Name: inducible and reversible dominant-negative (dn) protein inhibition
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Die pCS2 + CB-Myc6 Vektor war ein Geschenk von Marshall Horwitz (University of Washington, Seattle, WA, USA). Die HEI-OC1 Zellen wurden freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Fedrico Kalinec (David Geffen School of Medicine, UCLA, Los Angeles, CA, USA). Technischer Support sorgte die UNMC Maus Genom Engineering Core (c.b. Gurumurthy, Don Harms, Rolen Quadros) und der Creighton Universität integrierte Biomedical Imaging Facility (Richard Hallworth, John Billheimer). Gewähren Sie durch eine institutionelle Development Award (IDea) von der NIH/NIGMS UNMC Maus Genom Engineering unterstützt wurde, Nummer P20 GM103471. Die integrierte biomedizinische Bildgebung Anlage wurde von der Creighton University School of Medicine und Stipendien, GM103427 und GM110768 von der NIH/NIGMS unterstützt. Die Anlage wurde mit Unterstützung durch Zuschüsse aus dem National Center for Research Resources (RR016469) gebaut und die NIGMS (GM103427). Die Mauslinien erzeugt in dieser Studie wurden auf Creighton University Animal Ressource Facility, gehalten dessen Infrastruktur durch einen Zuschuss von NIH/NCRR G20RR024001 verbessert wurde. Diese Arbeit vorbei an Unterstützung durch ein NIH/NCRR 5P20RR018788-/ NIH/NIGMS 8P20GM103471 COBRE gewähren (Shelley D. Smith), NIH/ORIP R21OD019745-01A1 (S.M.R.-S.) und einer aufstrebenden Forschungsstipendium aus der Anhörung Health Foundation (zu S. Tarang) erhalten. Der Inhalt dieser Forschung ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.

Generation der transgenen CBRb Maus und alle Tierpflege Experimente im Zusammenhang mit der Studie wurden genehmigt von der Creighton Universität institutionelle Tier Pflege und Nutzung Committee (IACUC) und durch ihre Richtlinien durchgeführt.
(1) transgenen CB-Myc6-Rb1 Konstrukt
Hinweis: Das Klonen von CBRb in einen Vektor pTet_Splice erfolgte in mehreren Schritten (Abb. 1A und 1 b).
<o...

<ol>
	<li>Li, F. 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Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+a+dominant+negative+retinoblastoma+protein+(RB)+inhibiting+satellite+myoblast+differentiation+implies+an+indirect+interaction+between+MyoD+and+RB.">Selection of a dominant negative retinoblastoma protein (RB) inhibiting satellite myoblast differentiation implies an indirect interaction between MyoD and RB.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5129-5139 (2000).</li><li>Pitkanen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+human+retinoblastoma+gene+product+in+mouse+fibroblasts:+Effects+on+cell+proliferation+and+susceptibility+to+transformation.">Expression of the human retinoblastoma gene product in mouse fibroblasts: Effects on cell proliferation and susceptibility to transformation.</a> Experimental Cell Research. 207 (1), 99-106 (1993).</li><li>Chano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+abundance+of+RB1CC1+contributes+to+the+non-proliferating+enlarged+cell+phenotype+through+both+RB1+maintenance+and+TSC1+degradation.">Neuromuscular abundance of RB1CC1 contributes to the non-proliferating enlarged cell phenotype through both RB1 maintenance and TSC1 degradation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 18 (3), 425-432 (2006).</li><li>Kole, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+therapeutics:+Beyond+RNA+interference+and+antisense+oligonucleotides.">RNA therapeutics: Beyond RNA interference and antisense oligonucleotides.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 11 (2), 125-140 (2012).</li><li>Yamamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ons+and+offs+of+inducible+transgenic+technology:+A+review.">The ons and offs of inducible transgenic technology: A review.</a> Neurobiology of Disease. 8 (6), 923-932 (2001).</li><li>Houdebine, L. 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Um die Grenzen verbunden mit traditionellen transgene Strategien zu umgehen, haben wir versucht, ein Mausmodell zu generieren, in denen eine endogene POI bedingt inaktiviert durch ein DN mutierte Form des es in gewissem Sinne raumzeitlichen überexprimiert. Um die Funktion des endogenen POIs abschaffen zu können, wurden mehrere Optionen vorgeschlagenen15,16,17. Durch die Kombination der Dox-abhängige transkriptionellen Systems...

