Name: inducible and reversible dominant-negative (dn) protein inhibition
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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pCS2 + सीबी-Myc6 वेक्टर मार्शल Horwitz (वाशिंगटन, सिएटल, WA, संयुक्त राज्य अमेरिका के विश्वविद्यालय) से एक उपहार था । ऊँ-OC1 कोशिकाओं को Fedrico Kalinec (डेविड Geffen स्कूल ऑफ मेडिसिन, UCLA, लॉस एंजिल्स, CA, यूएसए) द्वारा प्रदान किया गया था । तकनीकी सहायता UNMC माउस जीनोम इंजीनियरिंग कोर (C.B. गुरुमूर्ति, डॉन दूसर, रोलेन Quadros) और ट्विटर विश्वविद्यालय एकीकृत जैव चिकित्सा इमेजिंग सुविधा (रिचर्ड Hallworth, जॉन Billheimer) द्वारा प्रदान किया गया था । UNMC माउस जीनोम इंजीनियरिंग NIH/NIGMS, अनुदान संख्या P20 GM103471 से एक संस्थागत विकास पुरस्कार (आइडिया) द्वारा समर्थित किया गया था । एकीकृत बायोमेडिकल इमेजिंग सुविधा का समर्थन ट्विटर विश्वविद्यालय के स्कूल ऑफ मेडिसिन और पलाश GM103427 और GM110768 से NIGMS NIH/ इस सुविधा का निर्माण नेशनल सेंटर फॉर रिसर्च रिसोर्स (RR016469) और NIGMS (GM103427) से अनुदान से समर्थन के साथ किया गया था । इस अध्ययन में उत्पंन माउस लाइनों ट्विटर विश्वविद्यालय के पशु संसाधन सुविधा, जिसका बुनियादी ढांचा NIH/NCRR G20RR024001 द्वारा एक अनुदान के माध्यम से सुधार किया गया था पर बनाए रखा गया था । यह काम एक NIH के माध्यम से पिछले समर्थन प्राप्त/NCRR 5P20RR018788-/NIH/NIGMS 8P20GM103471 COBRE अनुदान (शेली डी स्मिथ को), NIH/ORIP R21OD019745-01A1 (S.M.R.-एस.), और एक उभरती अनुसंधान अनुदान सुनवाई स्वास्थ्य फाउंडेशन से (एस जलतरंग) । इस शोध की सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

ट्रांसजेनिक CBRb माउस और सभी पशु देखभाल और अध्ययन के साथ जुड़े प्रयोगों की पीढ़ी ट्विटर विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित और उनके दिशा निर्देशों के द्वारा किया गया ।...

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	<li>Li, F. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+MyoD+homodimer+formation+demonstrated+by+a+general+method+of+dominant+negative+mutation+employing+fusion+with+a+lysosomal+protease.">Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease.</a> Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).</li><li>Tarang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+retinoblastoma+(rb)1-inducible+dominant-negative+(DN)+mouse+model.">Generation of a retinoblastoma (rb)1-inducible dominant-negative (DN) mouse model.</a> Frontiers Cellular Neuroscience. 9 (52), (2015).</li><li>Kominami, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+selective+role+of+cathepsins+B+and+D+in+the+lysosomal+degradation+of+endogenous+and+exogenous+proteins.">The selective role of cathepsins B and D in the lysosomal degradation of endogenous and exogenous proteins.</a> FEBS Letters. 287 (1-2), 189-192 (1991).</li><li>Cortellino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+ciliogenesis,+embryonic+lethality+and+severe+impairment+of+the+sonic+hedgehog+pathway+caused+by+inactivation+of+the+mouse+complex+A+intraflagellar+transport+gene+Ift122/Wdr10,+partially+overlapping+with+the+DNA+repair+gene+Med1/Mbd4.">Defective ciliogenesis, embryonic lethality and severe impairment of the sonic hedgehog pathway caused by inactivation of the mouse complex A intraflagellar transport gene Ift122/Wdr10, partially overlapping with the DNA repair gene Med1/Mbd4.</a> Developmental Biology. 325 (1), 225-237 (2009).</li><li>Ferreira, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+embryonic+lethality+of+H+ferritin+gene+deletion+in+mice.">Early embryonic lethality of H ferritin gene deletion in mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3021-3024 (2000).</li><li>Lee, E. 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Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+a+dominant+negative+retinoblastoma+protein+(RB)+inhibiting+satellite+myoblast+differentiation+implies+an+indirect+interaction+between+MyoD+and+RB.">Selection of a dominant negative retinoblastoma protein (RB) inhibiting satellite myoblast differentiation implies an indirect interaction between MyoD and RB.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5129-5139 (2000).