Name: inducible and reversible dominant-negative (dn) protein inhibition
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition at JoVE.com

PCS2 + CB-Myc6 וקטור הייתה מתנת הורביץ מרשל (אוניברסיטת וושינגטון, סיאטל, וושינגטון, ארה ב). התאים היי-OC1 נמסרו באדיבות בידי Fedrico Kalinec (גפן דוד בית ספר לרפואה, אוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס, קליפורניה, ארה). תמיכה טכנית סופק על ידי UNMC העכבר הגנום הנדסה הליבה (Gurumurthy רדיו אזרחי, דון פוגע, רולן הקואדרוס) והמתקן קרייטון אוניברסיטת משולב ביו הדמיה (ריצ'רד Hallworth, ג'ון Billheimer). הנדסה הגנום העכבר UNMC נתמכה על ידי פרס פיתוח מוסדיים (מושג) מ- NIH/NIGMS, להעניק מספר P20 GM103471. מתקן משולב הדמיה ביו נתמכה על ידי בית הספר אוניברסיטת קרייטון של רפואה ומענקים GM103427 ו- GM110768 מ NIH/NIGMS. המתקן נבנה עם תמיכה של מענקים של המרכז הארצי עבור משאבים למחקר (RR016469), את NIGMS (GM103427). הקווים עכבר הנוצר במחקר זה היו נשמרים במתקן משאבים בעלי חיים של אוניברסיטת קרייטון, תשתית אשר היה משופר באמצעות מענק על ידי NIH/NCRR G20RR024001. עבודה זו קיבלה בעבר תמיכה באמצעות של NIH/NCRR 5P20RR018788-/ NIH/NIGMS 8P20GM103471 COBRE להעניק (סמית ' ד שלי) NIH/orip ב R21OD019745-01A1 (S.M.R.-ס), של המתעוררים המחקר מענק של הקרן לבריאות שמיעה (ס' טרנג). התוכן של המחקר הזה הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים.

דור של העכבר CBRb הטרנסגניים כל טיפול בבעלי חיים ואת ניסויים הקשורים המחקר היו אושרה על ידי קרייטון אוניברסיטת מוסדיים חיה טיפול שימוש הוועדה (IACUC), המבוצעת על ידי הנחיות שלהם.
1. הטרנסגניים CB-Myc6-Rb1 לבנות
הערה: השיבוט של CBRb לתוך וקטור pTet_Splice נעשה תהלי...

