Name: inducible and reversible dominant-negative (dn) protein inhibition
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition at JoVE.com

PCS2 + CB-Myc6 vektor var en gave fra Marshall Horwitz (University of Washington, Seattle, WA, USA). HEI-OC1 celler blev venligst leveret af Fedrico Kalinec (David Geffen School of Medicine, UCLA, Los Angeles, CA, USA). Teknisk støtte blev leveret fra den UNMC mus genom Engineering Core (C.B. Annis, Don Harms, Rolen Quadros) og Creighton University integreret biomedicinsk Imaging anlægget (Richard Hallworth, John Billheimer). UNMC musen genom Engineering blev støttet af en institutionel udvikling Award (idé) fra NIH/NIGMS, give nummer P20 GM103471. Den integrerede biomedicinsk Imaging facilitet blev støttet af Creighton University School of Medicine og grants GM103427 og GM110768 fra NIH/NIGMS. Anlægget blev bygget med støtte fra tilskud fra det nationale Center for forskningsressourcer (RR016469) og NIGMS (GM103427). Mus linjer oprettes i denne undersøgelse blev opretholdt på Creighton Universitys dyr ressource facilitet, hvis infrastrukturen er blevet forbedret gennem et tilskud af NIH/NCRR G20RR024001. Dette arbejde fik forbi støtte gennem en NIH/NCRR 5P20RR018788-/ NIH/NIGMS 8P20GM103471 COBRE yde (til Shelley D. Smith), NIH/ORIP R21OD019745-01A1 (S.M.R.-S.) og en spirende forskning tilskud fra Hearing Health Foundation (til S. Vagn). Indholdet af denne forskning er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Institutes of Health.

Generation af transgene CBRb musen og alle dyrs pleje og eksperimenter i forbindelse med undersøgelsen blev godkendt af Creighton University institutionelle dyrs pleje og brug udvalg (IACUC) og udføres af deres retningslinjer.
1. transgene CB-Myc6-Rb1 konstruktion
Bemærk: Kloning af CBRb i en pTet_Splice vektor blev gjort i en multi-step proces (figur 1A og 1B).
<ol><li>
Udføre ...

