Name: inducible and reversible dominant-negative (dn) protein inhibition
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition at JoVE.com

pCS2+CB-myc6 向量是马歇尔·霍维茨 (华盛顿大学, 西雅图, 美国) 的礼物。hei-oc1 细胞由 fedrico kalinec (david geffen 医学院, ucla, los angeles, ca, usa) 提供。地雷行动中心小鼠基因组工程核心 (c. b. gurumurthy, don harms, rolen quadros) 和 creighton 大学生物医学综合成像设施 (richard hallworth, john billheimer) 提供了技术支持。m科员部队小鼠基因组工程得到了 NIH/NIGMS 颁发的机构发展奖 (ida) 的支持, 该奖项编号为 p20 GM103471。综合生物医学成像设施得到了克雷顿大学医学院的支持, 并从 nih/iggms 获得了 gm103427 和 gm110768。该设施是在国家研究资源中心 (rr016469) 和 nigms (gm103427) 的赠款支持下建造的。这项研究中产生的老鼠线维持在克里顿大学的动物资源设施, 该基金的基础设施通过 nihx/ncrr g20r024001 的赠款得到改善。这项工作得到了过去的支持, 得到了 nihxcr 5p20r01888-nhhmnigms 8p20gm103471 cobre 赠款 (向 shelley d. 史密斯)、nih/orip r21od01975-01a1 (s. m. r.-s.) 和听力健康基金会 (至 s. tarang) 的一笔新兴研究赠款。这项研究的内容完全是作者的责任, 不一定代表国家卫生研究院的官方观点。

转基因 cbrb 小鼠的生成以及与这项研究相关的所有动物护理和实验都得到了克雷顿大学机构动物护理和使用委员会 (iacuc) 的批准, 并由他们的指南进行。
1. 转基因 cb-myc 6-rb1 构建
请注意:cbrb 在多步骤过程中克隆为 pet _ splice 载体 (图 1 a 和1 b)。
<ol><li>
执行第一阶段克隆到 pCS2+CB-myc6 载体。</stro...

