Name: inducible and reversible dominant-negative (dn) protein inhibition
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition at JoVE.com

PCS2 + سي بي-Myc6 ناقل كان هدية من هورويتز مارشال (جامعة واشنطن، سياتل، واشنطن، الولايات المتحدة الأمريكية). وقدمت الخلايا هيي-OC1 يرجى فيدريكو كالينيك (ديفيد جيفن كلية الطب، جامعة كاليفورنيا، لوس أنجلس، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). قدم الدعم التقني نبراسكا الماوس الجينوم الهندسية الأساسية (C.B. غورومورثي، دون أضرار، ذلك رولين) وكريتون جامعة متكاملة الطبية التصوير مرفق (هالوورث ريتشارد، جون بليمير). هندسة الجينوم الماوس في نبراسكا أيده "جائزة التنمية المؤسسية" (فكرة) من المعاهد الوطنية للصحة/نيجمس، منح رقم P20 GM103471. وأيد مدرسة جامعة كريتون الطب ومنح GM103427 و GM110768 من المعاهد الوطنية للصحة/نيجمس "مرفق التصوير الطبية المتكاملة". المرفق شيد بدعم من المنح المقدمة من المركز الوطني "بحوث الموارد" (RR016469) ونيجمس (GM103427). وأبقى على خطوط الماوس التي تم إنشاؤها في هذه الدراسة في جامعة كريتون "مرفق الموارد الحيوانية"، البنية التحتية التي تحسنت بفضل منحة من المعاهد الوطنية للصحة/نكرر G20RR024001. هذا العمل تلقت في الماضي الدعم عن طريق المعاهد الوطنية للصحة/نكر 5P20RR018788-/المعاهد الوطنية للصحة/نيجمس 8P20GM103471 نحاس منح (شلي د. سميث)، والمعاهد الوطنية للصحة/عرب R21OD019745-01A1 (س-س)، وناشئة بحث منحة من "مؤسسة الصحة استماع" (ترانج س.). محتوى هذا البحث هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية "المعاهد الوطنية للصحة".

جيل من الماوس كبرب المعدلة وراثيا ورعاية الحيوان والتجارب المرتبطة بالدراسة كانت يقوم بمبادئها التوجيهية ووافقت عليه "جامعة كريتون، الرعاية المؤسسية على الحيوان" واستخدام اللجنة (إياكوك).
1-المعدلة وراثيا CB-حركة6-بناء Rb1
ملاحظة: تم استنساخ كبرب ...

