Name: monitoring hippo signaling pathway activity using a luciferase-based large tumor suppressor (lats) biosensor
Uploaded: 2018-09-13T15:00:00
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Este trabalho foi apoiado por subsídios do Instituto canadense de pesquisas saúde (CIHR #119325, 148629) e a Fundação Canadense de câncer da mama (CBCF) para XY. TA é suportado pela bolsa de pós-graduação de Canadá Vanier e a bolsa de pós-graduação de Internacional de Ontário. HJJVR é suportado por uma rainha Elizabeth II bolsa pós-graduação em ciência e tecnologia.

1. a investigação de um regulador putativo de hipopótamo sinalização usando o LATS-BS
<ol><li>
Chapeamento e transfecção de células
	<ol>
<li>Preparação de cultura celular<ol>
<li>Aquecer 1X PBS, DMEM contendo 10% FBS e 1% penicilina/estreptomicina e 0,25% do trypsin-EDTA a 37 ° C em banho-maria por aproximadamente 30 min.</li>
			<li>Limpe cuidadosamente um gabinete de segurança biológica com etanol a 70%.</li>
			<li>Coloque pratos de cultura de tecidos, pipetas Pasteur, pipetas e pontas...

<ol>
	<li>Justice, R. W., Zilian, O., Woods, D. F., Noll, M., Bryant, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+tumor+suppressor+gene+warts+encodes+a+homolog+of+human+myotonic+dystrophy+kinase+and+is+required+for+the+control+of+cell+shape+and+proliferation.">The Drosophila tumor suppressor gene warts encodes a homolog of human myotonic dystrophy kinase and is required for the control of cell shape and proliferation.</a> Genes &amp; Development. 9 (5), 534-546 (1995).</li><li>Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+tumor+suppressors+in+genetic+mosaics:+the+Drosophila+lats+gene+encodes+a+putative+protein+kinase.">Identifying tumor suppressors in genetic mosaics: the Drosophila lats gene encodes a putative protein kinase.</a> Development. 121 (4), 1053-1063 (1995).</li><li>Taha, Z., Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+Pathway:+Immunity+and+Cancer.">The Hippo Pathway: Immunity and Cancer.</a> Cancers. 10 (4), 94 (2018).</li><li>Maugeri-Sacc&#224;, M., De Maria, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+pathway+in+normal+development+and+cancer.">The Hippo pathway in normal development and cancer.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 186, 60-72 (2018).</li><li>van Rensburg, H. J. J., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+the+Hippo+pathway+in+cancer+metastasis.">The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis.</a> Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).</li><li>Yeung, B., Yu, J., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+the+Hippo+pathway+in+lung+development+and+tumorigenesis.">Roles of the Hippo pathway in lung development and tumorigenesis.</a> International Journal of Cancer. 138 (3), 533-539 (2016).</li><li>Zhao, Y., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+pathway+in+chemotherapeutic+drug+resistance.">The Hippo pathway in chemotherapeutic drug resistance.</a> International Journal of Cancer. 137 (12), 2767-2773 (2015).</li><li>Yu, F. -. X., Guan, K. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+pathway:+regulators+and+regulations.">The Hippo pathway: regulators and regulations.</a> Genes &amp; Development. 27 (4), 355-371 (2013).</li><li>Yang, X., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+size+control+in+development+and+human+diseases.">Molecular mechanism of size control in development and human diseases.</a> Cell Research. 21 (5), 715 (2011).</li><li>Visser, S., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LATS+tumor+suppressor:+a+new+governor+of+cellular+homeostasis.">LATS tumor suppressor: a new governor of cellular homeostasis.</a> Cell Cycle. 9 (19), 3892-3903 (2010).</li><li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+YAP+oncoprotein+by+the+Hippo+pathway+is+involved+in+cell+contact+inhibition+and+tissue+growth+control.">Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control.</a> Genes &amp; Development. 21 (21), 2747-2761 (2007).</li><li>Hao, Y., Chun, A., Cheung, K., Rashidi, B., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+suppressor+LATS1+is+a+negative+regulator+of+oncogene+YAP.">Tumor suppressor LATS1 is a negative regulator of oncogene YAP.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (9), 5496-5509 (2008).