<ol>
	<li>Li, F. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+MyoD+homodimer+formation+demonstrated+by+a+general+method+of+dominant+negative+mutation+employing+fusion+with+a+lysosomal+protease.">Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease.</a> Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).</li><li>Tarang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+retinoblastoma+(rb)1-inducible+dominant-negative+(DN)+mouse+model.">Generation of a retinoblastoma (rb)1-inducible dominant-negative (DN) mouse model.</a> Frontiers Cellular Neuroscience. 9 (52), (2015).</li><li>Kominami, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+selective+role+of+cathepsins+B+and+D+in+the+lysosomal+degradation+of+endogenous+and+exogenous+proteins.">The selective role of cathepsins B and D in the lysosomal degradation of endogenous and exogenous proteins.</a> FEBS Letters. 287 (1-2), 189-192 (1991).</li><li>Cortellino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+ciliogenesis,+embryonic+lethality+and+severe+impairment+of+the+sonic+hedgehog+pathway+caused+by+inactivation+of+the+mouse+complex+A+intraflagellar+transport+gene+Ift122/Wdr10,+partially+overlapping+with+the+DNA+repair+gene+Med1/Mbd4.">Defective ciliogenesis, embryonic lethality and severe impairment of the sonic hedgehog pathway caused by inactivation of the mouse complex A intraflagellar transport gene Ift122/Wdr10, partially overlapping with the DNA repair gene Med1/Mbd4.</a> Developmental Biology. 325 (1), 225-237 (2009).</li><li>Ferreira, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+embryonic+lethality+of+H+ferritin+gene+deletion+in+mice.">Early embryonic lethality of H ferritin gene deletion in mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3021-3024 (2000).</li><li>Lee, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+deficient+for+rb+are+nonviable+and+show+defects+in+neurogenesis+and+haematopoiesis.">Mice deficient for rb are nonviable and show defects in neurogenesis and haematopoiesis.</a> Nature. 359 (6393), 288-294 (1992).</li><li>Turlo, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+cre-mediated+recombination+in+mice+does+not+result+in+protein+loss.">When cre-mediated recombination in mice does not result in protein loss.</a> Genetics. 186 (3), 959-967 (2010).</li><li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+cell-cycle+reentry+and+cell+death+after+acute+inactivation+of+the+retinoblastoma+gene+product+in+postnatal+cochlear+hair+cells.">Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+knockout+mouse+model+of+retinoblastoma.">The first knockout mouse model of retinoblastoma.</a> Cell Cycle. 3 (7), 952-959 (2004).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletions+of+retinoblastoma+1+(Rb1)+and+its+repressing+target+S+phase+kinase-associated+protein+2+(Skp2)+are+synthetic+lethal+in+mouse+embryogenesis.">Deletions of retinoblastoma 1 (Rb1) and its repressing target S phase kinase-associated protein 2 (Skp2) are synthetic lethal in mouse embryogenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10201-10209 (2016).</li><li>Yamasaki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+E2F-1+reduces+tumorigenesis+and+extends+the+lifespan+of+Rb1(+/-)+mice.">Loss of E2F-1 reduces tumorigenesis and extends the lifespan of Rb1(+/-) mice.</a> Nature Genetics. 18 (4), 360-364 (1998).</li><li>Li, F. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+a+dominant+negative+retinoblastoma+protein+(RB)+inhibiting+satellite+myoblast+differentiation+implies+an+indirect+interaction+between+MyoD+and+RB.">Selection of a dominant negative retinoblastoma protein (RB) inhibiting satellite myoblast differentiation implies an indirect interaction between MyoD and RB.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5129-5139 (2000).</li><li>Pitkanen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+human+retinoblastoma+gene+product+in+mouse+fibroblasts:+Effects+on+cell+proliferation+and+susceptibility+to+transformation.">Expression of the human retinoblastoma gene product in mouse fibroblasts: Effects on cell proliferation and susceptibility to transformation.</a> Experimental Cell Research. 207 (1), 99-106 (1993).</li><li>Chano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+abundance+of+RB1CC1+contributes+to+the+non-proliferating+enlarged+cell+phenotype+through+both+RB1+maintenance+and+TSC1+degradation.">Neuromuscular abundance of RB1CC1 contributes to the non-proliferating enlarged cell phenotype through both RB1 maintenance and TSC1 degradation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 18 (3), 425-432 (2006).</li><li>Kole, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+therapeutics:+Beyond+RNA+interference+and+antisense+oligonucleotides.">RNA therapeutics: Beyond RNA interference and antisense oligonucleotides.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 11 (2), 125-140 (2012).</li><li>Yamamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ons+and+offs+of+inducible+transgenic+technology:+A+review.">The ons and offs of inducible transgenic technology: A review.</a> Neurobiology of Disease. 8 (6), 923-932 (2001).</li><li>Houdebine, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+animal+models+in+biomedical+research.">Transgenic animal models in biomedical research.</a> Methods in Molecular Biology. 360, 163-202 (2007).</li><li>Brehm, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoblastoma+protein+recruits+histone+deacetylase+to+repress+transcription.">Retinoblastoma protein recruits histone deacetylase to repress transcription.</a> Nature. 391 (6667), 597-601 (1998).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E2F-HDAC+complexes+negatively+regulate+the+tumor+suppressor+gene+ARHI+in+breast+cancer.">E2F-HDAC complexes negatively regulate the tumor suppressor gene ARHI in breast cancer.</a> Oncogene. 25 (2), 230-239 (2006).</li><li>Magnaghi-Jaulin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoblastoma+protein+represses+transcription+by+recruiting+a+histone+deacetylase.">Retinoblastoma protein represses transcription by recruiting a histone deacetylase.</a> Nature. 391 (6667), 601-605 (1998).</li></ol>

为了规避与传统转基因策略相关的限制, 我们试图生成一个鼠标模型, 在这种模型中, 内源性 poi 可以通过以时空方式过度表达 dn 突变形式来有条件地失效。为了消除内生 poi 的功能, 提出了几个备选方案15、16、17。我们已经修改了早期的遗传策略1 , 结合了 dox 依赖转录系统, 以一个简单的策略, 利用溶酶体蛋白?...

