Name: inducible and reversible dominant-negative (dn) protein inhibition
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Le Bureau2 + CB-Myc6 vector est un cadeau de Marshall Horwitz (University of Washington, Seattle, WA, é.-u.). Les cellules de HEI-OC1 ont été gracieusement fournis par Fedrico Kalinec (David Geffen School of Medicine, UCLA, Los Angeles, CA, é.-u.). Support technique a été fourni par l’UNMC souris Genome Engineering Core (C.B. Gurumurthy, Don Harms, Rolen Quadros) et la Creighton University intégré Biomedical Imaging Facility (Richard Hallworth, John Billheimer). Le génie du génome de souris UNMC a été soutenue par une bourse de développement institutionnel (IDea) de la NIH/NIGM, accorder le numéro P20 GM103471. La fonction intégrée Biomedical Imaging était soutenue par la Creighton University School of Medicine et subventions GM103427 et GM110768 de la NIH/NIGM. L’installation a été construite avec l’aide de subventions du National Center for Research Resources (RR016469) et la NIGM (GM103427). Les lignées de souris générées dans cette étude ont été maintenues à un centre de ressources de l’Université de Creighton Animal, dont l’infrastructure a été améliorée grâce à une subvention de NIH/RRRNC G20RR024001. Ce travail a reçu au-delà de prise en charge via un NIH/RRRNC 5P20RR018788-/ NIH/NIGM 8P20GM103471 COBRE accorder (à Shelley D. Smith), NIH/ORIP R21OD019745-01 a 1 (s.-S.) et une subvention de recherche émergents de la fondation de santé auditive (à S. Normand). Le contenu de cette recherche est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement l’opinion officielle de la National Institutes of Health.

Génération de la souris transgénique de CBRb et tous les soins aux animaux et expériences liées à l’étude ont été approuvés par l’Université Creighton institutionnels, protection des animaux et utilisation Comité (IACUC) et effectué par des lignes directrices.
1. transgéniques CB-Myc6-Rb1 Construct
Remarque : Le clonage de CBRb dans un vecteur de pTet_Splice a été fait dans un processus en plusieurs étapes (<strong cla...

<ol>
	<li>Li, F. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+MyoD+homodimer+formation+demonstrated+by+a+general+method+of+dominant+negative+mutation+employing+fusion+with+a+lysosomal+protease.">Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease.</a> Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).</li><li>Tarang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+retinoblastoma+(rb)1-inducible+dominant-negative+(DN)+mouse+model.">Generation of a retinoblastoma (rb)1-inducible dominant-negative (DN) mouse model.</a> Frontiers Cellular Neuroscience. 9 (52), (2015).</li><li>Kominami, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+selective+role+of+cathepsins+B+and+D+in+the+lysosomal+degradation+of+endogenous+and+exogenous+proteins.">The selective role of cathepsins B and D in the lysosomal degradation of endogenous and exogenous proteins.</a> FEBS Letters. 287 (1-2), 189-192 (1991).</li><li>Cortellino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+ciliogenesis,+embryonic+lethality+and+severe+impairment+of+the+sonic+hedgehog+pathway+caused+by+inactivation+of+the+mouse+complex+A+intraflagellar+transport+gene+Ift122/Wdr10,+partially+overlapping+with+the+DNA+repair+gene+Med1/Mbd4.">Defective ciliogenesis, embryonic lethality and severe impairment of the sonic hedgehog pathway caused by inactivation of the mouse complex A intraflagellar transport gene Ift122/Wdr10, partially overlapping with the DNA repair gene Med1/Mbd4.</a> Developmental Biology. 325 (1), 225-237 (2009).</li><li>Ferreira, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+embryonic+lethality+of+H+ferritin+gene+deletion+in+mice.">Early embryonic lethality of H ferritin gene deletion in mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3021-3024 (2000).</li><li>Lee, E. 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Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+a+dominant+negative+retinoblastoma+protein+(RB)+inhibiting+satellite+myoblast+differentiation+implies+an+indirect+interaction+between+MyoD+and+RB.">Selection of a dominant negative retinoblastoma protein (RB) inhibiting satellite myoblast differentiation implies an indirect interaction between MyoD and RB.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5129-5139 (2000).</li><li>Pitkanen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+human+retinoblastoma+gene+product+in+mouse+fibroblasts:+Effects+on+cell+proliferation+and+susceptibility+to+transformation.">Expression of the human retinoblastoma gene product in mouse fibroblasts: Effects on cell proliferation and susceptibility to transformation.</a> Experimental Cell Research. 207 (1), 99-106 (1993).</li><li>Chano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+abundance+of+RB1CC1+contributes+to+the+non-proliferating+enlarged+cell+phenotype+through+both+RB1+maintenance+and+TSC1+degradation.">Neuromuscular abundance of RB1CC1 contributes to the non-proliferating enlarged cell phenotype through both RB1 maintenance and TSC1 degradation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 18 (3), 425-432 (2006).</li><li>Kole, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+therapeutics:+Beyond+RNA+interference+and+antisense+oligonucleotides.">RNA therapeutics: Beyond RNA interference and antisense oligonucleotides.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 11 (2), 125-140 (2012).</li><li>Yamamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ons+and+offs+of+inducible+transgenic+technology:+A+review.">The ons and offs of inducible transgenic technology: A review.</a> Neurobiology of Disease. 8 (6), 923-932 (2001).</li><li>Houdebine, L. 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Afin de contourner les limitations associées à des stratégies traditionnelles de transgéniques, nous avons cherché à créer un modèle de souris dans lequel un POI endogène peut être inactivé conditionnellement en surexprimant une forme mutante de DN de celui-ci d’une manière spatio-temporelle. Pour l’abolition de la fonction de POI endogène, plusieurs options ont été proposées15,16,17. Nous avons modifié une ...