</li><li>Ozawa, T., Kaihara, A., Sato, M., Tachihara, K., Umezawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split+Luciferase+as+an+Optical+Probe+for+Detecting+Protein.">Split Luciferase as an Optical Probe for Detecting Protein.</a> Protein Interactions in Mammalian Cells Based on Protein Splicing. Analytical Chemistry. 73 (11), 2516-2521 (2001).</li><li>Hashimoto, T., Adams, K. W., Fan, Z., McLean, P. J., Hyman, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+oligomer+formation+of+amyloid-&#946;+peptide+using+a+split-luciferase+complementation+assay.">Characterization of oligomer formation of amyloid-&#946; peptide using a split-luciferase complementation assay.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (31), 27081-27091 (2011).</li><li>Decock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+by+a+highly+sensitive+split+luciferase+assay+of+the+regions+involved+in+APP+dimerization+and+its+impact+on+processing.">Analysis by a highly sensitive split luciferase assay of the regions involved in APP dimerization and its impact on processing.</a> FEBS Open Bio. 5 (1), 763-773 (2015).</li><li>Azad, T., Tashakor, A., Rahmati, F., Hemmati, R., Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillation+of+apoptosome+formation+through+assembly+of+truncated+Apaf-1.">Oscillation of apoptosome formation through assembly of truncated Apaf-1.</a> European Journal of Pharmacology. 760, 64-71 (2015).</li><li>Br&#252;ckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+two-hybrid,+a+powerful+tool+for+systems+biology.">Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology.</a> International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).</li><li>Pattnaik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+plasmon+resonance.">Surface plasmon resonance.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 126 (2), 79-92 (2005).</li><li>Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+resonance+energy+transfer.">Fluorescence resonance energy transfer.</a> Current Opinion in Biotechnology. 6 (1), 103-110 (1995).</li><li>Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-luciferase+complementary+assay:+applications,+recent+developments,+and+future+perspectives.">Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).</li><li>Hu, C. -. D., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+protein+interactions+in+living+cells+using+multicolor+fluorescence+complementation+analysis.">Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis.</a> Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).</li><li>Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+enigma+of+multicolor+bioluminescence+of+firefly+luciferase.">Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (7), 1167-1182 (2011).</li><li>Paulmurugan, R., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+library+screening+for+developing+an+improved+split-firefly+luciferase+fragment-assisted+complementation+system+for+studying+protein-protein+interactions.">Combinatorial library screening for developing an improved split-firefly luciferase fragment-assisted complementation system for studying protein-protein interactions.</a> Analytical Chemistry. 79 (6), 2346-2353 (2007).</li><li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+LATS+biosensor+screen+identifies+VEGFR+as+a+regulator+of+the+Hippo+pathway+in+angiogenesis.">A LATS biosensor screen identifies VEGFR as a regulator of the Hippo pathway in angiogenesis.</a> Nature Communications. 9 (1), 1061 (2018).</li><li>Moroishi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+YAP/TAZ-induced+feedback+mechanism+regulates+Hippo+pathway+homeostasis.">A YAP/TAZ-induced feedback mechanism regulates Hippo pathway homeostasis.</a> Genes &amp; Development. 29 (12), 1271-1284 (2015).</li></ol>

Enquanto via o hipopótamo tem um papel crítico em diversos processos biológicos, e desregulação da via hipopótamo leva ao câncer6, como o caminho de hipopótamo é regulamentado em resposta a vários estímulos não é completamente compreendido. Além disso, não houve nenhum sistema em tempo real e quantitativo para avaliar a atividade dos componentes principais do hipopótamo. Recentemente, temos desenvolvido e validado um romance biosensor para medir a atividade da quinase LATS no hipop...