大多数针对基因和蛋白质消融的方法依赖于永久过程, 这通常会导致基因、rna 序列或感兴趣的蛋白质 (poi) 的完全消除或截断。该方法的总体目标是设计重组蛋白, 以消除内源性野生型蛋白的功能。我们重新审视并改进了替代策略1,2, 该策略允许通过 dn 抑制临时消融 poi。这种方法适用于多聚肽和单体肽, 但最适合在多聚体组装中发挥作用的蛋白质。
该方法包括将溶酶体蛋白酶 cb 融合到一个亚基的一个多聚类 poi (cb 融合复合体)。由此产生的 cb 融合复合物可以与内源蛋白相互作用并进行蛋白溶解消化, 或将整个 cb-poi 复合体转移到降解的溶酶体3。此外, cb 融合复合物与四环素控制转录激活 (teto) 系统的诱导性质相结合, 可实现可逆转方式的转基因诱导和可控表达。虽然在许多情况下有用, 但在体内完全删除基因或蛋白质会导致致死性 4,5,6。同样, 使用 cre/lox 系统对某些基因或蛋白质进行组织特异性、有条件的删除可能并不简单, 因为它最终会导致关键基因组元素7的永久丢失。因此, 根据基因或 poi 的不同, 这两种方法都不能有效地为后续研究提供有用的模型, 特别是产后后期和成年小鼠的基因或蛋白质功能研究。
为了避免与这些方法相关的问题, 并提供有关该方法有效性的原则验证, 我们选择通过生成视网膜母细胞瘤 1 (rb1) 蛋白的条件 dn 版本来测试此处提供的方法。提出了若干备选方案8、9、10, 以取消内生 rb1 的功能;然而, 他们都面临着一些相同的限制, 上面讨论: 永久的胚系删除 rb1 是胚胎上致命的, 并与它的肿瘤抑制作用, 永久 rb1 条件删除导致各种肿瘤11。尽管 rb1 的 dn 版本似乎不是自然发生的, 但对于目前可用的策略, 更好的替代方案应该允许对内生 rb1 进行时间控制的停用, 并提供一种替代机制, 最终恢复其功能。这种结构的基础在20多年前被描述了1。然而, 由于技术的局限性, 它缺乏控制转基因激活、反应和组织特异性的机制。本研究首次将多西环素 (dox) 依赖转录系统的优雅与溶酶体蛋白酶 cb 和rb1蛋白的工程转基因结构结合起来。由此产生的 cbrb 鼠标模型允许暂时调节 dox 介导的 rb1 规则2。使用这种基于蛋白质的方法来研究基因功能的好处是, 它可以用于任何感兴趣的基因, 而很少有关于其活性的信息。
与传统方法相比, 提出的 dn 转基因策略具有许多优势。首先, dn 蛋白抑制只导致蛋白质活性的部分消融, 从而保持残留的内源性表达。在完全消除蛋白质活性导致胚胎死亡的情况下, 这样的结果是非常可取的, 这极大地限制了任何研究活老鼠基因功能的研究。其次, teto 系统的存在使转基因激活只有在抗生素存在的情况下才能实现, 从而能够有效和可逆转地控制转基因活动。因此, 通过停止抗生素的管理, 转基因系统可以被停用, 正常的 rb1 表达恢复到原状。第三, 转基因表达的特异性可能因选择的启动子而异。虽然我们选择了无处不在的 rosa-cag 启动子进行原理证明, 但将转基因置于组织特异性启动子之下可能会限制不需要的转基因表达, 并有助于对这种转基因的治疗应用的研究方法。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:768px;" width="769">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:255px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium, DMEM</td>
			<td style="width:228px;">GIBCO-BRL</td>
			<td style="width:119px;">11965-084</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Minimum Essential Medium Eagle, MEME&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">M8042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F2442&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Lipofectamine&#160;</td>
			<td style="width:228px;">DharmaFECT</td>
			<td style="width:119px;">T-2010-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Sal I</td>
			<td style="width:228px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11745622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">EcoRV-HF</td>
			<td style="width:228px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R3195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">NotI</td>
			<td style="width:228px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">13090730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CaspaTag&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">APT523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">DAPI</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Staurosporine</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CyQuant NF cell proliferation kit&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C35007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Retinoblastoma 1 antibody</td>
			<td style="width:228px;">Abcam</td>
			<td>Ab6075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">c-Myc antibody</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td>M5546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">b-actin</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td>A5316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ki-67&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">MA5-14520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Phallodin</td>
			<td style="width:228px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence microplate reader</td>
			<td style="width:228px;">FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Epifluorescence microscope&#160;</td>
			<td style="width:228px;">NikonEclipse80i</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:601px;">The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011.&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducible and reversible dominant-negative (dn) protein inhibition