La plupart des approches visant à l’ablation des gènes et des protéines s’appuient sur des processus permanents, qui se traduisent généralement par l’élimination complète ou la troncation de la gène, de séquences d’ARN ou protéine d’intérêt (POI). L’objectif général de cette méthode est à l’ingénieur une protéine recombinante pour l’abolition de la fonction des protéines endogènes, sauvage. Nous avons revu et remanié une stratégie alternative1,2, qui permet l’ablation temporaire d’un POI par inhibition de la DN. Cette méthode fonctionne pour les multimères et peptides monomères mais est plus adaptée pour les protéines qui fonctionnent dans une assemblée de multimères.
La méthode consiste à fusionner la protéase lysosomale CB à une sous-unité d’un multimériques POI (complexe de fusion de CB). La résultante complexe de fusion CB peut interagir avec et clivage protéolytique digérer la protéine endogène ou détourner l’ensemble CB-POI pour le lysosome être dégradées3. En outre, une combinaison de la fusion de CB complexe avec le caractère inductible du système contrôlé par tétracycline l’activation transcriptionnelle (Fifi) permet une expression inductible et contrôlée du transgène dans un mode réversible2. Bien qu’utiles dans de nombreuses circonstances, la suppression complète des gènes ou des protéines in vivo peut entraîner la létalité4,5,6. De même, tissu-spécifique, conditionnelle délétion de certains gènes ou les protéines utilisant le système Cre-Lox ne peut pas être simple, comme elle, en fin de compte, entraînera la perte permanente des éléments critiques de génomique7. Par conséquent, selon le gène ou POI, aucune de ces approches seront efficaces en fournissant un modèle utile pour des études ultérieures, en particulier des gènes ou des protéines des études fonctionnelles chez les souris adultes et postnatals fin.
Pour contourner les problèmes liés à ces approches et fournir preuve de principe sur l’efficacité de la méthode proposée, nous avons choisi de tester la méthode présentée ici en générant une version DN conditionnelle de la protéine du rétinoblastome 1 (RB1). Plusieurs options ont été proposées8,9,10 à abolir la fonction de RB1 endogène ; Cependant, chacun d’eux fait face à certaines limitations mêmes discutées plus haut : suppression de cellules germinales permanente de RB1 est mortelle embryonnaire et, conforme à son rôle de suppresseur de tumeur, permanente RB1 suppression conditionnelle mène à une variété de tumeurs11. Même si une version DN de RB1 ne semble pas se produire naturellement, une meilleure alternative pour les stratégies actuellement disponibles devrait permettre une inactivation temporellement contrôlée de la RB1 endogène et prévoient un autre mécanisme pour finalement restaurer sa fonction. La base d’une telle construction a été décrite il y a plus de vingt ans1. Toutefois, en raison des limitations technologiques, il lui manquait un mécanisme d’activation de transgène de contrôle, d’intervention et spécificité tissulaire. Cette étude est le premier à combiner l’élégance de la doxycycline (Dox)-système transcriptionnelle dépendant par une ingénierie construction transgénique de protéines de CB et Rb1 protéases lysosomales. Le modèle de souris CBRb qui en résulte permet une RB1 temporairement réglementée de Dox-mediated règle2. L’avantage d’utiliser une approche axée sur le protéome pour étudier la fonction du gène est qu’il peut être adopté pour n’importe quel gène d’intérêt, avec un minimum d’informations sur son activité.
La stratégie proposée du transgène DN offre de nombreux avantages par rapport aux approches traditionnelles. Tout d’abord, l’inhibition de protéine DN mène à seulement une ablation partielle en activité de la protéine, préservant ainsi une expression endogène résiduelle. Un tel résultat est hautement souhaitable dans des situations où une élimination complète de l’activité de la protéine entraîne une létalité embryonnaire, limitant grandement toute enquête pour étudier la fonction des gènes dans une souris vivante. En second lieu, la présence du système TetO permet l’activation du transgène qu’en présence d’un antibiotique, ce qui permet un contrôle efficace et réversible de l’activité du transgène. Ainsi, en cessant l’administration d’antibiotiques, le système transgénique peut être désactivé, et une expression normale de la RB1 est remis en place. En troisième lieu, la spécificité de l’expression de transgènes peut varier selon le promoteur de choix. Alors que nous avons choisi le promoteur omniprésent de ROSA-CAG pour preuve de principe, plaçant le transgène sous un promoteur spécifique aux tissus est susceptible de restreindre l’expression transgénique non désirées et de faciliter les études sur l’application thérapeutique de ce transgène méthodologie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:768px;" width="769">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:255px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium, DMEM</td>
			<td style="width:228px;">GIBCO-BRL</td>
			<td style="width:119px;">11965-084</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Minimum Essential Medium Eagle, MEME&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">M8042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F2442&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Lipofectamine&#160;</td>
			<td style="width:228px;">DharmaFECT</td>
			<td style="width:119px;">T-2010-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Sal I</td>
			<td style="width:228px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11745622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">EcoRV-HF</td>
			<td style="width:228px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R3195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">NotI</td>
			<td style="width:228px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">13090730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CaspaTag&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">APT523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">DAPI</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Staurosporine</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CyQuant NF cell proliferation kit&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C35007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Retinoblastoma 1 antibody</td>
			<td style="width:228px;">Abcam</td>
			<td>Ab6075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">c-Myc antibody</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td>M5546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">b-actin</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td>A5316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ki-67&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">MA5-14520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Phallodin</td>
			<td style="width:228px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence microplate reader</td>
			<td style="width:228px;">FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Epifluorescence microscope&#160;</td>
			<td style="width:228px;">NikonEclipse80i</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:601px;">The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011.&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducible and reversible dominant-negative (dn) protein inhibition