<ol>
	<li>Li, F. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+MyoD+homodimer+formation+demonstrated+by+a+general+method+of+dominant+negative+mutation+employing+fusion+with+a+lysosomal+protease.">Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease.</a> Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).</li><li>Tarang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+retinoblastoma+(rb)1-inducible+dominant-negative+(DN)+mouse+model.">Generation of a retinoblastoma (rb)1-inducible dominant-negative (DN) mouse model.</a> Frontiers Cellular Neuroscience. 9 (52), (2015).</li><li>Kominami, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+selective+role+of+cathepsins+B+and+D+in+the+lysosomal+degradation+of+endogenous+and+exogenous+proteins.">The selective role of cathepsins B and D in the lysosomal degradation of endogenous and exogenous proteins.</a> FEBS Letters. 287 (1-2), 189-192 (1991).</li><li>Cortellino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+ciliogenesis,+embryonic+lethality+and+severe+impairment+of+the+sonic+hedgehog+pathway+caused+by+inactivation+of+the+mouse+complex+A+intraflagellar+transport+gene+Ift122/Wdr10,+partially+overlapping+with+the+DNA+repair+gene+Med1/Mbd4.">Defective ciliogenesis, embryonic lethality and severe impairment of the sonic hedgehog pathway caused by inactivation of the mouse complex A intraflagellar transport gene Ift122/Wdr10, partially overlapping with the DNA repair gene Med1/Mbd4.</a> Developmental Biology. 325 (1), 225-237 (2009).</li><li>Ferreira, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+embryonic+lethality+of+H+ferritin+gene+deletion+in+mice.">Early embryonic lethality of H ferritin gene deletion in mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3021-3024 (2000).</li><li>Lee, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+deficient+for+rb+are+nonviable+and+show+defects+in+neurogenesis+and+haematopoiesis.">Mice deficient for rb are nonviable and show defects in neurogenesis and haematopoiesis.</a> Nature. 359 (6393), 288-294 (1992).</li><li>Turlo, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+cre-mediated+recombination+in+mice+does+not+result+in+protein+loss.">When cre-mediated recombination in mice does not result in protein loss.</a> Genetics. 186 (3), 959-967 (2010).</li><li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+cell-cycle+reentry+and+cell+death+after+acute+inactivation+of+the+retinoblastoma+gene+product+in+postnatal+cochlear+hair+cells.">Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+knockout+mouse+model+of+retinoblastoma.">The first knockout mouse model of retinoblastoma.</a> Cell Cycle. 3 (7), 952-959 (2004).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletions+of+retinoblastoma+1+(Rb1)+and+its+repressing+target+S+phase+kinase-associated+protein+2+(Skp2)+are+synthetic+lethal+in+mouse+embryogenesis.">Deletions of retinoblastoma 1 (Rb1) and its repressing target S phase kinase-associated protein 2 (Skp2) are synthetic lethal in mouse embryogenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10201-10209 (2016).</li><li>Yamasaki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+E2F-1+reduces+tumorigenesis+and+extends+the+lifespan+of+Rb1(+/-)+mice.">Loss of E2F-1 reduces tumorigenesis and extends the lifespan of Rb1(+/-) mice.</a> Nature Genetics. 18 (4), 360-364 (1998).</li><li>Li, F. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+a+dominant+negative+retinoblastoma+protein+(RB)+inhibiting+satellite+myoblast+differentiation+implies+an+indirect+interaction+between+MyoD+and+RB.">Selection of a dominant negative retinoblastoma protein (RB) inhibiting satellite myoblast differentiation implies an indirect interaction between MyoD and RB.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5129-5139 (2000).</li><li>Pitkanen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+human+retinoblastoma+gene+product+in+mouse+fibroblasts:+Effects+on+cell+proliferation+and+susceptibility+to+transformation.">Expression of the human retinoblastoma gene product in mouse fibroblasts: Effects on cell proliferation and susceptibility to transformation.</a> Experimental Cell Research. 207 (1), 99-106 (1993).</li><li>Chano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+abundance+of+RB1CC1+contributes+to+the+non-proliferating+enlarged+cell+phenotype+through+both+RB1+maintenance+and+TSC1+degradation.">Neuromuscular abundance of RB1CC1 contributes to the non-proliferating enlarged cell phenotype through both RB1 maintenance and TSC1 degradation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 18 (3), 425-432 (2006).</li><li>Kole, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+therapeutics:+Beyond+RNA+interference+and+antisense+oligonucleotides.">RNA therapeutics: Beyond RNA interference and antisense oligonucleotides.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 11 (2), 125-140 (2012).</li><li>Yamamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ons+and+offs+of+inducible+transgenic+technology:+A+review.">The ons and offs of inducible transgenic technology: A review.</a> Neurobiology of Disease. 8 (6), 923-932 (2001).</li><li>Houdebine, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+animal+models+in+biomedical+research.">Transgenic animal models in biomedical research.</a> Methods in Molecular Biology. 360, 163-202 (2007).</li><li>Brehm, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoblastoma+protein+recruits+histone+deacetylase+to+repress+transcription.">Retinoblastoma protein recruits histone deacetylase to repress transcription.</a> Nature. 391 (6667), 597-601 (1998).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E2F-HDAC+complexes+negatively+regulate+the+tumor+suppressor+gene+ARHI+in+breast+cancer.">E2F-HDAC complexes negatively regulate the tumor suppressor gene ARHI in breast cancer.</a> Oncogene. 25 (2), 230-239 (2006).</li><li>Magnaghi-Jaulin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoblastoma+protein+represses+transcription+by+recruiting+a+histone+deacetylase.">Retinoblastoma protein represses transcription by recruiting a histone deacetylase.</a> Nature. 391 (6667), 601-605 (1998).</li></ol>

For at omgå de begrænsninger, der er forbundet med traditionelle transgene strategier, forsøgte vi at generere en musemodel, hvor kan en endogen POI betinget inaktiveret ved overekspression en DN mutant form af det på en spatiotemporelle måde. For at ophæve funktionen af endogent POI'er, har flere muligheder været foreslået15,16,17. Vi har ændret en tidligere genetiske strategi1 ved at kombinere ...