<ol>
	<li>Li, F. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+MyoD+homodimer+formation+demonstrated+by+a+general+method+of+dominant+negative+mutation+employing+fusion+with+a+lysosomal+protease.">Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease.</a> Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).</li><li>Tarang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+retinoblastoma+(rb)1-inducible+dominant-negative+(DN)+mouse+model.">Generation of a retinoblastoma (rb)1-inducible dominant-negative (DN) mouse model.</a> Frontiers Cellular Neuroscience. 9 (52), (2015).</li><li>Kominami, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+selective+role+of+cathepsins+B+and+D+in+the+lysosomal+degradation+of+endogenous+and+exogenous+proteins.">The selective role of cathepsins B and D in the lysosomal degradation of endogenous and exogenous proteins.</a> FEBS Letters. 287 (1-2), 189-192 (1991).</li><li>Cortellino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+ciliogenesis,+embryonic+lethality+and+severe+impairment+of+the+sonic+hedgehog+pathway+caused+by+inactivation+of+the+mouse+complex+A+intraflagellar+transport+gene+Ift122/Wdr10,+partially+overlapping+with+the+DNA+repair+gene+Med1/Mbd4.">Defective ciliogenesis, embryonic lethality and severe impairment of the sonic hedgehog pathway caused by inactivation of the mouse complex A intraflagellar transport gene Ift122/Wdr10, partially overlapping with the DNA repair gene Med1/Mbd4.</a> Developmental Biology. 325 (1), 225-237 (2009).</li><li>Ferreira, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+embryonic+lethality+of+H+ferritin+gene+deletion+in+mice.">Early embryonic lethality of H ferritin gene deletion in mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3021-3024 (2000).</li><li>Lee, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+deficient+for+rb+are+nonviable+and+show+defects+in+neurogenesis+and+haematopoiesis.">Mice deficient for rb are nonviable and show defects in neurogenesis and haematopoiesis.</a> Nature. 359 (6393), 288-294 (1992).</li><li>Turlo, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+cre-mediated+recombination+in+mice+does+not+result+in+protein+loss.">When cre-mediated recombination in mice does not result in protein loss.</a> Genetics. 186 (3), 959-967 (2010).</li><li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+cell-cycle+reentry+and+cell+death+after+acute+inactivation+of+the+retinoblastoma+gene+product+in+postnatal+cochlear+hair+cells.">Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+knockout+mouse+model+of+retinoblastoma.">The first knockout mouse model of retinoblastoma.</a> Cell Cycle. 3 (7), 952-959 (2004).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletions+of+retinoblastoma+1+(Rb1)+and+its+repressing+target+S+phase+kinase-associated+protein+2+(Skp2)+are+synthetic+lethal+in+mouse+embryogenesis.">Deletions of retinoblastoma 1 (Rb1) and its repressing target S phase kinase-associated protein 2 (Skp2) are synthetic lethal in mouse embryogenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10201-10209 (2016).</li><li>Yamasaki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+E2F-1+reduces+tumorigenesis+and+extends+the+lifespan+of+Rb1(+/-)+mice.">Loss of E2F-1 reduces tumorigenesis and extends the lifespan of Rb1(+/-) mice.</a> Nature Genetics. 18 (4), 360-364 (1998).</li><li>Li, F. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+a+dominant+negative+retinoblastoma+protein+(RB)+inhibiting+satellite+myoblast+differentiation+implies+an+indirect+interaction+between+MyoD+and+RB.">Selection of a dominant negative retinoblastoma protein (RB) inhibiting satellite myoblast differentiation implies an indirect interaction between MyoD and RB.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5129-5139 (2000).</li><li>Pitkanen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+human+retinoblastoma+gene+product+in+mouse+fibroblasts:+Effects+on+cell+proliferation+and+susceptibility+to+transformation.">Expression of the human retinoblastoma gene product in mouse fibroblasts: Effects on cell proliferation and susceptibility to transformation.</a> Experimental Cell Research. 207 (1), 99-106 (1993).</li><li>Chano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+abundance+of+RB1CC1+contributes+to+the+non-proliferating+enlarged+cell+phenotype+through+both+RB1+maintenance+and+TSC1+degradation.">Neuromuscular abundance of RB1CC1 contributes to the non-proliferating enlarged cell phenotype through both RB1 maintenance and TSC1 degradation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 18 (3), 425-432 (2006).</li><li>Kole, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+therapeutics:+Beyond+RNA+interference+and+antisense+oligonucleotides.">RNA therapeutics: Beyond RNA interference and antisense oligonucleotides.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 11 (2), 125-140 (2012).</li><li>Yamamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ons+and+offs+of+inducible+transgenic+technology:+A+review.">The ons and offs of inducible transgenic technology: A review.</a> Neurobiology of Disease. 8 (6), 923-932 (2001).</li><li>Houdebine, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+animal+models+in+biomedical+research.">Transgenic animal models in biomedical research.</a> Methods in Molecular Biology. 360, 163-202 (2007).</li><li>Brehm, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoblastoma+protein+recruits+histone+deacetylase+to+repress+transcription.">Retinoblastoma protein recruits histone deacetylase to repress transcription.</a> Nature. 391 (6667), 597-601 (1998).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E2F-HDAC+complexes+negatively+regulate+the+tumor+suppressor+gene+ARHI+in+breast+cancer.">E2F-HDAC complexes negatively regulate the tumor suppressor gene ARHI in breast cancer.</a> Oncogene. 25 (2), 230-239 (2006).</li><li>Magnaghi-Jaulin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoblastoma+protein+represses+transcription+by+recruiting+a+histone+deacetylase.">Retinoblastoma protein represses transcription by recruiting a histone deacetylase.</a> Nature. 391 (6667), 601-605 (1998).</li></ol>