Inhibition de protéine dominant négatif (DN) est une méthode puissante pour manipuler la fonction des protéines et offre plusieurs avantages par rapport aux autres approches axées sur la génomique. Par exemple, bien que chimérique et Cre-LoxP stratégies de ciblage ont été largement utilisés, les limitations intrinsèques de ces stratégies (activité du promoteur qui fuit, expression de Cre de mosaïque, etc.) ont considérablement restreint leurs demande. En outre, un effacement complet de nombreux gènes endogènes est une létalité embryonnaire, rendant impossible d’étudier la fonction du gène dans la vie postnatale. Pour relever ces défis, nous avons apporté des changements importants à un protocole de génie génétique précoce et combiné (transgénique) version courte du gène Rb1 avec une protéase lysosomale B procathepsin (CB), générer un modèle de souris DN de Rb1 (CBRb). En raison de la présence d’une protéase lysosomale, la protéine de fusion CB-RB1 entière et son interaction complexe sont acheminés pour dégradation induite par le protéasome. En outre, la présence d’un élément inducteur (rtTA) de tétracycline dans la construction transgénique permet une régulation inductible et réversible de la protéine RB1. La présence d’un promoteur de ROSA-CAG omniprésent dans le modèle de souris CBRb rend un outil utile pour procéder à l’ablation de gène Rb1 transitoire et réversible et de fournir aux chercheurs une ressource pour comprendre son activité dans pratiquement n’importe quel type de cellules où la RB1 est exprimé.