显性阴性 (dn) 蛋白抑制是一种强大的蛋白质功能操作方法, 与其他基于基因组的方法相比具有多种优势。例如, 尽管嵌合和Cre-LoxP靶向策略已被广泛使用, 但这些策略的内在局限性 (即泄漏启动子活性、马赛克cree 表达等) 在很大程度上限制了它们的应用。此外, 完全删除许多内源基因是胚胎致死, 因此不可能研究出生后生活中的基因功能。为了应对这些挑战, 我们对早期的基因工程协议进行了重大修改, 并将 rb1 基因的短 (转基因) 版本与溶酶体蛋白酶原酶 b (cb) 结合起来, 生成 rb1 (cbrb) 的 dn 小鼠模型。由于溶酶体蛋白酶的存在, 整个 cb-rb1 融合蛋白及其相互作用的复合蛋白被路由, 以促进蛋白酶体介导的降解。此外, 在转基因结构中存在四环素诱导剂 (rtta) 元素, 使 rtTA 蛋白具有诱导性和可逆性调节。cbrb 小鼠模型中无处不在的 rosa-cag 启动子的存在使其成为进行瞬态和可逆 rb1 基因消融的有用工具, 并为研究人员提供了一种资源, 以了解其在几乎任何表达 rb1 的细胞类型中的活性。

通常, 设计 dn 突变需要大量有关 poi 结构和功能的信息。相反, 在 poi 的结构和功能信息有限的情况下, 此处介绍的 dn 策略特别有用。如果 poi 是一种多细胞蛋白, 将一个亚基与溶酶体蛋白酶结合起来, 可以通过内源性亚基的蛋白溶解和细胞亚分流的组合, 主要抑制组装的多聚体, 并可能抑制其他配体。莫蒂默的溶酶体。为验证多克调控转基因激活的成功克隆和有效性, 将含有<...

Watch this Scientific Journal Video about Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition at JoVE.com

Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition

在这里, 我们提出了一个协议, 以开发一个显性负诱导系统, 在其中任何蛋白质可以有条件地灭活, 可逆地过度表达它的控制负极突变版本。

诱导和可逆显性阴性 (dn) 蛋白抑制

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...