O hipopótamo sinalização via foi identificada em Drosophila como um romance regulador do crescimento celular e animal tamanho1,2. Desde a sua descoberta inicial, evidências convincentemente demonstrou que que o percurso de hipopótamo tem um papel crítico no desenvolvimento (por exemplo, desenvolvimento embrionário precoce, controle de tamanho de órgão e tridimensional [3D] morfologia), (tumorigênese por exemplo, desenvolvimento de tumor, metástase, angiogênese, evasão imune, instabilidade genômica, resposta ao estresse e resistência às drogas) e a homeostase do tecido (por exemplo, renovação de células-tronco e diferenciação e regeneração de tecidos após lesão) 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. a sinalização de hipopótamo é frequentemente prejudicado em vários cânceres7,8,9,10,11,12. Por conseguinte, elucidar as funções da via hipopótamo na biologia do câncer e terapêutica e medicina regenerativa tornou-se uma das áreas mais quentes na investigação biomédica.
Em breve, na via de hipopótamo, após a activação pelos reguladores montante (por exemplo, contato célula-célula, stress nutriente e matriz extracelular [ECM]), quinase serina/treonina (S/T) de MST1/2 (MST; mamíferos homologs da drosófila Hippo) fosforilar/ativar adaptador proteínas hMOB1 e WW45, bem como as cinases de LATS1/2 (LATS) que, posteriormente, fosforilar ativador transcricional de co YAP e sua paralog TAZ em HX(H/R/K)XX(S/T) conservada (H, histidina; R, arginina; K, lisina; S, serina; T, treonina; X, qualquer aminoácidos) motivos, incluindo YAP-S127 e TAZ-S8911,12. YAP S127-fosforilada (YAP-pS127) e TAZ S89-fosforilada (TAZ-pS89) são degradados por ubiquitination ou ligam a proteína citoplasmática 14-3-3 e são impedidos de interagindo com fatores de transcrição TEAD1-4 no núcleo para transativar a jusante genes envolvidos na proliferação celular e apoptose (Figura 1). Apesar do enorme interesse na via de hipopótamo, existem poucas ferramentas para medir a sinalização de hipopótamo e aqueles que têm sido historicamente limitada aos repórteres de saída transcriptional YAP/TAZ/TEAD. Com efeito, até muito recentemente, não havia sem ferramentas para medir a dinâmica e a atividade do hipopótamo sinalização componentes de forma quantitativa, em tempo real, alta produtividade e não-invasiva tanto in vitro e in vivo.
Dada nossa compreensão do papel das interações da proteína-proteína em fisiologia e patologia de emergentes, há grande interesse no desenvolvimento de ferramentas que pode ser usado para estudar essas interações em uma forma quantitativa e em tempo real13, 14,15,16. Na verdade, tem havido um progresso significativo no desenvolvimento de estratégias de bio-analítica, incluindo do dois-híbrido de levedura (Y2H)17, a superfície plasmon ressonância (SPR)18e ensaios de19 do (FRET) de transferência de energia de ressonância Förster, para avaliar as interações da proteína-proteína. No entanto, essas abordagens carregam a limitação de que exigem otimização significativa da orientação do repórter, tal que muitas construções devem ser testadas para encontrar um eficiente. Além disso, essas abordagens também tem uma relativamente baixa relação sinal-ruído, tal que discernir uma sinalização positiva verdade pode ser um desafio.
Ensaios de complementação da proteína foram desenvolvidos para superar essas limitações. A primeira geração dos ensaios de complementação da proteína foi baseada em proteínas de fluorescência multicolor de divisão e não podia resolver as limitações acima referidas20. Proteínas de fluorescência multicolor consistem em apenas um domínio, tornando-se difícil separá-los em dois fragmentos separados de estáveis com baixa afinidade e ruído de fundo21. Posteriormente, luciferase de vaga-lume foi identificado como um novo candidato para uso no desenvolvimento de ensaios de complementação do separação da proteína. Nesta abordagem, luciferase de vaga-lume é dividido em dois fragmentos (N-terminal e C-terminal do luciferase [NLuc e CLuc]) com cada fragmento fundida a uma proteína do alvo de interesse. Se o NLuc e CLuc são trazidos para a proximidade com a interação das proteínas dois alvo, atividade do luciferase é reconstituída e luz bioluminescente é gerado na presença de substrato luciferina e ATP22. Em 2001, através da realização de uma análise combinatória usando uma biblioteca que contém fragmentos de NLuc e CLuc cortada em vários sites e ligado a proteínas com diferentes linkers, Paulmurugan e Glauber na Universidade de Stanford desenvolveram um otimizado split-vagalume sistema de complementação assistida por fragmento do luciferase de interações proteína-proteína23. Neste sistema, luciferase de vaga-lume é cortada em aminoácidos (aa) 398 para formar NLuc e CLuc, que estão ligados a duas proteínas de interesse usando um vinculador flexível de oito resíduos de glicina e dois resíduos de serina.
Usando uma abordagem similar, desenvolvemos recentemente um novo LATS-BS fundindo NLuc para 15 aa de YAP em torno do site de fosforilação LATS em S127 (YAP15) e CLuc com 14-3-3. A proteína de YAP completo não foi usada, para evitar confundir sinais por modificações borne-translational de YAP (por exemplo, a fosforilação em outros sites e ubiquitination) por outros reguladores upstream. O LATS-BS aqui apresentados não invasiva pode monitorar hipopótamo sinalização atividade tanto in vitro em células vivas e em vivo em ratos20,24 (Figura 2). Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para medir LATS quinase atividade no vitro usando o LATS-BS. Primeiro, mostramos como o LATS-BS pode ser usado para investigar o efeito de uma proteína Blumental na atividade LATS. Em seguida, mostramos como o biosensor pode ser usado para monitorar a atividade da via hipopótamo após tratamento com agentes regulando o percurso de hipopótamo. Este protocolo pode ser usado para identificar e caracterizar a sinalização de percursos ou estímulos que regulam a atividade da quinase LATS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="692">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:91px;">2520056</td>
			<td style="width:213px;">0.25%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:91px;">F1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DMEM</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:91px;">D6429-500ml</td>
			<td>DMEM with high glucose&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td style="width:121px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:91px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Signagen</td>
			<td style="width:91px;">SL100688.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">5x Passive lysis buffer</td>
			<td style="width:121px;">Promega</td>
			<td style="width:91px;">E194A</td>
			<td>30 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Dual-Glo&#174; Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:121px;">Promega</td>
			<td style="width:91px;">E2940</td>
			<td>100 ml kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">20/20 luminometer</td>
			<td style="width:121px;">Turner Biosystems</td>
			<td style="width:91px;">998-2036</td>
			<td>Single tube reader luminometer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">GloMax&#174;Navigator with dual injectors</td>
			<td style="width:121px;">Promega</td>
			<td style="width:91px;">GM2010</td>
			<td>96-well plates reader luminometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring hippo signaling pathway activity using a luciferase-based large tumor suppressor (lats) biosensor