</li><li>Pitkanen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+human+retinoblastoma+gene+product+in+mouse+fibroblasts:+Effects+on+cell+proliferation+and+susceptibility+to+transformation.">Expression of the human retinoblastoma gene product in mouse fibroblasts: Effects on cell proliferation and susceptibility to transformation.</a> Experimental Cell Research. 207 (1), 99-106 (1993).</li><li>Chano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+abundance+of+RB1CC1+contributes+to+the+non-proliferating+enlarged+cell+phenotype+through+both+RB1+maintenance+and+TSC1+degradation.">Neuromuscular abundance of RB1CC1 contributes to the non-proliferating enlarged cell phenotype through both RB1 maintenance and TSC1 degradation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 18 (3), 425-432 (2006).</li><li>Kole, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+therapeutics:+Beyond+RNA+interference+and+antisense+oligonucleotides.">RNA therapeutics: Beyond RNA interference and antisense oligonucleotides.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 11 (2), 125-140 (2012).</li><li>Yamamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ons+and+offs+of+inducible+transgenic+technology:+A+review.">The ons and offs of inducible transgenic technology: A review.</a> Neurobiology of Disease. 8 (6), 923-932 (2001).</li><li>Houdebine, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+animal+models+in+biomedical+research.">Transgenic animal models in biomedical research.</a> Methods in Molecular Biology. 360, 163-202 (2007).</li><li>Brehm, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoblastoma+protein+recruits+histone+deacetylase+to+repress+transcription.">Retinoblastoma protein recruits histone deacetylase to repress transcription.</a> Nature. 391 (6667), 597-601 (1998).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E2F-HDAC+complexes+negatively+regulate+the+tumor+suppressor+gene+ARHI+in+breast+cancer.">E2F-HDAC complexes negatively regulate the tumor suppressor gene ARHI in breast cancer.</a> Oncogene. 25 (2), 230-239 (2006).</li><li>Magnaghi-Jaulin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoblastoma+protein+represses+transcription+by+recruiting+a+histone+deacetylase.">Retinoblastoma protein represses transcription by recruiting a histone deacetylase.</a> Nature. 391 (6667), 601-605 (1998).</li></ol>

पारंपरिक ट्रांसजेनिक रणनीतियों के साथ जुड़े सीमाओं को दरकिनार, हम एक माउस मॉडल जिसमें एक अंतर्जात POI सशर्त एक spatiotemporal तरीके से यह की एक डीएन उत्परिवर्ती फार्म व्यक्त द्वारा निष्क्रिय किया जा सकता है उत्?...

सबसे जीन और प्रोटीन ablations पर लक्ष्य दृष्टिकोण स्थाई प्रक्रियाओं, जो आम तौर पर पूरा उन्मूलन या जीन, आरएनए दृश्यों, या ब्याज की प्रोटीन (POI) के जनचेतना के लिए नेतृत्व पर भरोसा करते हैं । इस विधि के समग्र लक्ष्य के लिए एक रिकॉमबिनेंट प्रोटीन इंजीनियर अंतर्जात, जंगली प्रकार के प्रोटीन के समारोह को समाप्त करने के लिए है । हम फिर से गौर किया है और एक वैकल्पिक रणनीति1,2, जो डीएन निषेध के माध्यम से एक POI के अस्थाई पृथक के लिए अनुमति देता है नया । इस विधि दोनों multimeric और monomeric पेप्टाइड्स के लिए काम करता है, लेकिन सबसे अच्छा प्रोटीन है कि एक multimeric विधानसभा में समारोह के लिए अनुकूल है ।
विधि एक multimeric POI (सीबी फ्यूजन परिसर) के एक उपइकाई को lysosomal को चिढ़ाने सीबी मना के होते हैं । परिणामी सीबी फ्यूजन परिसर के साथ बातचीत कर सकते हैं और proteolytically अंतर्जात प्रोटीन को पचाने या lysosome के लिए पूरे सीबी-POI जटिल हटाने के लिए3नीचा होना. इसके अलावा, टेट्रासाइक्लिन-नियंत्रित transcriptional सक्रियकरण (TetO) प्रणाली के inducible प्रकृति के साथ सीबी फ्यूजन परिसर का एक संयोजन एक inducible और एक प्रतिवर्ती फैशन2में transgene की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए अनुमति देता है । कई परिस्थितियों में उपयोगी हालांकि, vivo में जीन या प्रोटीन का पूरा विलोपन घातकता में परिणाम कर सकते हैं4,5,6. इसी तरह, ऊतक विशिष्ट, कुछ जीनों या Cre/लोक्स प्रणाली का उपयोग प्रोटीन का सशर्त विलोपन सीधा नहीं हो सकता है, के रूप में यह होगा, अंत में, महत्वपूर्ण जीनोमिक तत्वों की स्थायी हानि के लिए नेतृत्व7. इसलिए, जीन या POI पर निर्भर करता है, इन तरीकों की न तो बाद में अध्ययन, विशेष रूप से जीन ' या देर जन्मोत्तर और वयस्क चूहों में ' प्रोटीन कार्यात्मक अध्ययन के लिए एक उपयोगी मॉडल उपलब्ध कराने में प्रभावी हो जाएगा ।