للتحايل على القيود المرتبطة بالاستراتيجيات التقليدية المعدلة وراثيا، سعينا إلى إنشاء نموذج ماوس التي البوي ذاتية يمكن تكون إفراجاً مشروطاً معطل قبل overexpressing نموذج DN المسخ منه بطريقة الزمانية المكانية. إلغاء الوظيفة من النقاط المهمة الذاتية، كان العديد من الخيارات المقترحة15</sup...

معظم النهج الرامية إلى أبلاتيونس الجينات والبروتين تعتمد على العمليات الدائمة، التي تؤدي عموما إلى القضاء التام على أو اقتطاع الجينات، وتسلسل الحمض النووي الريبي أو البروتين من الاهتمام (POI). والهدف العام لهذا الأسلوب مهندس بروتين المؤتلف بإلغاء وظيفة البروتين الذاتية، والبرية من نوع. قمنا بإعادة النظر وتجديده استراتيجية بديلة1،2، والذي يسمح للاجتثاث المؤقتة البوي عن طريق تثبيط DN. هذا الأسلوب يعمل لكل من مولتيميريك والببتيدات أحادي ولكن هو الأنسب للبروتينات التي تعمل في جمعية مولتيميريك.
الأسلوب الذي يتكون من الصمامات حوزتي الليزوزومية CB لوحدة فرعية من مولتيميريك البوي (CB الانصهار المعقدة). الانصهار CB الناتجة معقدة يمكن أن تتفاعل مع وبروتيوليتيكالي هضم البروتين الذاتية أو تحويل المجمع بأكمله البوي CB إلى يحلول أن يكون المتدهورة3. وعلاوة على ذلك، مزيج من الانصهار CB المعقدة مع الطابع إيندوسيبلي لنظام التنشيط النسخي تسيطر عليها التتراسيكلين (تيتو) يسمح لتعبير إيندوسيبلي والتي تسيطر عليها من التحوير في أزياء عكسها2. على الرغم من أن مفيد في العديد من الحالات، يمكن أن يؤدي الحذف الكامل للجينات أو البروتينات المجراة في الفتك4،،من56. وبالمثل، الحذف الخاصة بالانسجة، والشرطي لبعض الجينات أو البروتينات باستخدام نظام لوكس Cre/قد لا تكون واضحة، كما أنه، في نهاية المطاف، سيؤدي إلى خسارة دائمة للعناصر الجينية الحاسمة7. ولذلك، اعتماداً على الجينات أو البوي، أيا من هذه النهج سيكون من فعالية في تقدم نموذجا مفيداً للدراسات اللاحقة، لا سيما الجينات أو البروتينات الدراسات الفنية في الفئران بعد الولادة والكبار أواخر.
للالتفاف على المشاكل المرتبطة بهذه النهج وتقديم إثبات لمبدأ فعالية الطريقة المقترحة، اخترنا لاختبار الأسلوب الذي قدمه هنا توليد نسخة DN شرطي من البروتين الشبكية 1 (RB1). وكانت العديد من الخيارات المقترحة8،،من910 إلى إلغاء وظيفة RB1 الذاتية؛ لكن كل منهم تواجه بعض القيود نفسها المذكورة أعلاه: حذف الخط الدائم RB1 شأن الفتاكة، والحذف الشرطي RB1 تمشيا مع دورها القامع الورم، دائم يؤدي إلى مجموعة متنوعة من الأورام11. على الرغم من أن إصدار DN من RB1 لا يبدو أن يحدث بطبيعة الحال، أفضل بديل للاستراتيجيات المتاحة حاليا ينبغي أن تسمح المنظمة التي تسيطر عليها وقتيا من RB1 الذاتية وتوفير إليه بديلة في نهاية المطاف إعادة لها الدالة. ووصفت أساسا لتركيبة من هذا القبيل منذ أكثر من عقدين من الزمان1. ومع ذلك، بسبب القيود التكنولوجية، أنها تفتقر إلى إليه لمراقبة التحوير التنشيط واستجابة، وخصوصية النسيج. وهذه الدراسة هي الأول من الجمع بين أناقة الدوكسي (دوكس)-يعتمد النظام النسخي مع مقولة أساسية المعدلة وراثيا هندسيا من بروتينات سي بي و Rb1 البروتياز الليزوزومية. نموذج كبرب الناتجة على الماوس يسمح RB1 دوكس بوساطة مؤقتاً ينظم البند2. وميزة استخدام هذا نهج القائم على البروتين لدراسة وظيفة الجينات أن يتم اعتماده للجينات أي اهتمام، مع الحد الأدنى من المعلومات عن نشاطه.
الاستراتيجية المقترحة للتحوير DN يوفر مزايا عديدة أكثر من النهج التقليدي. أولاً، يؤدي تثبيط البروتين DN إلى إلا الاستئصال الجزئي في نشاط البروتين، وبالتالي الحفاظ على تعبير ذاتية متبقية. هذه نتيجة مرغوب فيه للغاية في الحالات التي يؤدي فيها القضاء تام على نشاط البروتين إلى الفتك الجنينية، تحد إلى حد كبير أي تحقيق لدراسة وظيفة الجينات في ماوس حية. ثانيا، وجود نظام تيتو تمكين التنشيط التحوير إلا بوجود المضادات الحيوية، مما يسمح لعنصر الكفاءة و عكسها على نشاط التحوير. وهكذا، بالتوقف الصادات، يمكن إلغاء تنشيط النظام المحورة وراثيا، وتعبير RB1 عادي مرة أخرى في المكان. ثالثا، يمكن أن تختلف خصوصية التعبير التحوير اعتماداً على المروج للاختيار. في حين أننا اخترنا المروج روزا-المساعدة النقدية في كل مكان للإثبات للمبدأ، وضع التحوير تحت مروج الأنسجة على حدة من المرجح أن تقييد التعبير التحوير غير المرغوب فيها وتسهيل الدراسات المتعلقة بتطبيق هذا التحوير العلاجية منهجية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:768px;" width="769">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:255px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium, DMEM</td>
			<td style="width:228px;">GIBCO-BRL</td>
			<td style="width:119px;">11965-084</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Minimum Essential Medium Eagle, MEME&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">M8042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F2442&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Lipofectamine&#160;</td>
			<td style="width:228px;">DharmaFECT</td>
			<td style="width:119px;">T-2010-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Sal I</td>
			<td style="width:228px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11745622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">EcoRV-HF</td>
			<td style="width:228px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R3195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">NotI</td>
			<td style="width:228px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">13090730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CaspaTag&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">APT523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">DAPI</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Staurosporine</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CyQuant NF cell proliferation kit&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C35007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Retinoblastoma 1 antibody</td>
			<td style="width:228px;">Abcam</td>
			<td>Ab6075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">c-Myc antibody</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td>M5546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">b-actin</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td>A5316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ki-67&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">MA5-14520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Phallodin</td>
			<td style="width:228px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence microplate reader</td>
			<td style="width:228px;">FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Epifluorescence microscope&#160;</td>
			<td style="width:228px;">NikonEclipse80i</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:601px;">The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011.&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducible and reversible dominant-negative (dn) protein inhibition