此方法可以帮助回答各种领域中的关键问题，这些领域要求对感兴趣的基因进行有条件和暂时的失活，方法是可逆地过度表达其显性的负面版本。这种技术的主要优点是，它只允许在蛋白质活性中部分消融，从而保留残余的内源性表达。虽然，在这里我们描述了RB蛋白的条件灭活，在多美体组装中功能，这种方法也可以应用于单体蛋白质。乌梅什·皮亚库雷尔，我们的实验室技术员和手稿的合著者将演示这些程序。首先，使用含有10%胎儿牛血清的推荐细胞培养条件，按照供应商的规格，在37摄氏度下以5%CO2生长NIH3T3细胞。要使用 pTet-Splice 和 pCMV-Tet3G 载体对细胞进行共转接，首先将两到四微升的脂质转染试剂混合到每井，每井一毫升不完整的 DMEM 在 15 毫升管中，并在室温下孵育 5 分钟。将每井添加两到三微克的血浆DNA，加入这种转染试剂的DMEM混合物。在室温下混合并孵育20分钟。加入含有DNA和DMEM中转染试剂的混合物的一毫升，加入与NIH3T3细胞的六井板的每个井中。在37摄氏度的37摄氏度下孵育3至4个小时后，加入1毫升完整的介质。然后，在每个井中加入2微升的多氧环素库存，并将板标为加号多氧环素。用5%CO2在37摄氏度下孵育细胞。为了评估 TetO-DN-CB-myc6-Rb1 结构在促进计划外细胞增殖方面的功能，在允许的条件下，在 DMEM 中培养含有 10% FBS 的培养性 HEI-OC1 细胞。对于细胞增殖研究，使用细胞计数器计算 HEI-OC1 细胞。每井每井有1万个 HEI-OC1 细胞，每个井的体积为 200 微升。在33摄氏度下夜间孵育细胞，用5%的二氧化碳孵育细胞。为了诱导转基因表达，每毫升多氧环素加入一微克，加入转染的 HEI-OC1 细胞子集。使用标记为负多氧环素和未转染的 HEI-OC1 细胞的其他子集作为对子对，用 10% CO2 将细胞孵育为 33 摄氏度。为了评估细胞增殖，转染后48小时，去除细胞培养基，从细胞增殖试剂盒中加入100微升1x染料结合溶液，进入微板的每个井中。按照制造商的规程，在37摄氏度下孵育一小时。使用荧光微孔板读取器测量每个样品的荧光强度。为了使用免疫细胞化学进一步评估细胞增殖，将 HEI-OC1 细胞板放在 DMEM 中 12 井板的每个井的盖玻璃上。在33摄氏度下孵育细胞过夜。第二天，用pTet-Splice和pCMV-Tet3G载体将细胞与两口孔中的细胞进行共转，然后对一个孔进行多氧环素治疗，以及使用NIH3T3细胞进行。使用一个未转换的以及一个控件。要处理Ki-67标签的细胞，在室温下用4%的甲醛在PBS中固定10分钟。之后，用冰冷PBS洗三次，每次五分钟。在PBS中加入0.25%的非日洗涤剂，孵育10分钟。在 PBS 中重复洗涤三次，每次五分钟。使用10%血清阻断细胞。在室温下加湿室中一小时。加入500微升Ki-67原抗体，在4摄氏度下孵育过夜。在PBS中再次清洗细胞三次，每次五分钟。加入一毫升的二次抗体，在黑暗中室温下孵育细胞一小时。去除二次抗体溶液后，在黑暗中用PBS再次清洗细胞三次，五分钟。要给 HEI-OC1 细胞贴上 phaloidin 的标签，在室温下在 1：200 phalloidin 中孵育它们 30 分钟。要给细胞核贴上标签，在室温下用每毫升DAPI5微克孵育细胞10分钟。在转基因小鼠分娩后，使用手稿中所述的CBRb1融合区域的底像对幼崽进行基因型。将成年TetO-DN-CB-myc6-Rb1小鼠繁殖到ROSA-CAG-rtTA和特乐林诱导线，以生成实验性DN-CBRb小鼠，并按照手稿所述对它们的后代进行基因型。NIH3T3不表达内源性RB1蛋白，因此此处看到的强健RB1表达是由于在Dex存在的情况下进行转基因诱导，但不是在它不存在的情况下，证实了TetO-DN-CB-myc6-Rb1混合RB1结构的高效激活。相比之下，HEK293细胞具有内源性RB1表达。多氧环素的加入导致 Teto-DN-CB-myc6-Rb1 激活和 RB1 下调节。从介质上去除多西环素21小时后，RB1表达恢复。与未用多氧环素治疗的转染细胞和未转染细胞相比，与未使用多氧环素治疗的转染细胞和未转染细胞相比，与同性载体共感染的 HEI-OC1 细胞相比，在多氧环素治疗后，细胞数量略有显著增加。荧光原位杂交证实了小鼠TetO-DN-CB-myc6-RB1转基因的基因组插入。与对照组相比，用多氧环素治疗的转基因小鼠耳蜗中RB1蛋白表达总量首次增加三天。然而，在用多十环素治疗的群体中，观察到RB1表达显著减少。无论分析的组织如何，在用多十环素治疗的转基因小鼠中观察到RB1蛋白显著减少，但在对照组中未观察到，证实了TetO-DN-CB-myc6-RB1结构的效率。在尝试此过程时，必须验证转基因的每个编码元素是否彼此在帧中。如果本报告中描述的凯德普辛B和视网膜母细胞瘤的编码区域偶然地连接在框架外，它就不会产生预期的融合蛋白。因此，在将转基因注入单细胞小鼠胚胎之前，必须进行DNA序列验证。按照这个程序，无处不在的CAG启动子可以替换为特定的启动子，以研究细胞的特定方式的基因功能。

Research

JoVE Journal

Genetics

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

可诱导T7 RNA聚合酶介导的多基因表达系统，pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

科研

遗传学

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

在荧光蛋白融合的一代<em&gt;念珠菌</em&gt;物种

Candida species, prevalent colonizers of the intestinal and genitourinary tracts, are the cause of the majority of invasive fungal infections in humans. ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

通过诱导瞬时转染可控离子通道表达

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

CRISPR/Cas9 蛋白注射到沟鲶、鮰松毛虫、基因编辑的胚胎

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

血管动力尾静脉注射对小鼠肝细胞基因的本构和诱导系统的修饰

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

利用南方印迹和聚合酶链反应鉴定小鼠胚胎干细胞的同源重组事件

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Lhgra 介导的反激活在拟南芥诱导、细胞类型特异性表达中的表达

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

基于质谱的蛋白质组学分析, 利用 OpenProt 数据库揭开从非规范开放阅读框架翻译的新蛋白质

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

定量细菌中蛋白质-RNA结合的测定

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

使用生物素标签研究蛋白质-核酸相互作用的体外生化分析

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...