<ol>
	<li>Li, F. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+MyoD+homodimer+formation+demonstrated+by+a+general+method+of+dominant+negative+mutation+employing+fusion+with+a+lysosomal+protease.">Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease.</a> Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).</li><li>Tarang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+retinoblastoma+(rb)1-inducible+dominant-negative+(DN)+mouse+model.">Generation of a retinoblastoma (rb)1-inducible dominant-negative (DN) mouse model.</a> Frontiers Cellular Neuroscience. 9 (52), (2015).</li><li>Kominami, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+selective+role+of+cathepsins+B+and+D+in+the+lysosomal+degradation+of+endogenous+and+exogenous+proteins.">The selective role of cathepsins B and D in the lysosomal degradation of endogenous and exogenous proteins.</a> FEBS Letters. 287 (1-2), 189-192 (1991).</li><li>Cortellino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+ciliogenesis,+embryonic+lethality+and+severe+impairment+of+the+sonic+hedgehog+pathway+caused+by+inactivation+of+the+mouse+complex+A+intraflagellar+transport+gene+Ift122/Wdr10,+partially+overlapping+with+the+DNA+repair+gene+Med1/Mbd4.">Defective ciliogenesis, embryonic lethality and severe impairment of the sonic hedgehog pathway caused by inactivation of the mouse complex A intraflagellar transport gene Ift122/Wdr10, partially overlapping with the DNA repair gene Med1/Mbd4.</a> Developmental Biology. 325 (1), 225-237 (2009).</li><li>Ferreira, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+embryonic+lethality+of+H+ferritin+gene+deletion+in+mice.">Early embryonic lethality of H ferritin gene deletion in mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3021-3024 (2000).</li><li>Lee, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+deficient+for+rb+are+nonviable+and+show+defects+in+neurogenesis+and+haematopoiesis.">Mice deficient for rb are nonviable and show defects in neurogenesis and haematopoiesis.</a> Nature. 359 (6393), 288-294 (1992).</li><li>Turlo, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+cre-mediated+recombination+in+mice+does+not+result+in+protein+loss.">When cre-mediated recombination in mice does not result in protein loss.</a> Genetics. 186 (3), 959-967 (2010).</li><li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+cell-cycle+reentry+and+cell+death+after+acute+inactivation+of+the+retinoblastoma+gene+product+in+postnatal+cochlear+hair+cells.">Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+knockout+mouse+model+of+retinoblastoma.">The first knockout mouse model of retinoblastoma.</a> Cell Cycle. 3 (7), 952-959 (2004).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletions+of+retinoblastoma+1+(Rb1)+and+its+repressing+target+S+phase+kinase-associated+protein+2+(Skp2)+are+synthetic+lethal+in+mouse+embryogenesis.">Deletions of retinoblastoma 1 (Rb1) and its repressing target S phase kinase-associated protein 2 (Skp2) are synthetic lethal in mouse embryogenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10201-10209 (2016).</li><li>Yamasaki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+E2F-1+reduces+tumorigenesis+and+extends+the+lifespan+of+Rb1(+/-)+mice.">Loss of E2F-1 reduces tumorigenesis and extends the lifespan of Rb1(+/-) mice.</a> Nature Genetics. 18 (4), 360-364 (1998).</li><li>Li, F. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+a+dominant+negative+retinoblastoma+protein+(RB)+inhibiting+satellite+myoblast+differentiation+implies+an+indirect+interaction+between+MyoD+and+RB.">Selection of a dominant negative retinoblastoma protein (RB) inhibiting satellite myoblast differentiation implies an indirect interaction between MyoD and RB.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5129-5139 (2000).</li><li>Pitkanen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+human+retinoblastoma+gene+product+in+mouse+fibroblasts:+Effects+on+cell+proliferation+and+susceptibility+to+transformation.">Expression of the human retinoblastoma gene product in mouse fibroblasts: Effects on cell proliferation and susceptibility to transformation.</a> Experimental Cell Research. 207 (1), 99-106 (1993).</li><li>Chano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+abundance+of+RB1CC1+contributes+to+the+non-proliferating+enlarged+cell+phenotype+through+both+RB1+maintenance+and+TSC1+degradation.">Neuromuscular abundance of RB1CC1 contributes to the non-proliferating enlarged cell phenotype through both RB1 maintenance and TSC1 degradation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 18 (3), 425-432 (2006).</li><li>Kole, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+therapeutics:+Beyond+RNA+interference+and+antisense+oligonucleotides.">RNA therapeutics: Beyond RNA interference and antisense oligonucleotides.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 11 (2), 125-140 (2012).</li><li>Yamamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ons+and+offs+of+inducible+transgenic+technology:+A+review.">The ons and offs of inducible transgenic technology: A review.</a> Neurobiology of Disease. 8 (6), 923-932 (2001).</li><li>Houdebine, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+animal+models+in+biomedical+research.">Transgenic animal models in biomedical research.</a> Methods in Molecular Biology. 360, 163-202 (2007).</li><li>Brehm, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoblastoma+protein+recruits+histone+deacetylase+to+repress+transcription.">Retinoblastoma protein recruits histone deacetylase to repress transcription.</a> Nature. 391 (6667), 597-601 (1998).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E2F-HDAC+complexes+negatively+regulate+the+tumor+suppressor+gene+ARHI+in+breast+cancer.">E2F-HDAC complexes negatively regulate the tumor suppressor gene ARHI in breast cancer.</a> Oncogene. 25 (2), 230-239 (2006).</li><li>Magnaghi-Jaulin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoblastoma+protein+represses+transcription+by+recruiting+a+histone+deacetylase.">Retinoblastoma protein represses transcription by recruiting a histone deacetylase.</a> Nature. 391 (6667), 601-605 (1998).</li></ol>