تثبيط البروتين (DN) سالب المهيمن هو وسيلة قوية التعامل مع وظيفة البروتين ويوفر مزايا عديدة أكثر من غيرها من النهج القائم على الجينوم. على سبيل المثال، على الرغم من أن تشيميريك و لوكسب Cre استراتيجيات الاستهداف وقد استخدمت على نطاق واسع، القيود المتأصلة من هذه الاستراتيجيات (أي نشاط المروج راشح، فسيفساء Cre التعبير، إلخ) قيدت إلى حد كبير على التطبيق. وعلاوة على ذلك، حذف كامل للعديد من الجينات الذاتية شأن الفتاكة، مما يجعل من المستحيل على دراسة وظيفة الجينات في الحياة بعد الولادة. ولمعالجة هذه التحديات، تغييرات كبيرة في وضع بروتوكول هندسة الوراثية مبكرة ومقترنا حوزتي الليزوزومية نسخة (المعدلة وراثيا) قصيرة من الجينات Rb1 بروكاثيبسين ب (CB)، لإنشاء نموذج ماوس DN من Rb1 (كبرب). بسبب وجود حوزتي الليزوزومية، يتم توجيه البروتين الانصهار CB-RB1 كامل وبه مجمع المتفاعلة للتدهور بوساطة بروتوزوم. وعلاوة على ذلك، يتيح وجود عنصر محفز (رتا) التتراسيكلين في البناء المعدلة وراثيا لائحة إيندوسيبلي وعكسها للبروتين RB1. وجود مروج روزا-المساعدة النقدية في كل مكان في طراز الماوس كبرب يجعلها أداة مفيدة القيام بالاستئصال الجيني Rb1 عابرة وعكسها وتزويد الباحثين موارد لفهم نشاطها في تقريبا أي نوع من الخلايا حيث يتم التعبير عن RB1.

وبصفة عامة، تصميم طفرة DN يتطلب قدرا كبيرا من المعلومات عن هيكل ووظيفة نقطة مهمة. وفي المقابل، DN الاستراتيجية المعروضة هنا مفيدة بشكل خاص عندما تكون المعلومات الهيكلية والوظيفية لنقطة مهمة محدودة. إذا كانت نقطة مهمة بروتين مولتيميريك، انصهار فرعية واحدة إلى حوزتي الليزو...

Watch this Scientific Journal Video about Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition at JoVE.com

Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition

نقدم هنا بروتوكولا لتطوير نظام إيندوسيبلي السلبية السائدة، التي أي بروتين يمكن يكون إفراجاً مشروطاً معطل عكسية overexpressing نسخة متحولة السلبية المهيمنة.

تثبيط البروتين إيندوسيبلي وعكسها المهيمنة سالب (DN)