De fleste tilgange med sigte på gen- og protein ablations stole på permanent processer, som generelt fører til fuldstændig fjernelse eller trunkering af genet, RNA sekvenser eller protein af interesse (POI). Det overordnede mål med denne metode er at ingeniør en rekombinant protein for at ophæve funktionen af endogent, wild-type protein. Vi har fornyet og moderniseret en alternativ strategi1,2, som giver mulighed for den midlertidige ablation af en POI gennem DN hæmning. Denne metode virker for både multimeriske og monomere peptider men er bedst egnet til proteiner, der fungerer i en multimeriske forsamling.
Metoden består af sammensmeltning den lysosomale protease CB til en underenhed af en multimeriske POI (CB fusion komplekse). Den resulterende CB fusion komplekse kan interagere med og proteolytically fordøje den endogene protein eller aflede den hele CB-POI kompleks at lysosomet at være forringet3. Desuden, en kombination af CB fusion kompleks med inducerbar arten af tetracyclin-kontrollerede transcriptional (Millie) aktiveringssystem tillader for inducerbar og kontrolleret udtryk af transgenet i en reversibel mode2. Skønt nyttig i mange situationer, kan den fuldstændig sletning af gener eller proteiner in vivo resultere i dødelighed4,5,6. Væv-specifikke, betinget sletning af nogle gener eller proteiner ved hjælp af Cre/Lox system kan ligeledes ikke være ligetil, som det vil i sidste ende føre til permanent tab af kritiske genomisk elements7. Derfor, afhængigt af genet eller POI, ingen af disse tilgange vil være effektive i at yde en nyttig model for efterfølgende undersøgelser, især gener eller proteiner funktionelle studier i sen postnatal og voksen mus.
For at omgå de problemer i forbindelse med sådanne tilgange og give proof-of-principle på effektiviteten af den foreslåede metode, har vi valgt at teste metoden præsenteret her ved at generere en betinget DN version af Retinoblastom 1 (RB1) protein. Flere muligheder har været foreslået8,9,10 at afskaffe funktionen af endogent RB1; men alle af dem står over for nogle af de samme begrænsninger diskuteret ovenfor: permanent kønscelleoverførsel sletning af RB1 er embryonically dødbringende, og i overensstemmelse med dens tumor suppressor rolle, permanent RB1 betinget sletning fører til en bred vifte af tumorer11. Selvom en DN version af RB1 ikke synes at forekomme naturligt, et bedre alternativ til de aktuelt tilgængelige strategier bør give mulighed for et tidsligt styret Inaktiveringen af den endogene RB1 og give en alternativ mekanisme til sidst gendanne dens funktion. Grundlaget for sådan en konstruktion blev beskrevet mere end to årtier siden1. Men på grund af teknologiske begrænsninger, det manglede en mekanisme til kontrol transgen aktivering, svar og væv specificitet. Denne undersøgelse er først til at kombinere elegance af doxycyclin (Dox)-afhængige transcriptional system med en manipuleret transgene konstruktion af lysosomale protease CB og Rb1 proteiner. Den resulterende CBRb musen model giver mulighed for en midlertidigt regulerede Dox-medieret RB1 forordning2. Fordelen ved at bruge sådan en proteom-baseret tilgang til at studere genfunktion er, at det kan vedtages for enhver gen af interesse, med minimal information om sin aktivitet.
Den foreslåede DN transgen strategi tilbyder mange fordele i forhold til traditionelle metoder. Første, DN protein hæmning fører til kun en delvis ablation i protein aktivitet, dermed bevare en resterende endogene udtryk. Et sådant resultat er ønskeligt i situationer hvor en fuldstændig fjernelse af protein aktivitet fører til embryonale dødelighed, stærkt begrænse enhver undersøgelse for at studere genfunktion i en levende mus. Andet, tilstedeværelsen af Millie system muliggør transgen aktivisering kun ved tilstedeværelse af et antibiotikum, der muliggør en effektiv og reversible kontrol af transgenet aktivitet. Således, ved at ophøre med den antibiotikaet administration, transgene systemet kan deaktiveres, og en normal RB1 udtryk er tilbage på plads. For det tredje kan specificiteten af transgenet udtryk variere afhængigt af promotor af valg. Mens vi har valgt den allestedsnærværende ROSA-CAG promotor for proof-of-principle, er placere transgen et væv-specifikke promotor tilbøjelige til at begrænse uønskede transgen udtryk og lette undersøgelser om den terapeutiske anvendelse af denne transgen metodologi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:768px;" width="769">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:255px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium, DMEM</td>
			<td style="width:228px;">GIBCO-BRL</td>
			<td style="width:119px;">11965-084</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Minimum Essential Medium Eagle, MEME&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">M8042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F2442&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Lipofectamine&#160;</td>
			<td style="width:228px;">DharmaFECT</td>
			<td style="width:119px;">T-2010-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Sal I</td>
			<td style="width:228px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11745622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">EcoRV-HF</td>
			<td style="width:228px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R3195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">NotI</td>
			<td style="width:228px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">13090730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CaspaTag&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">APT523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">DAPI</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Staurosporine</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CyQuant NF cell proliferation kit&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C35007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Retinoblastoma 1 antibody</td>
			<td style="width:228px;">Abcam</td>
			<td>Ab6075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">c-Myc antibody</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td>M5546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">b-actin</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td>A5316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ki-67&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">MA5-14520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Phallodin</td>
			<td style="width:228px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence microplate reader</td>
			<td style="width:228px;">FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Epifluorescence microscope&#160;</td>
			<td style="width:228px;">NikonEclipse80i</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:601px;">The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011.&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducible and reversible dominant-negative (dn) protein inhibition