כדי לעקוף את המגבלות המשויך אסטרטגיות הטרנסגניים מסורתיים, חיפשנו לייצר דגם העכבר שבו פוי אנדוגני יכולה להיות מותנית מומת על ידי overexpressing צורה מוטציה DN של זה בצורה ייתכן. כדי לבטל את הפונקציה של POIs אנדוגני, היו מספר אפשרויות המוצע15,16,17. יש ?...

רוב הגישות מכוון ablations גנים וחלבונים להסתמך על תהליכים קבועים, אשר בדרך כלל להוביל חיסול מוחלט או חיתוך של ג'ין, רצפי RNA או החלבון עניין (פוי). המטרה הכוללת של שיטה זו הוא מהנדס חלבון רקומביננטי לבטל את הפונקציה של אנדוגני, פראי-סוג חלבון. יש וביקרה ואנו בנגיעות של אסטרטגיה אלטרנטיבית1,2, מה שמאפשר עבור אבלציה זמני של נקודת משחק לחץ באמצעות עיכוב DN. שיטה זו פועלת multimeric וגם פפטידים monomeric אך היא המתאימה ביותר עבור חלבונים שפועלים בהרכבה multimeric.
השיטה מורכבת פיוזינג lysosomal פרוטאז CB יחידת משנה של multimeric פוי (CB פיוז'ן מורכבים). פיוז'ן CB תוצאות מורכבות יכול לקיים אינטראקציה עם proteolytically לעכל החלבון אנדוגני או להסיט את המתחם כולו CB-פוי ליזוזום להיות מפורק3. יתר על כן, שילוב של פיוז'ן CB מורכבים עם הטבע inducible של מערכת ההפעלה תעתיק שבשליטת טטרציקלין (TetO) מאפשר ביטוי inducible ומבוקר transgene ב אופנה הפיך2. למרות שימושי בנסיבות רבות, מחיקה מלאה של גנים או חלבונים ויוו יכול לגרום קטלני4,5,6. באופן דומה, מחיקה רקמות ספציפיות, מותנה של כמה גנים או חלבונים באמצעות מערכת Cre/סלומון לא יכול להיות ישירה, כמו, בסופו של דבר, תוביל לאובדן תמידי של אלמנטים קריטיים גנומית7. לפיכך, בהתאם ג'ין או פוי, וגם יהיה יעיל במתן מודל שימושי עבור מחקרים מאוחרים יותר, במיוחד של הגנים או של חלבונים פונקציונליים מחקרים בעכברים כמחנכת ומבוגרים מאוחר.
כדי לעקוף בעיות הקשורות גישות כאלה לספק הוכחה של עקרון על היעילות של השיטה המוצעת, בחרנו לבחון את השיטה המובאת כאן על ידי יצירת גירסה DN מותנה של החלבון 1 רטינובלסטומה (RB1). מספר אפשרויות להיות המוצע8,9,10 לבטל את הפונקציה של אנדוגני RB1; עם זאת, כולן בפני חלק מהמגבלות באותו שנדונו לעיל: germline קבוע מחיקה של RB1 embryonically קטלני, והוא, בקנה אחד עם תפקידו משתיק קול הגידול, קבע RB1 מחיקה מותנה שמוביל מגוון רחב של גידולים11. אף-על-פי גירסת DN RB1 לא נראה להתרחש באופן טבעי, חלופה טובה יותר האסטרטגיות הזמינות כעת צריך לאפשר איון חנותם מבוקרת של RB1 אנדוגני ולספק מנגנון חלופי לשחזור בסופו של דבר שלה פונקציה. בסיס כזה מבנה תוארה לפני למעלה משני עשורים1. עם זאת, בשל מגבלות טכנולוגיות, זה חסרה מנגנון הבקרה transgene ההפעלה, התגובה של רקמות ירידה לפרטים. מחקר זה הוא הראשון כדי לשלב את האלגנטיות דוקסילין (Dox)-תלוי תעתיק המערכת עם הבונה מהונדס מהונדס של חלבונים CB, Rb1 פרוטאז lysosomal. המודל העכבר CBRb המתקבל מאפשר RB1 בתיווך Dox מוסדר באופן זמני תקנה2. היתרון של שימוש כזה מבוסס פרוטאום בגישה ללמוד ג'ין פונקציה היא כי זה יכול להיות מאומץ עבור ג'ין בכל עניין, עם מידע מינימלי על פעילותה.
האסטרטגיה המוצעת DN transgene מציע יתרונות רבים על פני הגישות המסורתיות. ראשית, עיכוב חלבונים DN מוביל רק אבלציה חלקית בפעילות חלבון, וכך לשמר ביטוי אנדוגני שיורית. כזו כ"בלתי רצוי מאוד במצבים איפה חיסול מוחלט של פעילות החלבון מוביל lethality עובריים, במידה רבה להגביל חקירה כלשהי ללמוד ג'ין פונקציית עכבר חי. שנית, הנוכחות של מערכת TetO מאפשרת הפעלת transgene רק בנוכחות אנטיביוטיקה, מה שמאפשר עבור פקד יעיל של הפיכה של הפעילות transgene. לפיכך, על ידי חדל המינהל לאנטיביוטיקה, ניתן לבטל את הפעלתם את המערכת הטרנסגניים, ביטוי RB1 נורמלי הוא למקום. שלישית, יחודיות של הביטוי transgene יכול להשתנות בהתאם האמרגן של הבחירה. בעוד שבחרנו את המקדם רוזה-חטיבתי בכל מקום על הוכחה של עקרון, הצבת את transgene תחת מקדם רקמות ספציפיות סביר להגביל את הביטוי transgene לא רצויים וכדי להקל על מחקרים על היישום טיפולית של transgene הזה מתודולוגיה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:768px;" width="769">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:255px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium, DMEM</td>
			<td style="width:228px;">GIBCO-BRL</td>
			<td style="width:119px;">11965-084</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Minimum Essential Medium Eagle, MEME&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">M8042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F2442&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Lipofectamine&#160;</td>
			<td style="width:228px;">DharmaFECT</td>
			<td style="width:119px;">T-2010-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Sal I</td>
			<td style="width:228px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11745622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">EcoRV-HF</td>
			<td style="width:228px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R3195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">NotI</td>
			<td style="width:228px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">13090730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CaspaTag&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">APT523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">DAPI</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Staurosporine</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CyQuant NF cell proliferation kit&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C35007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Retinoblastoma 1 antibody</td>
			<td style="width:228px;">Abcam</td>
			<td>Ab6075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">c-Myc antibody</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td>M5546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">b-actin</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td>A5316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ki-67&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">MA5-14520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Phallodin</td>
			<td style="width:228px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence microplate reader</td>
			<td style="width:228px;">FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Epifluorescence microscope&#160;</td>
			<td style="width:228px;">NikonEclipse80i</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:601px;">The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011.&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducible and reversible dominant-negative (dn) protein inhibition