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجموعة واسعة من المجالات التي تتطلب تعطيلًا مشروطًا وعابرًا لجين من الاهتمامات من خلال الإفراط في التعبير عن نسخة سلبية مهيمنة منه. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها لا تسمح إلا بالاستئصال الجزئي في نشاط البروتين ، وبالتالي الحفاظ على تعبير داخلي متبقي. على الرغم من أن، هنا وصفنا لتكف عن حالة بروتين RB، الذي يعمل في الجمعية متعددة اميرك، يمكن أيضا تطبيق هذه المنهجية على البروتينات أحادية الهجاء.سوف أوميش بياكوريل، techinician المختبر لدينا ومؤلف مشارك في المخطوطة إظهار الإجراءات. للبدء، تنمو خلايا NIH3T3، بعد مواصفات البائع، في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون، وذلك باستخدام المتوسطة ثقافة الخلية الموصى بها التي تحتوي على مصل الأبقار الجنين 10٪. cotransfect الخلايا باستخدام pTet-Splice وpCMV-Tet3G ناقلات, خلط أول اثنين إلى أربعة microliters من مبيد transfection القائم على الدهون في البئر, وميليلتر واحد من DMEM غير مكتملة لكل بئر في أنبوب 15 ملليلتر, واحتضان لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.إضافة اثنين إلى ثلاثة ميكروغرام من الحمض النووي البلازما في بئر لهذا المزيج DMEM مُشفر إعادة الإرسال. اخلطي و احتضني لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إضافة ملليلتر واحد من المزيج الذي يحتوي على الحمض النووي ومعشف transfection في DMEM إلى كل بئر من ستة بئر لوحة مع خلايا NIH3T3.بعد ثلاث إلى أربع ساعات من الحضانة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون، إضافة ملليلتر واحد من المتوسط الكامل. ثم، إضافة 2 ميكرولترات من الأسهم دوكسيسيكلين إلى كل بئر ووضع علامة على لوحة كما زائد doxycycline. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.لتقييم وظيفة TetO-DN-CB-myc6-Rb1 في تعزيز انتشار الخلايا غير المجدولة، والخلايا HEI-OC1 الثقافة في DMEM التي تحتوي على 10٪ FBS، في ظل ظروف التساهل. بالنسبة لدراسات انتشار الخلايا، عد خلايا HEI-OC1 باستخدام عداد الخلايا. لوحة 10، 000 خلايا HEI-OC1 في بئر على لوحة 96-well في 200 ميكرولترات الحجم لكل منها.احتضان الخلايا على مدى الليل في 33 درجة مئوية مع 5٪ CO2. للحث على التعبير transgene، إضافة ميكروغرام واحد لكل ملليلتر من doxycycline إلى مجموعة فرعية من الخلايا الحاملة للعدوى- OC1. استخدم المجموعة الفرعية الأخرى المسماة باسم ناقص دوكسيسيكلين وخلايا HEI-OC1 غير الحاملة للعدوى كضوابط، وحضن الخلايا كـ 33 درجة مئوية مع 10٪ CO2.لتقييم انتشار الخلايا، بعد 48 ساعة من نقل الدم، إزالة خلية ثقافة المتوسطة وإضافة 100 ميكرولترات من 1x صبغة ملزمة الحل من طقم انتشار الخلايا إلى كل بئر من لوحة صغيرة. اتبع بروتوكول الشركة المصنعة واحتضان لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية. استخدم قارئ الفلورسينت الصغير لقياس شدة الفلورنس لكل عينة.لمزيد من تقييم انتشار الخلايا باستخدام الكيمياء المناعية، لوحة خلايا HEI-OC1 على غطاء الزجاج وضعت في كل بئر من 12-بئر لوحة في DMEM. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 33 درجة مئوية. في اليوم التالي، cotransfect إلى الخلايا في بئرين مع pTet-Splice وناقلات pCMV-Tet3G، ومن ثم تنفيذ العلاج دوكسيسيكلين على واحد بشكل جيد كما فعلت مع الخلايا NIH3T3.