O hipopótamo via de sinalização é um regulador conservado do tamanho do órgão e tem papéis importantes na biologia do desenvolvimento e câncer. Devido a desafios técnicos, continua a ser difícil avaliar a atividade desta via de sinalização e interpretá-lo dentro de um contexto biológico. A literatura existente sobre o supressor de tumor grande (LATS) se baseia em métodos qualitativos e não podem facilmente ser escalado-acima para a seleção. Recentemente, temos desenvolvido um biossensor baseado em bioluminescência para monitorar a atividade da quinase do LATS-a principal componente da cascata da quinase hipopótamo. Aqui, descrevemos procedimentos de como este biosensor LATS (LATS-BS) pode ser usado para caracterizar reguladores de caminho de hipopótamo. Primeiro, nós fornecemos um protocolo detalhado para investigar o efeito de um candidato de proteína Blumental (por exemplo, VEGFR2) na atividade LATS usando o LATS-BS. Em seguida, mostramos como o LATS-BS pode ser usado para uma tela de inibidor de quinase em pequena escala. Este protocolo viável pode ser dimensionado-up para executar telas maiores, o que sem dúvida irão identificar novos reguladores da via de hipopótamo.

O LATS-BS foi cotransfected com genes diferentes para avaliar seu efeito sobre a atividade de LATS (Figura 3). Neste experimento, Renilla foi usado como um controle interno. A expressão transiente de YAP-5SA, uma forma ativa constitutiva de YAP, causas de aumento dos níveis de YAP alvos transcricionais e um subsequente aumento na atividade da quinase LATS através de um percurso de gabarito estabelecido25. MST, o ativador do...