Die meisten Ansätze mit dem Ziel der Gene und Proteine Ablationen setzen auf permanente Prozesse, die in der Regel zur vollständigen Beseitigung oder Kürzung des Gens, RNA-Sequenzen oder Protein von Interesse (POI) führen. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist ein rekombinantes Protein zur Abschaffung der endogenen, Wildtyp Protein-Funktion zu konstruieren. Wir haben neu aufgelegt und überarbeitet eine alternative Strategie1,2, die für die temporäre Ablation eines POI durch DN Hemmung ermöglicht. Diese Methode funktioniert für Multimeric und Monomeren Peptide aber eignet sich am besten für Proteine, die in einer Assembly Multimeric funktionieren.
Die Methode besteht darin, der Verschmelzung der lysosomalen Protease CB an eine Untereinheit von einem Multimeric POI (CB Fusion Komplex). Die resultierende komplexe CB-Fusion kann interagieren mit und proteolytisch das körpereigene Protein zu verdauen oder umleiten den Gesamtkomplex der CB-POI zu den Lysosomen abgebaut3sein. Darüber hinaus ermöglicht eine Kombination aus der komplexen CB-Fusion mit der induzierbaren Natur des Systems der Tetracyclin-gesteuerte transkriptionelle Aktivierung (TetO) einen induzierbaren und kontrollierte Expression des Transgens in einem reversiblen Mode2. Obwohl in vielen Fällen nützlich, führt die vollständige Löschung von Genen oder Proteinen in-vivo Letalität4,5,6. Ebenso gewebespezifischen, bedingte Löschung einiger Gene oder Proteine mit dem Cre/Lox-System einfach, möglicherweise nicht da es letztlich zu den dauerhaften Verlust von kritischen genomische Elemente7führt. Daher, je nach gen oder POI, keiner dieser Ansätze werden wirksam bei der Bereitstellung eines nützlichen Modells für nachfolgende Studien, besonders Gene oder Proteine funktionellen Studien in den späten postnatale und Erwachsenen Mäusen.
Zur Umgehung der Probleme im Zusammenhang mit solchen Ansätzen und Proof of Principle über die Wirksamkeit des vorgeschlagenen Verfahrens, möchten wir hier durch die Erzeugung einer bedingten DN-Version des Proteins Retinoblastom 1 (RB1) vorgestellte Methode zu testen. Mehrere Möglichkeiten wurden vorgeschlagenen8,9,10 , die Funktion des endogenen RB1 abzuschaffen; jedoch alle den gleichen Einschränkungen oben diskutierten konfrontiert: permanente Keimbahn Löschung von RB1 ist Hochkultur tödlich, und mit seinen Tumorsuppressor Rolle, permanente RB1 bedingte Löschung führt zu einer Vielzahl von Tumoren11. Obwohl eine DN-Version von RB1 nicht natürlich vorkommen scheint, sollte eine bessere Alternative zu den derzeit verfügbaren Strategien erlauben eine zeitlich gesteuerte Inaktivierung von endogenen RB1 und bieten einen alternativen Mechanismus schließlich wiederherstellen ihrer Funktion. Die Grundlage für ein solches Konstrukt wurde vor über zwei Jahrzehnten beschrieben1. Allerdings fehlte es aufgrund von technischen Einschränkungen, einen Mechanismus zur Kontrolle Transgen Aktivierung, Reaktion und Gewebespezifität. Diese Studie ist die erste verbinden die Eleganz der Doxycyclin (Dox)-abhängige transkriptionelle System mit ein veränderter transgenen Konstrukt der lysosomalen Protease CB und Rb1 Proteine. Die daraus resultierende CBRb-Maus-Modell ermöglicht eine vorübergehend geregelten Dox-vermittelten RB1 Verordnung2. Der Vorteil der Verwendung eines Proteom-basierten Ansatzes Genfunktion zu studieren ist, dass es für jedes Gen von Interesse, mit minimalen Informationen über seine Tätigkeit angenommen werden kann.
Die vorgeschlagene DN-Transgen-Strategie bietet viele Vorteile gegenüber herkömmlichen Ansätzen. Erstens führt DN Protein Hemmung zu nur ein teilweiser Ablation Proteinaktivität, um ein passives endogenen Ausdruck. Ein solches Ergebnis ist höchst wünschenswert, in Situationen, wo eine vollständige Beseitigung der Proteinaktivität zu embryonalen Tödlichkeit führt, stark begrenzen jeder Untersuchung um Genfunktion in einer live Maus zu untersuchen. Zweitens ermöglicht die Präsenz des Systems der TetO Transgen Aktivierung nur in Anwesenheit eines Antibiotikums, die für eine effiziente und reversible Kontrolle der Transgen-Aktivität ermöglicht. So durch Beendigung der Antibiotika-Administration, die transgenen System kann deaktiviert werden, und ein normaler RB1 Ausdruck ist wieder an Ihrem Platz. Drittens kann der Veranstalter der Wahl die Spezifität des Transgens Ausdrucks abhängig. Während wir die allgegenwärtigen ROSA-CAG-Promoter für Proof of Principle gewählt haben, dürfte Platzierung des Transgens unter gewebespezifischen Promoter, Studien über die therapeutische Anwendung von diesem Transgen zu unerwünschten Transgene Ausdruck zu beschränken Methodik.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:768px;" width="769">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:255px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium, DMEM</td>
			<td style="width:228px;">GIBCO-BRL</td>
			<td style="width:119px;">11965-084</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Minimum Essential Medium Eagle, MEME&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">M8042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F2442&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Lipofectamine&#160;</td>
			<td style="width:228px;">DharmaFECT</td>
			<td style="width:119px;">T-2010-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Sal I</td>
			<td style="width:228px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11745622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">EcoRV-HF</td>
			<td style="width:228px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R3195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">NotI</td>
			<td style="width:228px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">13090730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CaspaTag&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">APT523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">DAPI</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Staurosporine</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CyQuant NF cell proliferation kit&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C35007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Retinoblastoma 1 antibody</td>
			<td style="width:228px;">Abcam</td>
			<td>Ab6075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">c-Myc antibody</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td>M5546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">b-actin</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td>A5316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ki-67&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">MA5-14520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Phallodin</td>
			<td style="width:228px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence microplate reader</td>
			<td style="width:228px;">FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Epifluorescence microscope&#160;</td>
			<td style="width:228px;">NikonEclipse80i</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:601px;">The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011.&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducible and reversible dominant-negative (dn) protein inhibition