Dominerende-negative (DN) protein hæmning er en kraftfuld metode til at manipulere protein funktion og tilbyder flere fordele sammenlignet med andre genom-baserede tilgange. For eksempel, selv om kimære og Cre-LoxP rettet mod strategier har været udbredt, de iboende begrænsninger af disse strategier (dvs, utætte promotor aktivitet, mosaik Cre udtryk, etc.) har betydeligt begrænset deres ansøgning. En fuldstændig sletning af mange endogene gener er desuden embryonically dødbringende, hvilket gør det umuligt at studere genfunktion i postnatal liv. For at imødegå disse udfordringer, vi har foretaget væsentlige ændringer til en tidlig genteknologi protokol og kombineret et kort (transgene) version af Rb1 gen med et lysosomale protease procathepsin B (CB), til at generere en DN musemodel af Rb1 (CBRb). På grund af tilstedeværelsen af en lysosomale protease dirigeres hele CB-RB1 fusion protein og dens interagerende komplekse til proteasom-medieret nedbrydning. Derudover muliggør tilstedeværelsen af en tetracyklin inducer (rtTA) element i den transgene konstruere en inducerbar og reversibel regulering af RB1 protein. Tilstedeværelsen af en allestedsnærværende ROSA-CAG promotor i CBRb musen model gør det et nyttigt værktøj til at udføre vandrende og reversible Rb1 gen ablation og give forskere en ressource for at forstå sin aktivitet i stort set enhver celletype hvor RB1 udtrykkes.

Generelt, designe en DN mutation kræver en betydelig mængde oplysninger om struktur og funktion af POI. Derimod er DN strategien præsenteret her især nyttig, når de strukturelle og funktionelle oplysninger for POI'EN er begrænset. Hvis POI'ET er en multimeriske protein, en sammensmeltning af en underenhed til en lysosomale protease overvejende kan hæmme den forsamlede multimer og potentielt andre ligander gennem en kombination af proteolyse af de endogene underenheder og subcellul?...

Watch this Scientific Journal Video about Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition at JoVE.com

Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition

Her præsenterer vi en protokol for at udvikle en dominerende negativ inducerbar system, som kan enhver protein betinget inaktiveret ved reversibelt overekspression en dominerende negativ mutant version af det.