דומיננטה-שלילי (DN) חלבון עיכוב היא שיטה חזקה לתמרן החלבון פונקציה, ומציע מספר יתרונות על גישות אחרות מבוסס גנום. לדוגמה, למרות chimeric ו- Cre-LoxP אסטרטגיות מיקוד היה בשימוש נרחב, המגבלות מהותי של אסטרטגיות אלו (קרי, פעילות קדם דולפים, ביטוי Cre פסיפס, וכו ') שיש באופן משמעותי מוגבלת שלהם יישום. יתר על כן, מחיקה מלאה של גנים רבים אנדוגני הוא embryonically קטלני, ואי אפשר ללמוד פונקציה ג'ין בחיים לאחר הלידה. לטפל באתגרים אלה, יש שינויים משמעותיים כדי פרוטוקול הנדסה גנטית מוקדמת ואנו בשילוב גרסה מקוצרת (הטרנסגניים) של הגן Rb1 פרוטאז lysosomal procathepsin B (CB), כדי ליצור מודל העכבר DN של Rb1 (CBRb). בשל נוכחותם של פרוטאז lysosomal, החלבון פיוז'ן CB-RB1 שלם ומורכב שמעצבת שלה מנותבות עבור בתיווך פרוטאוזום השפלה. יתר על כן, הנוכחות של יסוד משרן (rtTA) טטרציקלין הבונה הטרנסגניים מאפשר ויסות inducible והפיך החלבון RB1. הנוכחות של מקדם רוזה-חטיבתי בכל מקום במודל עכבר CBRb הופכת כלי שימושי כדי לבצע אבלציה ג'ין Rb1 ארעי והפיך ולספק חוקרים משאב להבנת פעילות שלה כמעט בכל סוג תא איפה בא לידי ביטוי RB1.

באופן כללי, עיצוב מוטציה DN דורש כמות ניכרת של מידע על המבנה והתפקוד של הנקו. לעומת זאת, האסטרטגיה DN המוצג כאן הוא שימושי במיוחד בעת המידע המבני ופונקציונלי עבור הנקו מוגבל. אם הנקו חלבון multimeric, פיוז'ן של יחידת משנה אחת כדי פרוטאז lysosomal דומיננטית יכול לעכב את multimer שהורכבו ו, ?...

Watch this Scientific Journal Video about Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition at JoVE.com

Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition

כאן אנו מציגים פרוטוקול לפתח מערכת inducible דומיננטה-שלילי, שבו כל חלבון יכול להיות מותנה מומת על ידי הפיכה overexpressing גרסה מוטציה דומיננטית-שלילי של זה.

עיכוב חלבונים inducible והפיך דומיננטי שלילי (DN)

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...

שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח במגוון רחב של תחומים הדורשים אי-הפעלה מותנית וחולפת של גן מעניין על-ידי הבעת יתר של גרסה שלילית דומיננטית שלו. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת רק אבלציה חלקית בפעילות החלבון, ובכך, שמירה על ביטוי אנדוגני שיורית. אמנם, כאן אנו מתארים את חוסר ההפעלה של חלבון RB, אשר פועל בהרכבה רב-מרתית, מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת גם חלבונים מונומריים.אומש פייקורל, טכנאי המעבדה שלנו וממחברי שותף בכתב היד ידגימו את הנהלים. כדי להתחיל, לגדל תאי NIH3T3, בעקבות מפרטי הספק, ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2, באמצעות מדיום תרבות התא המומלץ המכיל 10% סרום חזיר עוברי. כדי להדביק את התאים באמצעות pTet-Splice ו- pCMV-Tet3G וקטורים, תחילה לערבב שניים עד ארבעה microliters של רייגנט transfection מבוססי השומנים לגם, ומיליליטר אחד של DMEM שלם לגם בצינור 15 מיליליטר, ודגירה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.הוסף שניים עד שלושה מיקרוגרם של דנ"א פלזמה לגם לתערובת DMEM של ריין transfection זה. מערבבים ו מודגרים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף מיליליטר אחד של התערובת המכילה DNA ואת reagent transfection ב DMEM לכל באר של צלחת שש באר עם תאי NIH3T3.לאחר שלוש עד ארבע שעות של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2, להוסיף מיליליטר אחד של מדיום שלם. לאחר מכן, להוסיף 2 microliters של מלאי דוקסיציקלין לכל באר ולסמן את הצלחת כמו פלוס דוקסיציקלין. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.כדי להעריך את הפונקציונליות של מבנה TetO-DN-CB-myc6-Rb1 בקידום התפשטות תאים לא מתוכננת, תאי HEI-OC1 תרבותיים ב- DMEM המכילים 10%FBS, בתנאים מתירניים. עבור מחקרים על התפשטות תאים, ספור את תאי HEI-OC1 באמצעות מונה תאים. לוח 10, 000 תאי HEI-OC1 ל באר על צלחת 96 באר ב 200 microliters של נפח כל אחד.דגירה התאים במהלך הלילה ב 33 מעלות צלזיוס עם 5% CO2. כדי לגרום לביטוי טרנסג'נדר, הוסף מיקרוגרם אחד למיליליטר של דוקסיציקלין לתת-קבוצה של תאי HEI-OC1 מנוקד. השתמש בקבוצה המשנית האחרת המסווה כ- minus-doxycycline ותאי HEI-OC1 שאינם מנוקד כפקדים, והדרגר את התאים כ- 33 מעלות צלזיוס עם 10%CO2.כדי להעריך את התפשטות התאים, 48 שעות לאחר ההטמקה, הסר את מדיום תרבות התאים והוסף 100 מיקרוליטרים של פתרון כריכת צבע 1x מערכת התפשטות תאים לכל באר של המיקרו-צלחת. בצע את פרוטוקול היצרן ואת הדגירה במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס. השתמש בקורא מיקרופלסטיק פלואורסצנטי כדי למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות של כל מדגם.כדי להעריך עוד יותר את התפשטות התא באמצעות אימונוציטוכימיה, צלחת תאי HEI-OC1 על זכוכית כיסוי להציב בכל באר של צלחת 12 באר ב DMEM. דגירה התאים לילה ב 33 מעלות צלזיוס. ביום שלמחרת, cotransfect לתאים בשתי בארות עם pTet-Splice ואת וקטורים pCMV-Tet3G, ולאחר מכן לבצע את הטיפול דוקסיציקלין על אחד גם נעשה עם תאי NIH3T3.