Dominant-Negative (DN) Protein Hemmung ist eine leistungsfähige Methode, Proteinfunktion zu manipulieren und bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen Genom-basierte Ansätze. Zum Beispiel obwohl Chimären und Cre-LoxP gezielte Strategien sind am meisten benutzt, die immanente Grenzen dieser Strategien (z. B. undichte Promotoraktivität, Mosaik Cre Ausdruck usw.) erheblich eingeschränkt haben ihre Anwendung. Darüber hinaus ist eine vollständige Löschung von vielen endogenen Genen Hochkultur tödlich, macht es unmöglich, die Genfunktion in postnatale Leben zu studieren. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, haben wir erhebliche Änderungen an einem frühen Gentechnik-Protokoll und kombiniert eine Kurzversion (transgene) das Rb1-gen mit einer lysosomalen Protease procathepsin B (CB), einem DN-Maus-Modell von Rb1 generieren (CBRb). Aufgrund des Vorhandenseins von lysosomalen Protease werden die gesamten CB-RB1-Fusionsprotein und seinen interagierenden Komplex für Proteasom-vermittelten Abbau weitergeleitet. Darüber hinaus ermöglicht das Vorhandensein von ein Tetracyclin-Induktor (RtTA) Element in der transgenen Konstrukt eine induzierbare und reversibel Regelung des das RB1-Protein. Das Vorhandensein eines allgegenwärtigen ROSA-CAG-Promotors im Mausmodell CBRb macht es ein nützliches Werkzeug, um vorübergehende und reversible Rb1-gen-Ablation durchführen und liefern Forscher eine Ressource für das Verständnis ihrer Tätigkeit in nahezu jedem Zelltyp wo RB1 zum Ausdruck.