Inducerbar og Reversible dominerende-negative (DN) Protein hæmning

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål på en lang række områder, der kræver betinget og forbigående inaktivering af et gen af interesse ved at over-udtrykke en dominerende negativ version af det. Den største fordel ved denne teknik er, at den kun tillader en delvis ablation i proteinaktivitet, således at en resterende endogene udtryk. Selv her beskriver vi tilstanden inaktivering af RB protein, som fungerer i en multimerisk samling, kan denne metode også anvendes på monomeriske proteiner.Umesh Pyakurel, vores laboratorium techinician og en medforfatter i manuskriptet vil demonstrere procedurerne. Til at begynde, dyrke NIH3T3 celler, efter sælgerens specifikationer, ved 37 grader Celsius med 5% CO2, ved hjælp af den anbefalede cellekultur medium, der indeholder 10% føtal kvæg serum. For at cotransfect cellerne ved hjælp af pTet-Splice og pCMV-Tet3G vektorer, første blande to til fire mikroliter af lipid-baserede transfektion reagens pr godt, og en milliliter ufuldstændig DMEM per brønd i en 15 milliliter rør, og inkubere i fem minutter ved stuetemperatur.Tilsæt to til tre mikrogram plasma-DNA pr. brønd til dette transinfektionsreages DMEM-blanding. Bland og inkubere i 20 minutter ved stuetemperatur. Der tilsættes en milliliter af blandingen indeholdende DNA og transinfektionsreagesen i DMEM til hver brønd af seks-brønds plade med NIH3T3 celler.Efter tre til fire timers inkubation ved 37 grader Celsius med 5% CO2, tilsæt en milliliter komplet medium. Derefter tilsættes 2 mikroliter doxycyclin lager til hver brønd og markere pladen som plus-doxycyclin. Inkuber cellerne ved 37 grader Celsius med 5% CO2.At vurdere funktionaliteten af TetO-DN-CB-myc6-Rb1 konstruktion i at fremme uplanlagt celleprolifeion, kultur HEI-OC1 celler i DMEM indeholder 10% FBS, under eftergivende betingelser. Ved celleproliferedningsundersøgelser skal du tælle HEI-OC1-cellerne ved hjælp af en celletæller. Plade 10, 000 HEI-OC1 celler per brønd på en 96-brønd plade i 200 mikroliter af volumen hver.Inkuber cellerne i løbet af natten ved 33 grader Celsius med 5% CO2. For at fremkalde transgene udtryk, tilføje et mikrogram pr milliliter doxycyclin til en delmængde af transfekterede HEI-OC1 celler. Brug den anden delmængde, der er mærket som minus-doxycyclin og de ikke-transficerede HEI-OC1-celler, som kontrol, og inkuber cellerne som 33 grader Celsius med 10 % CO2.For at vurdere cellespredning, 48 timer efter transfektion, skal du fjerne cellekulturmediet og tilføje 100 mikroliter 1x farvestofbindingsopløsning fra et celleprolifereringssæt til hver brønd af mikropladen. Følg producentens protokol og inkubere i en time ved 37 grader Celsius. Brug en fluorescens mikropladelæser til at måle fluorescensintensiteten af hver prøve.For yderligere at vurdere celleproliferation ved hjælp af immunokytokemi, plade HEI-OC1 celler på et dækglas placeret i hver brønd af en 12-brønd plade i DMEM. Inkuber cellerne natten over ved 33 grader Celsius. Den følgende dag, cotransfect til cellerne i to brønde med pTet-Splice og pCMV-Tet3G vektorer, og derefter udføre doxycyclin behandling på en godt som udført med NIH3T3 celler.Brug en uprtransmitteret samt en kontrol. For at behandle cellerne til Ki-67 mærkning, fastsætte dem med 4% paraformaldehyd i PBS i 10 minutter ved stuetemperatur. Derefter vaskes de tre gange med iskold PBS i fem minutter hver.Tilsæt 0,25% nonionisk vaskemiddel i PBS, og inkuberes i 10 minutter. Vasken gentages tre gange i PBS i fem minutter hver. Brug 10%serum til at blokere cellerne.I et befugtet kammer i en time ved stuetemperatur. Tilføj 500 mikroliter af Ki-67 primære antistof og inkubere natten over ved fire grader Celsius. Cellerne vaskes igen tre gange i PBS i fem minutter hver.Tilsæt en milliliter af det sekundære antistof og inkuber cellerne i en time ved stuetemperatur i mørke. Efter fjernelse af den sekundære antistofopløsning vaskes cellerne igen tre gange i fem minutter i PBS i mørke. At mærke HEI-OC1 celler med falloidin, inkubere dem i 1:200 falloidin i 30 minutter ved stuetemperatur.For at mærke cellekernerne inkuberes cellerne med fem mikrogram pr. milliliter DAPI i 10 minutter ved stuetemperatur. Efter levering af transgenemusne genotypeer hvalpene ved hjælp af en primer, der er specifik for CBRb1-fusionsregionen som beskrevet i manuskriptet. Race voksen TetO-DN-CB-myc6-Rb1 mus til ROSA-CAG-rtTA og tetrecyclin inducer linje til at generere eksperimentelle DN-CBRb mus, og genotype deres afkom som beskrevet i manuskriptet.NIH3T3 udtrykker ikke endogene RB1-protein, så det robuste RB1-udtryk, der ses her, skyldes transgeneinduktion i dox's tilstedeværelse, men ikke i dets fravær, hvilket bekræfter en effektiv aktivering af TetO-DN-CB-myc6-Rb1-blandingen RB1-konstruktionen. I modsætning hertil har HEK293 celler endogene RB1 udtryk. Tilføjelsen af doxycyclin førte til TetO-DN-CB-myc6-Rb1 aktivering og RB1 down-regulering.RB1-udtrykket blev genoptaget 21 timer efter, at doxycyclin blev fjernet fra mediet. HEI-OC1 celler cotransfected med de samme vektorer, viste en beskeden, men betydelig stigning i celletallet følge doxycyclin behandling sammenlignet med transfekterede celler ikke behandlet med doxycyclin, og de ikke-transmittede celler. Fluorescerende in situ hybridisering bekræftede genomisk indsættelse af TetO-DN-CB-myc6-RB1 transgene i mus.Der var en indledende stigning i det samlede RB1 proteinudtryk i cochlea af de transgene mus, der blev behandlet med doxycyclin i tre dage sammenlignet med kontrolgruppen. I grupper, der blev behandlet med doxocyclin i syv og 10 dage, blev der imidlertid observeret en betydelig reduktion i RB1-ekspressionen. Uanset det analyserede væv blev der observeret en signifikant reduktion i RB1-protein hos transgene mus behandlet med doxocyclin, men ikke i kontrolgruppen, hvilket bekræfter effektiviteten af TetO-DN-CB-myc6-RB1 konstruktionen.Mens du forsøger denne procedure, er det vigtigt at kontrollere, at hver af de kodning elementer af transgene er i ramme med hinanden. Hvis de kodningsregioner Cathepsin B og retinoblastoma, der er beskrevet i denne rapport, tilfældigvis var forbundet uden for rammen, ville det ikke give det tilsigtede fusionsprotein. Dna-sekvensverifikationen skal således foretages, før transgenet indsprøjtes i encellede museembryoner.Efter denne procedure kan den allestedsnærværende CAG-promotor erstattes med specifikke promotorer for at studere genfunktionen på en celles specifikke måde.