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Monitoring Hippo Signaling Pathway Activity Using a Luciferase-based Large Tumor Suppressor LATS Biosensor

Aqui nós apresentamos um biossensor baseado em luciferase para quantificar a atividade da quinase do supressor do tumor grande (LATS)-uma quinase central no Hippo via de sinalização. Este biosensor tem diversas aplicações na pesquisa básica e translacional, visa investigar hipopótamo via reguladores in vitro e em vivo.

Monitoramento de hipopótamo, sinalizando o Pathway atividade usando um Tumor grande baseado em Luciferase supressor (LATS) Biosensor

The Hippo signaling pathway is a conserved regulator of organ size and has important roles in the development and cancer biology. Due to technical ...

Meu laboratório tem estudado o papel do caminho de Hipopótamo no câncer de mama e pulmão, e recentemente, desenvolvemos um novo biosensor para monitorar a atividade de sinalização de Hipopótamo. Este método pode ser usado para responder a perguntas-chave sobre redes de sinalização celular, como como a via hipopótamo responde a fatores e como interage com outras vias de sinalização. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes é sua grande sensibilidade e também o grande número de amostras pode ser processado de forma rápida e simultânea.Esta técnica possui diversas aplicações em pesquisas básicas e translacionais para investigar os reguladores da via de sinalização hipopótamo tanto in vitro quanto in vivo. Para começar, mini-prep LATS-BS plasmids frescos da cultura líquida de bactérias DH5-Alpha. Uma hora antes da transfecção, aspire o meio da placa e adicione 500 microliters de meio de crescimento a cada poço.Um ponto importante é que o biosensor LATS deve ser preparado fresco para obter a máxima expressão e atividade. Além disso, recomenda-se sempre usar um regulador upstream da via hipopótamo, como o MSD, como um controle positivo na realização de ensaios de luciferase. Depois disso, devolva as células à incubadora.Em seguida, prepare a solução A, uma solução de DNA e a solução B, um reagente de transfecção à base de polímero diluído, conforme descrito no protocolo de texto. Depois disso, adicione imediatamente a solução B à solução A, e gentilmente pipeta para cima e para baixo para misturar. Incubar a amostra à temperatura ambiente por 15 minutos para permitir que os complexos de transfecção se formem.Em seguida, adicione o volume total de peles de transfecção em termos de gota a cada poço da placa com redemoinho suave. Incubar as células durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, remova a mídia de transfecção e substitua-a por uma nova mídia completa.Em seguida, cultura as células a 37 graus Celsius por mais um dia. Diluir uma quantidade apropriada de 5x Tampão de lise passiva com água destilada. Então, aspire completamente a mídia da placa.Adicione um mililitro de PBS a cada poço, e gire a placa suavemente para remover células separadas e mídia de crescimento residual. Em seguida, aspire completamente o PBS. Em seguida, adicione 250 microliters de 1xPLB a cada poço.Coloque a placa de cultura em uma plataforma de balanço por 15 minutos para garantir a cobertura uniforme da monocamada celular com PLB. Depois disso, transfira o lysate para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Remova o LAR-2 do armazenamento de 80 graus Celsius e equilibre-o à temperatura ambiente.Em seguida, prepare o reagente de detecção de Renilla para uma quantidade apropriada de ensaios. Adicione o reagente de detecção de Renilla ao substrato de 50x e ao seu buffer. Em seguida, distribua 10 microliters de cada célula lysate em tubos de 1,5 mililitro.Em seguida, programe um luminômetro para realizar um atraso de dois segundos antes da medição, seguido de um período de medição de 10 segundos. Cuidadosamente, transfira 20 microliters de reagente LAR-2 em um tubo, e rapidamente pipeta para cima e para baixo para misturar. Em seguida, coloque imediatamente o tubo no luminômetro e inicie a leitura.Após a leitura, remova o tubo de amostra do luminômetro, adicione 20 microliters de reagente Renilla e pipeta para cima e para baixo para misturar. Em seguida, coloque a amostra no luminômetro e inicie a próxima leitura. Primeiro, cultura, desprendimento, contagem e placa HEK293 Células-Ad como descrito no protocolo de texto.Em seguida, uma hora antes da transfecção, aspire a mídia da placa e substitua-a por cinco mililitros de mídia de crescimento completa fresca. Por fim, adicione a solução diluída B à solução A e a pipeta para cima e para baixo para misturar. Em seguida, incubar a amostra à temperatura ambiente por 15 minutos antes de adicionar o volume total dos complexos de transfecção à placa, enquanto gira suavemente.Incubar as células durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, tentepsinizar e contar as células. Placa 10.000 a 20.000 células em cada poço de uma placa de 96 poços em um volume total de 100 microliters de mídia por poço.Depois disso, incubar as células por mais um dia. Uma a quatro horas antes de realizar o ensaio de luciferase, adicione agentes potencialmente regulando a via hipopótamo, em uma concentração final de 10 micromolar por poço. Em seguida, aspire a mídia completamente das células e lave as células em cada poço com 100 microliters de PBS.Em seguida, adicione 20 microliters de PLB a cada poço. Coloque a placa de cultura em uma plataforma de balanço por 15 minutos. Em seguida, transfira 20 microliters de reagente LAR-2 para cada poço da placa, e pipeta para cima e para baixo para misturar.Imediatamente depois disso, coloque a placa em um luminômetro de leitura de placas e inicie a leitura. Na primeira parte deste protocolo, o LATS-BS foi cotransfectado com diferentes genes para avaliar seu efeito na atividade de quinase LATS. No segundo protocolo, LATS-BS foi transfeinado em HEK293-Ad, e as células foram passadas para placas de 96 poços.40 horas após a transfecção, as células foram tratadas com diferentes reguladores de pequenas moléculas conhecidas da sinalização de Hipopótamo, seguidos por um ensaio de luciferase. Ao interpretar os resultados desses ensaios, deve-se notar que proteínas e tratamentos medicamentosos podem ativar caminhos de feedback que influenciam a atividade biosensora. Outros experimentos serão necessários para confirmar uma relação entre o candidato e o caminho de sinalização do Hipopótamo.Após este procedimento, outros métodos como PCR quantitativo em tempo real, ou Western Blot, podem ser usados para responder a perguntas adicionais sobre a atividade de quinase LATS. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores do campo da biologia do câncer explorarem a dinâmica e a atividade da quinase LATS e do caminho de sinalização de Hipopótamo em muitos processos biológicos e bioquímicos. Não se esqueça que os medicamentos para triagem podem ser extremamente perigosos, e as precauções apropriadas devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Monitoring Hippo Signaling Pathway Activity Using a Luciferase-based Large Tumor Suppressor (LATS) Biosensor