En règle générale, concevoir une mutation DN nécessite une quantité considérable d’informations sur la structure et la fonction du POI. En revanche, la stratégie de DN présentée ici est particulièrement utile lorsque les informations structurales et fonctionnelles pour le POI sont limitées. Si le pi est une protéine de multimères, une fusion d’une sous-unité d’une protéase lysosomale peut inhiber principalement les multimères assemblé et, éventuellement, d’autres...

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Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition

Nous présentons ici un protocole visant à développer un système inductible dominant négatif, dans lequel toute protéine peut être inactivée conditionnellement par réversiblement surexprimant une version mutante dominant négatif de celui-ci.

Inhibition de protéine inductible et réversible Dominant négatif (DN)

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans une grande variété de domaines nécessitant l’inactivation conditionnelle et transitoire d’un gène d’intérêt en exprimant de façon réversible une version négative dominante de celui-ci. Le principal avantage de cette technique est qu’elle ne permet qu’une ablation partielle de l’activité protéique, préservant ainsi une expression endogène résiduelle. Bien que, ici nous décrivons l’inactivation de condition de la protéine de RB, qui fonctionne dans un assemblage multimérique, cette méthodologie peut également être appliquée aux protéines monmériques.Umesh Pyakurel, notre technicien de laboratoire et coauteur du manuscrit, démontrera les procédures. Pour commencer, cultivez des cellules NIH3T3, selon les spécifications du vendeur, à 37 degrés Celsius avec 5% de CO2, en utilisant le milieu de culture cellulaire recommandé contenant 10% de sérum bovin fœtal. Pour cotransfecter les cellules à l’aide de vecteurs pTet-Splice et pCMV-Tet3G, mélangez d’abord deux à quatre microlitres du réagent de transfection à base de lipides par puits, et un millilitre de DMEM incomplet par puits dans un tube de 15 millilitres, et incuber pendant cinq minutes à température ambiante.Ajoutez deux à trois microgrammes d’ADN plasmatique par puits au mélange DMEM de ce réagrence transfection. Mélanger et incuber pendant 20 minutes à température ambiante. Ajouter un millilitre du mélange contenant de l’ADN et le réaccente de transfection dans le DMEM à chaque puits de plaque de six puits avec des cellules NIH3T3.Après trois à quatre heures d’incubation à 37 degrés Celsius avec 5% de CO2, ajouter un millilitre de milieu complet. Ensuite, ajouter 2 microlitres de bouillon de doxycycline à chaque puits et marquer l’assiette comme plus-doxycycline. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5% de CO2.Pour évaluer la fonctionnalité de la construction TetO-DN-CB-myc6-Rb1 dans la promotion de la prolifération cellulaire non reportée, la culture des cellules HEI-OC1 dans le DMEM contenant 10% de FBS, dans des conditions permissives. Pour les études sur la prolifération cellulaire, comptez les cellules HEI-OC1 à l’aide d’un compteur cellulaire. Plaque 10 000 cellules HEI-OC1 par puits sur une plaque de 96 puits en 200 microlitres de volume chacune.Incuber les cellules pendant la nuit à 33 degrés Celsius avec 5% de CO2. Pour induire l’expression transgénique, ajoutez un microgramme par millilitre de doxycycline à un sous-ensemble de cellules HEI-OC1 transfectées. Utilisez l’autre sous-ensemble étiqueté comme moins-doxycycline et les cellules HEI-OC1 non transfectées comme témoins, et incuber les cellules comme 33 degrés Celsius avec 10% de CO2.Pour évaluer la prolifération cellulaire, 48 heures après la transfection, retirez le milieu de culture cellulaire et ajoutez 100 microlitres de solution de liaison de colorant 1x d’un kit de prolifération cellulaire à chaque puits de la micro-plaque. Suivez le protocole du fabricant et incubez pendant une heure à 37 degrés Celsius. Utilisez un lecteur de microplaque de fluorescence pour mesurer l’intensité de fluorescence de chaque échantillon.Pour évaluer davantage la prolifération cellulaire à l’aide de l’immunocytochimie, plaquez les cellules HEI-OC1 sur un verre de couverture placé dans chaque puits d’une plaque de 12 puits dans le DMEM. Incuber