Entwerfen einer DN Mutation erfordert in der Regel, eine beträchtliche Menge von Informationen über die Struktur und Funktion des POI. Im Gegensatz dazu ist die DN-Strategie hier vorgestellten besonders nützlich, wenn die strukturelle und funktionelle Informationen für die POI begrenzt ist. Wenn der POI ein Multimeric Protein ist, eine Verschmelzung von einer Untereinheit zu einer lysosomalen Protease kann dominant hemmen die montierten Multimer und unter Umständen andere Liganden du...

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Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine Dominant-negativen induzierbaren System zu entwickeln, in der kein Protein bedingt inaktiviert durch reversibel überexprimiert eine Dominant-negativen mutierte Version davon.

Induzierbaren und Reversible Dominant-Negative (DN) Protein Hemmung

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in einer Vielzahl von Bereichen zu beantworten, die eine bedingte und vorübergehende Inaktivierung eines Gens von Interesse erfordern, indem eine dominante negative Version umgekehrt über-ausdruckend ist. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie nur eine partielle Ablation in der Proteinaktivität zulässt, wodurch eine restliche endogene Expression erhalten bleibt. Obwohl wir hier die Zustandsinaktivierung von RB-Protein beschreiben, das in einer multimerischen Baugruppe funktioniert, kann diese Methode auch auf monomere Proteine angewendet werden.Umesh Pyakurel, unser Labortechniker und Co-Autor im Manuskript, wird die Verfahren demonstrieren. Zunächst können Sie NIH3T3-Zellen nach den Vorgaben des Herstellers bei 37 Grad Celsius mit 5% CO2 anbauen und dabei das empfohlene Zellkulturmedium verwenden, das 10% fetales Rinderserum enthält. Um die Zellen mit pTet-Splice- und pCMV-Tet3G-Vektoren zu kotranstranstranssektieren, mischen Sie zunächst zwei bis vier Mikroliter des lipidbasierten Transfektionsreageims pro Brunnen und einen Milliliter unvollständigen DMEM pro Brunnen in einer 15-Milliliter-Röhre und brüten fünf Minuten bei Raumtemperatur.Fügen Sie dem DMEM-Mix dieses Transfektionsreagenzs zwei bis drei Mikrogramm Plasma-DNA pro Brunnen hinzu. Mischen und inkubieren für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Fügen Sie einen Milliliter der Mischung, die DNA und das Transfektionsreagenz in DMEM enthält, zu jedem Brunnen der Sechs-Well-Platte mit NIH3T3-Zellen hinzu.Nach drei bis vier Stunden Inkubation bei 37 Grad Celsius bei 5% CO2, fügen Sie einen Milliliter komplettes Medium hinzu. Dann fügen Sie 2 Mikroliter Doxycyclin-Lager zu jedem Brunnen und markieren Sie die Platte als Plus-Doxycyclin. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5%CO2.Um die Funktionalität des TetO-DN-CB-myc6-Rb1-Konstrukts bei der Förderung der ungeplanten Zellproliferation zu bewerten, kulturen HEI-OC1-Zellen in DMEM, die 10%FBS enthalten, unter freizügigen Bedingungen. Für Zellproliferationsstudien zählen Sie die HEI-OC1-Zellen mit einem Zellzähler. Platte 10 000 HEI-OC1-Zellen pro Brunnen auf einer 96-Well-Platte in jeweils 200 Mikroliter Volumen.Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 33 Grad Celsius mit 5%CO2. Um die transgene Expression zu induzieren, fügen Sie einer Teilmenge der transfizierten HEI-OC1-Zellen ein Mikrogramm pro Milliliter Doxycyclin hinzu. Verwenden Sie die andere Teilmenge, die als Minusdoxycyclin gekennzeichnet ist, und die nicht transfizierten HEI-OC1-Zellen als Steuerelemente, und inkubieren Sie die Zellen als 33 Grad Celsius mit 10 % CO2.Um die Zellproliferation zu bewerten, 48 Stunden nach der Transfektion, entfernen Sie das Zellkulturmedium und fügen Sie 100 Mikroliter 1x 1x Farbstoffbindungslösung aus einem Zellproliferationskit zu jedem Brunnen der Mikroplatte hinzu. Folgen Sie dem Herstellerprotokoll und brüten Sie eine Stunde bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie einen Fluoreszenz-Mikroplattenleser, um die Fluoreszenzintensität jeder Probe zu messen.Um die Zellproliferation mittels Immunzytochemie weiter zu bewerten, verankern Sie die HEI-OC1-Zellen auf einem Deckglas, das in jedem Brunnen einer 12-Well-Platte in DMEM platziert ist. