐지 시스템

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

연구

암 연구학

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

순환 종양 세포를 캡처에 대 한 의료 와이어를 사용 하 여 종양 세포의 특성: 면역 형광 DNA 물고기 기반으로 3 차원 접근

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

Live Cell Imaging of the TGF-	&beta;/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

Live Cell Imaging of the TGF-	ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

라이브 셀 이미징 TGF-β/Smad3 신호 통로 생체 외에서 그리고 Vivo에서 아 데 노 바이러스 기자 시스템을 사용 하 여

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

튜브에 칩 형식을 사용 하 여 산발적 인 가족 용 대 환자에 있는 유전 변이 대 한 디지털 중 합 효소 연쇄 반응 분석 결과

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

CRISPR-Cas9-기반 경쟁 분석 실험을 사용 하 여 유전 종속성의 조사

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

경도 형태 및 생리 적인 광학 일관성 단층 촬영을 사용 하 여 3 차원 종양 Spheroids의 모니터링

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish

예측의 Vivo 페이로드 배달 접시에 혈액 종양-배리어를 사용 하 여

Highly selective by nature, the blood-brain barrier (BBB) is essential for the brain homeostasis in physiological conditions. However, in the context of ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

환자 생체 유체에서 종양 관련 순환 DNA의 검출 및 모니터링

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

실용적이고 실행 가능한 방법 세트를 사용하여 RAF 패밀리 키나아제의 질병 관련 돌연변이 특성화

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

배열된 라이브러리의 중간 처리량 스크리닝및 이중 루시퍼라제 기반 리포터를 이용한 전사 계수 조절기 식별

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...