les cellules pendant la nuit à 33 degrés Celsius. Le lendemain, cotransfecter les cellules dans deux puits avec le pTet-Splice et les vecteurs pCMV-Tet3G, puis effectuer le traitement à la doxycycline sur un bon ainsi que fait avec les cellules NIH3T3.Utilisez-en un non transmis ainsi qu’un contrôle. Pour traiter les cellules pour l’étiquetage Ki-67, fixez-les avec 4% de paraformaldéhyde dans PBS pendant 10 minutes à température ambiante. Après cela, lavez-les trois fois avec du PBS glacé pendant cinq minutes chacun.Ajouter 0,25% de détergent non ionique dans PBS, et incuber pendant 10 minutes. Répétez le lavage trois fois dans PBS pendant cinq minutes chacun. Utilisez 10% sérum pour bloquer les cellules.Dans une chambre humidifiée pendant une heure à température ambiante. Ajouter 500 microlitres d’anticorps primaires Ki-67 et incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius. Lavez les cellules à nouveau trois fois dans PBS pendant cinq minutes chacun.Ajouter un millilitre de l’anticorps secondaire et incuber les cellules pendant une heure à température ambiante dans l’obscurité. Après avoir enlevé la solution d’anticorps secondaire, lavez les cellules à nouveau trois fois pendant cinq minutes dans PBS dans l’obscurité. Pour étiqueter les cellules HEI-OC1 avec de la phalloidine, incubez-les en 1:200 phalloidin pendant 30 minutes à température ambiante.Pour étiqueter les noyaux cellulaires, incuber les cellules avec cinq microgrammes par millilitre de DAPI pendant 10 minutes à température ambiante. Après la livraison des souris transgéniques, génotyper les chiots à l’aide d’un amorce spécifique à la région de fusion CBRb1 tel que décrit dans le manuscrit. Élever des souris adultes TetO-DN-CB-myc6-Rb1 à la ligne d’inducteur ROSA-CAG-rtTA et tetrecycline pour générer des souris expérimentales DN-CBRb, et génotyper leur progéniture comme décrit dans le manuscrit.NIH3T3 n’exprime pas la protéine RB1 endogène, de sorte que l’expression RB1 robuste observée ici est due à l’induction transgénique en présence de Dox, mais pas en son absence, confirmant l’activation efficace de la construction TetO-DN-CB-myc6-Rb1 mix RB1. En revanche, les cellules HEK293 ont l’expression endogène rb1. L’ajout de doxycycline a conduit à l’activation de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 et à une régulation à la baisse de la RB1.L’expression rb1 a été reprise 21 heures après que la doxycycline ait été enlevée des médias. Les cellules HEI-OC1 cotransfectées avec les mêmes vecteurs, ont montré une augmentation modeste mais significative du nombre de cellules suivent le traitement de doxycycline comparé aux cellules transfected non traitées avec la doxycycline, et aux cellules nontransfected. L’hybridation in situ fluorescente a confirmé l’insertion génomique du transgène TetO-DN-CB-myc6-RB1 chez la souris.Il y avait une augmentation initiale de l’expression totale de protéine RB1 dans la cochlée des souris transgéniques traitées avec la doxycycline pendant trois jours comparée au groupe témoin. Cependant, dans les groupes traités avec la doxocycline pendant sept et 10 jours, une réduction significative de l’expression de RB1 a été observée. Indépendamment du tissu analysé, une réduction significative de la protéine RB1 a été observée chez les souris transgéniques traitées avec de la doxocycline, mais pas dans le groupe témoin, confirmant l’efficacité de la construction TetO-DN-CB-myc6-RB1.Tout en essayant cette procédure, il est important de vérifier que chacun des éléments de codage du transgène sont en cadre les uns avec les autres. Si les régions codantes de cathepsine B et de rétinoblastome décrites dans ce rapport étaient, par hasard, reliées hors cadre, elles ne donneraient pas la protéine de fusion prévue. Ainsi, la vérification de la séquence d’ADN doit être effectuée avant d’injecter le transgène dans des embryons de souris unicellulaires.Suivant cette procédure, le promoteur omniprésent de CAG peut être remplacé par des promoteurs spécifiques afin d’étudier la fonction génétique de la manière spécifique d’une cellule.

Research

JoVE Journal

Genetics

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Recherche

Génétique

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