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 33 Grad Celsius. Am folgenden Tag kotransfieren Sie die Zellen in zwei Brunnen mit den pTet-Splice- und pCMV-Tet3G-Vektoren und führen Sie dann die Doxycyclin-Behandlung an einer gut wie mit den NIH3T3-Zellen durchgeführt.Verwenden Sie eine untransfizierte gut als Steuerung. Um die Zellen für die Ki-67-Etikettierung zu verarbeiten, fixieren Sie sie mit 4% Paraformaldehyd in PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Danach dreimal mit eiskaltem PBS für jeweils fünf Minuten waschen.0,25% nichtionisches Reinigungsmittel in PBS hinzufügen und 10 Minuten brüten. Wiederholen Sie die Wäsche dreimal in PBS für jeweils fünf Minuten. Verwenden Sie 10%serum, um die Zellen zu blockieren.In einer befeuchteten Kammer für eine Stunde bei Raumtemperatur. Fügen Sie 500 Mikroliter Ki-67 Primärantikörper hinzu und brüten über Nacht bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die Zellen dreimal in PBS für jeweils fünf Minuten.Fügen Sie einen Milliliter des sekundären Antikörpers hinzu und inkubieren Sie die Zellen für eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nach dem Entfernen der sekundären Antikörperlösung die Zellen im Dunkeln dreimal für fünf Minuten in PBS waschen. Um die HEI-OC1-Zellen mit Phalloidin zu kennzeichnen, inkubieren Sie sie in 1:200 Phalloidin für 30 Minuten bei Raumtemperatur.Um die Zellkerne zu beschriften, inkubieren Sie die Zellen mit fünf Mikrogramm pro Milliliter DAPI für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Lieferung der transgenen Mäuse, Genotyp die Welpen mit einem Primer-Set spezifisch für die CBRb1-Fusionsregion, wie in der Handschrift beschrieben. Züchten Sie erwachsene TetO-DN-CB-myc6-Rb1-Mäuse an die ROSA-CAG-rtTA und Tetrecyclin-Induktorlinie, um experimentelle DN-CBRb-Mäuse zu erzeugen, und genotypieren Sie ihre Nachkommen, wie im Manuskript beschrieben.NIH3T3 exprimiert kein endogenes RB1-Protein, daher ist die robuste RB1-Expression, die hier zu sehen ist, auf die Transgeninduktion in Gegenwart von Dox zurückzuführen, jedoch nicht in seiner Abwesenheit, was die effiziente Aktivierung des TetO-DN-CB-myc6-Rb1-Mix-RB1-Konstrukts bestätigt. Im Gegensatz dazu haben HEK293-Zellen eine endogene RB1-Expression. Die Zugabe von Doxycyclin führte zur TetO-DN-CB-myc6-Rb1-Aktivierung und RB1-Down-Regulierung.Der RB1-Ausdruck wurde 21 Stunden nach der Entfernung von Doxycyclin aus den Medien wieder aufgenommen. HEI-OC1-Zellen, die mit den gleichen Vektoren kotransfiziert wurden, zeigten eine bescheidene, aber signifikante Zunahme der Zellzahl nach der Doxycyclin-Behandlung im Vergleich zu transfizierten Zellen, die nicht mit Doxycyclin behandelt wurden, und den untransfizierten Zellen. Fluoreszierende In-situ-Hybridisierung bestätigte die genomische Insertion von TetO-DN-CB-myc6-RB1-Transgen bei Mäusen.Es gab einen anfänglichen Anstieg der gesamten RB1-Proteinexpression in Cochlea der transgenen Mäuse, die drei Tage lang mit Doxycyclin behandelt wurden, im Vergleich zur Kontrollgruppe. In Gruppen, die sieben und zehn Tage lang mit Doxocyclin behandelt wurden, wurde jedoch eine signifikante Verringerung der RB1-Expression beobachtet. Unabhängig vom analysierten Gewebe wurde eine signifikante Reduktion des RB1-Proteins bei transgenen Mäusen beobachtet, die mit Doxocyclin behandelt wurden, jedoch nicht in der Kontrollgruppe, was die Effizienz des TetO-DN-CB-myc6-RB1-Konstrukts bestätigte.Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, zu überprüfen, ob jedes der Kodierungselemente des Transgens im Rahmen miteinander ist. Wenn die in diesem Bericht beschriebenen Kodierungsregionen Kathepsin B und Retinoblastom zufällig ablätsgemäß miteinander verbunden wären, würde dies nicht das beabsichtigte Fusionsprotein ergeben. Daher muss die DNA-Sequenzverifizierung durchgeführt werden, bevor das Transgen in einzellige Mausembryonen injiziert wird.Nach diesem Verfahren kann der allgegenwärtige CAG-Promotor durch spezifische Promotoren ersetzt werden, um die Genfunktion auf spezifische Weise zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Induzierbares T7-RNA-Polymerase-vermitteltes Multigen-Expressionssystem, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Forschung