Research

JoVE Journal

Genetics

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Inducerbart T7 RNA Polymerase-medieret Multigen Expressions System, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Dannelse af fluorescerende protein-fusioner i<em&gt; Candida</em&gt; Arter

Candida species, prevalent colonizers of the intestinal and genitourinary tracts, are the cause of the majority of invasive fungal infections in humans. ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Kontrollerbar Ion Channel Expression gennem Inducible Transient transfektion

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Mikroinjektion af CRISPR/Cas9 Protein i kanal havkat, Ictalurus punctatus, embryoner til Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Konstituerende og inducerbar systemer for genetiske In Vivo ændring af mus hepatocytter brug af hydrodynamiske hale vene injektion

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identifikation af homologe rekombination begivenheder i mus embryonale stamceller ved hjælp af det sydlige Blotting og Polymerase kædereaktion

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducerbar, celle Type-specifikke udtryk i Arabidopsis thaliana gennem LhGR-medieret Trans-aktivering

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Massespektrometri-baseret Proteomics analyser ved hjælp af OpenProt Database til at afsløre nye proteiner oversat fra ikke-kanoniske åbne læserammer

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

En analyse til kvantificering af protein-RNA-binding i bakterier

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

In vitro biokemiske assays ved hjælp af biotin etiketter til at studere Protein-nukleinsyre interaktioner

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...