استخدام واحد غير نقل أيضاً كما عنصر تحكم. لمعالجة الخلايا لوضع العلامات كي 67، وإصلاحها مع 4٪ شبهformaldehyde في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، يغسل لهم ثلاث مرات مع الجليد البارد برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق لكل منهما.إضافة 0.25٪ المنظفات غير المؤينة في برنامج تلفزيوني، واحتضان لمدة 10 دقائق. كرر غسل ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق لكل من. استخدام مصل 10٪لمنع الخلايا.في غرفة مرطبة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. إضافة 500 ميكرولترات من الأجسام المضادة الابتدائية كي-67 واحتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. غسل الخلايا مرة أخرى ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق لكل من.أضف ملليلتر واحد من الأجسام المضادة الثانوية واحتضان الخلايا لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. بعد إزالة حل الأجسام المضادة الثانوية، وغسل الخلايا مرة أخرى ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في برنامج تلفزيوني في الظلام. لتسمية خلايا HEI-OC1 مع phalloidin، احتضان لهم في 1:200 phalloidin لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.لتسمية نواة الخلية، احتضان الخلايا بخمس ميكروغرام لكل ملليلتر من DAPI لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد تسليم الفئران transgene، genotype الجراء باستخدام مجموعة التمهيدي محددة لمنطقة الانصهار CBRb1 كما هو موضح في المخطوطة. تولد الكبار TetO-DN-CB-myc6-Rb1 الفئران إلى ROSA-CAG-RTTA وخط تحريض tetrecycline لتوليد الفئران DN-CBRb التجريبية، وgenotype ذريتهم كما هو موضح في المخطوطة.NIH3T3 لا يعبر عن البروتين RB1 الذاتية، وبالتالي فإن التعبير RB1 قوية ينظر هنا هو بسبب تحريض transgene في وجود دوكس، ولكن ليس في غيابها، مما يؤكد تفعيل كفاءة من TetO-DN-CB-myc6-RB1 مزيج RB1 بناء. في المقابل، تحتوي خلايا HEK293 على تعبير RB1 داخلي. إضافة doxycycline أدى إلى TetO -DN-CB-myc6-Rb1 التنشيط وR RB1 أسفل التنظيم.تم استئناف التعبير RB1 21 ساعة بعد إزالة doxycycline من الوسائط. خلايا HEI-OC1 cotransfected مع نفس النواقل، وعرض زيادة متواضعة ولكن كبيرة في عدد الخلايا تتبع العلاج doxycycline مقارنة مع الخلايا المصابة لا تعامل مع دوكسيسيكلين، والخلايا غير المنقولة. وأكد التهجين الفلوري في الموقع الإدراج الجينومي لـ TetO-DN-CB-myc6-RB1 transgene في الفئران.كانت هناك زيادة أولية في مجموع التعبير البروتين RB1 في قوقعة الفئران المعدلة وراثيا تعامل مع دوكسيسيكلين لمدة ثلاثة أيام بالمقارنة مع مجموعة التحكم. ومع ذلك، في المجموعات تعامل مع دوكسوسيكلين لمدة سبعة و 10 أيام، لوحظ انخفاض كبير في التعبير RB1. بغض النظر عن الأنسجة التي تم تحليلها ، لوحظ انخفاض كبير في بروتين RB1 في الفئران المعدلة وراثيا تعامل مع دوكسوسيكلين ، ولكن ليس في مجموعة التحكم ، مما يؤكد كفاءة بناء TetO-DN-CB-myc6-RB1.أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم التحقق من أن كل عنصر من عناصر الترميز في transgene في الإطار مع بعضها البعض. إذا كانت مناطق الترميز من Cathepsin B والورم الأرومي الشبكي الموصوف في هذا التقرير ، عن طريق الصدفة ، متصلة خارج الإطار ، فإنها لن تسفر عن بروتين الانصهار المقصود. وهكذا، يجب التحقق من تسلسل الحمض النووي قبل حقن transgene في الأجنة الماوس وحيد الخلية.بعد هذا الإجراء، يمكن استبدال المروج CAG في كل مكان مع المروجين محددة من أجل دراسة وظيفة الجينات بطريقة محددة الخلية.