Genetik

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Die Erzeugung von Fluorescent Protein Fusions in<em&gt; Candida</em&gt; Arten

Candida species, prevalent colonizers of the intestinal and genitourinary tracts, are the cause of the majority of invasive fungal infections in humans. ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Steuerbare Ionenkanal-Expression durch induzierbare Transiente Transfektion

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Mikroinjektion CRISPR/Cas9 Protein in Channel Catfish, Ictalurus Punctatus, Embryonen für Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Konstitutive und induzierbaren Systeme für genetische In Vivo Änderung der Maus Hepatozyten mit hydrodynamischen Tail Vene Injektion

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identifikation der homologen Rekombinationsereignisse in embryonalen Stammzellen der Maus mit Southern Blotting und Polymerase-Kettenreaktion

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Induzierbaren, Zelle Typ-spezifischen Ausdruck in Arabidopsis Thaliana durch LhGR-vermittelten Trans-Aktivierung

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Massenspektrometrie-basierte Proteomics Analysen mithilfe der OpenProt-Datenbank zu enthüllen neue Proteine übersetzt aus dem nicht-kanonischen Open Reading Frames

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

Ein Assay zur Quantifizierung der Protein-RNA-Bindung in Bakterien

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

In Vitro biochemische Assays mit Biotin-Etiketten zur Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...