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

Um modelo de tumor de murino de bexiga ortotópico e Tumor Detection System

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

Pesquisa do câncer

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

Caracterização de células tumorais, usando um fio de médico para a captura de células tumorais de circulação: uma abordagem 3D baseado no DNA peixe e imunofluorescência

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

Live Cell Imaging of the TGF-	&beta;/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

Live Cell Imaging of the TGF-	ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

Viver a imagem latente da pilha do TGF-β/Smad3 sinalização Pathway In Vitro e In Vivo usando um sistema de repórter de adenovírus

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Ensaio de reação em cadeia de polimerase digital para a variação genética em paciente esporádicos polipose adenomatosa familiar usando o formato de microplaqueta-em-um-tubo

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

Investigação de dependências genéticas utilizando ensaios de competição baseados em CRISPR-Cas9

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Longitudinal de morfológicas e fisiológicas, monitoramento de esferoides Tumor tridimensional usando a tomografia de coerência óptica

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish

Prever em cargas entrega Vivo usando uma Tumor-barreira sangue-cérebro em um prato

Highly selective by nature, the blood-brain barrier (BBB) is essential for the brain homeostasis in physiological conditions. However, in the context of ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Deteção e monitoração do ADN de circulação associado do tumor em Biofluids pacientes

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

Caracterizar Mutants relacionados à doença da família da RAF kinases usando um conjunto de métodos práticos e viáveis

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

Identificação de reguladores de fatores de transcrição usando triagem de média-duração de bibliotecas arrayed e um repórter baseado em dupla-luciferase

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...