Research

JoVE Journal

Genetics

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

مستحلب T7 الحمض النووي الريبي البلمرة بوساطة مولتيجين نظام التعبير، بمغس

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

جيل من الإنشطار بروتين فلوري في<em&gt; المبيضات</em&gt; الأنواع

Candida species, prevalent colonizers of the intestinal and genitourinary tracts, are the cause of the majority of invasive fungal infections in humans. ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

السيطرة التعبير قناة ايون من خلال ترنسفكأيشن عابر محرض

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection كريسبر/Cas9 البروتين في أجنة سمك السلور القناة، Ictalurus punctatus، لتحرير الجينات

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

نظم التأسيسي وإيندوسيبلي للتعديل الوراثي في فيفو من خلايا الكبد الماوس باستخدام حقن الوريد ذيل هيدرودينامية

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

تحديد الأحداث جزئ مثلى في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس باستخدام النشاف الجنوبي وتفاعل البوليميراز المتسلسل

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

إيندوسيبلي، الخلية المحددة بنوع التعبير في نبات التمويل "عن طريق لحجر" بوساطة ترانس-التنشيط

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

تحليلات البروتيوميات الجماعي القائم على قياس الطيف الكتلي باستخدام قاعدة البيانات أوبينبروت لكشف النقاب عن البروتينات رواية مترجمة من إطارات القراءة المفتوحة غير متعارف عليه

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

اختبار لتحديد كمية البروتين-RNA الربط في البكتيريا

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

في المختبر الاختبارات البيوكيميائية باستخدام تسميات البيوتين لدراسة تفاعلات البروتين والحمض النووي

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...