השתמש אחד לא מושלם גם כמו פקד. כדי לעבד את התאים לתיוג Ki-67, תקן אותם עם 4%paraformaldehyde ב- PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף אותם שלוש פעמים עם PBS קר כקרח במשך חמש דקות כל אחד.הוסיפו 0.25% חומר ניקוי לא יוני ב-PBS, והדקירה במשך 10 דקות. חזור על לשטוף שלוש פעמים PBS במשך חמש דקות כל אחד. השתמש בסרום 10%כדי לחסום את התאים.בתא לח למשך שעה בטמפרטורת החדר. מוסיפים 500 מיקרוליטרים של הנוגדן העיקרי של Ki-67 ו דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס. לשטוף את התאים שוב שלוש פעמים PBS במשך חמש דקות כל אחד.מוסיפים מיליליטר אחד של הנוגדן המשני ומדרגים את התאים במשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר הסרת פתרון הנוגדנים המשני, לשטוף את התאים שוב שלוש פעמים במשך חמש דקות PBS בחושך. כדי לתייג את תאי HEI-OC1 עם פאלודין, דגירה אותם 1:200 פאלודין במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.כדי לתייג את גרעיני התא, דגירה התאים עם חמישה מיקרוגרם למיליליטר של DAPI במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מסירת העכברים הטרנסג'נדרים, גנוטיפ הגורים באמצעות סט פריימר ספציפי לאזור ההיתוך CBRb1 כמתואר בכתב היד. לגדל בוגרים TetO-DN-CB-myc6-Rb1 עכברים כדי ROSA-CAG-rtTA ו tetrecycline inducer קו כדי ליצור עכברים ניסיוניים DN-CBRb, ו genotype צאצאיהם כמתואר בכתב היד.NIH3T3 אינו מבטא חלבון RB1 אנדוגני, כך ביטוי RB1 חזק לראות כאן נובע אינדוקציה מהומר בנוכחות דוק, אבל לא בהיעדרו, המאשר את ההפעלה היעילה של TetO-DN-CB-myc6-Rb1 לערבב RB1 לבנות. לעומת זאת, לתאי HEK293 יש ביטוי RB1 אנדוגני. התוספת של דוקסיציקלין הובילה להפעלת TetO-DN-CB-myc6-Rb1 ורגולציה למטה RB1.ביטוי RB1 חודש 21 שעות לאחר שהדוקסיציקלין הוסר מהמדיה. תאי HEI-OC1 המופקים באותם וקטורים, הציגו עלייה צנועה אך משמעותית במספר התאים בעקבות טיפול דוקסיציקלין בהשוואה לתאים מנוטרלים שאינם מטופלים ב דוקסיציקלין, והתאים הלא סלולים. פלואורסצנט בהכלאה סיטו אישר את החדרת הגנומי של TetO-DN-CB-myc6-RB1 מהמר בעכברים.הייתה עלייה ראשונית בביטוי החלבון הכולל של RB1 ב cochlea של העכברים המהוהרים שטופלו ב דוקסיציקלין במשך שלושה ימים בהשוואה לקבוצת הביקורת. עם זאת, בקבוצות שטופלו בדוקסוסיקלין במשך שבעה ו -10 ימים, נצפתה ירידה משמעותית בביטוי RB1. ללא קשר לרקמה שנותחה, ירידה משמעותית בחלבון RB1 נצפתה בעכברים מהודקים שטופלו בדוקסוסיקלין, אך לא בקבוצת הביקורת, המאשרת את יעילות המבנה TetO-DN-CB-myc6-RB1.בעת ניסיון לבצע הליך זה, חשוב לוודא שכל אחד מרכיבי הקידוד של הטרנסג'ין נמצאים במסגרת זה עם זה. אם אזורי הקידוד של Cathepsin B ו רטינובלסטומה המתוארים בדו"ח זה היו, במקרה, מחוברים מחוץ למסגרת, זה לא היה מניב את חלבון ההיתוך המיועד. לכן, אימות רצף DNA חייב להיעשות לפני הזרקת הטרנסג'ין לעוברים עכבר חד-תאיים.בעקבות הליך זה, מקדם CAG בכל מקום יכול להיות מוחלף עם מקדמים ספציפיים על מנת ללמוד תפקוד גנים באופן ספציפי של התא.

Research

JoVE Journal

Genetics

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

T7 RNA פולימראז בתיווך Multigene הביטוי מערכת, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

הדור של Fusions חלבון פלורסנט<em&gt; קנדידה</em&gt; מינים

Candida species, prevalent colonizers of the intestinal and genitourinary tracts, are the cause of the majority of invasive fungal infections in humans. ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

ביטוי ערוץ יון לשליטה באמצעות Transfection ועין מתנהל חלוף

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection CRISPR/Cas9 החלבון לתוך ערוץ שפמנון, Ictalurus punctatus, העוברים עבור ג'ין עריכה

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

מערכות מכוננת Inducible עבור שינוי גנטי In Vivo של העכבר Hepatocytes באמצעות הזרקת וריד הזנב Hydrodynamic

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

זיהוי של אירועי רקומבינציה הומולוגית בתאי גזע עובריים בעכבר באמצעות סופג הדרומי ואת תגובת שרשרת פולימראזית

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, תאים ייחודיים לסוג ביטוי תודרנית לבנה בתיווך דרך LhGR טרנס-הפעלה

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

ניתוחים פרוטאומיקס מבוססי ספקטרומטר מסה משימוש במסד הנתונים OpenProt לחשוף את הרומן חלבונים מתורגם ממסגרות קאנונית קריאה פתוחה

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

שיטת בדיקת מעטפת חלבון-RNA כריכת חיידקים

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

בתוך מבחנה ביוכימית באמצעות תוויות Biotin ללמוד חלבון-גרעין חומצה אינטראקציות

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...