इस तरह के दृष्टिकोण के साथ जुड़े समस्याओं को दरकिनार और प्रस्तावित विधि की प्रभावशीलता पर सबूत के सिद्धांत प्रदान करते हैं, हम Retinoblastoma 1 (RB1) प्रोटीन के एक सशर्त डीएन संस्करण पैदा करके यहां प्रस्तुत विधि का परीक्षण करने के लिए चुना है । अंतर्जात RB1 के कार्य को समाप्त करने के लिए कई विकल्प8,9,10 प्रस्तावित किए गए हैं; हालांकि, उन सभी के ऊपर चर्चा की ही सीमाओं में से कुछ का सामना करना पड़ा: RB1 के स्थाई germline विलोपन भ्रूण घातक है, और, अपने ट्यूमर शमन भूमिका के साथ संगत, स्थाई RB1 सशर्त विलोपन11ट्यूमर की एक किस्म की ओर जाता है । हालांकि RB1 के एक डीएन संस्करण स्वाभाविक रूप से घटित नहीं लगता है, वर्तमान में उपलब्ध रणनीतियों के लिए एक बेहतर विकल्प अंतर्जात RB1 की एक अस्थाई नियंत्रित निष्क्रियता के लिए अनुमति चाहिए और एक वैकल्पिक व्यवस्था प्रदान करने के लिए अंततः अपने बहाल समारोह. इस तरह के एक निर्माण के लिए आधार पर दो दशक पहले1वर्णित किया गया था । हालांकि, तकनीकी सीमाओं के कारण, यह transgene सक्रियण, प्रतिक्रिया, और ऊतक विशिष्टता को नियंत्रित करने के लिए एक तंत्र का अभाव है । इस अध्ययन के doxycycline (Dox) के लालित्य गठबंधन करने के लिए पहली है एक इंजीनियर ट्रांसजेनिक lysosomal के निर्माण के साथ निर्भर transcriptional प्रणाली को छेड़ो सीबी और Rb1 प्रोटीन । परिणामस्वरूप CBRb माउस मॉडल एक अस्थाई रूप से विनियमित Dox-मध्यस्थता RB1 विनियमन2के लिए अनुमति देता है । जीन फंक्शन का अध्ययन करने के लिए इस तरह के एक proteome आधारित दृष्टिकोण का लाभ यह है कि यह ब्याज की किसी भी जीन के लिए अपनाया जा सकता है, अपनी गतिविधि के बारे में न्यूनतम जानकारी के साथ.
प्रस्तावित डीएन transgene रणनीति पारंपरिक दृष्टिकोण पर कई लाभ प्रदान करता है । सबसे पहले, डीएन प्रोटीन निषेध प्रोटीन गतिविधि में केवल एक आंशिक पृथक की ओर जाता है, इस प्रकार एक अवशिष्ट अंतर्जात अभिव्यक्ति के संरक्षण । इस तरह के एक परिणाम उच्च स्थितियों में वांछनीय है जहां प्रोटीन गतिविधि का एक पूरा उंमूलन भ्रूण मृत्यु की ओर जाता है, बहुत किसी भी जांच सीमित करने के लिए एक जीवित माउस में जीन समारोह का अध्ययन । दूसरा, TetO प्रणाली की उपस्थिति केवल एक एंटीबायोटिक है, जो transgene गतिविधि के एक कुशल और प्रतिवर्ती नियंत्रण के लिए अनुमति देता है की उपस्थिति में transgene सक्रियण सक्षम बनाता है । इस प्रकार, एंटीबायोटिक प्रशासन को बंद करके, ट्रांसजेनिक प्रणाली निष्क्रिय किया जा सकता है, और एक सामांय RB1 अभिव्यक्ति जगह में वापस आ गया है । तीसरा, transgene अभिव्यक्ति की विशिष्टता पसंद के प्रमोटर के आधार पर भिंन हो सकते हैं । जब तक हमने सबूत के सिद्धांत के लिए सर्वव्यापी रोजा-सीएजी प्रमोटर चुना है, transgene को ऊतक-विशिष्ट प्रवर्तक के तहत रखकर अवांछित transgene अभिव्यक्ति को प्रतिबंधित करने और इस transgene के चिकित्सीय अनुप्रयोग पर अध्ययन की सुविधा देने की संभावना है । पद्धति.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:768px;" width="769">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:255px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium, DMEM</td>
			<td style="width:228px;">GIBCO-BRL</td>
			<td style="width:119px;">11965-084</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Minimum Essential Medium Eagle, MEME&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">M8042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F2442&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Lipofectamine&#160;</td>
			<td style="width:228px;">DharmaFECT</td>
			<td style="width:119px;">T-2010-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Sal I</td>
			<td style="width:228px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11745622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">EcoRV-HF</td>
			<td style="width:228px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R3195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">NotI</td>
			<td style="width:228px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">13090730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CaspaTag&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">APT523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">DAPI</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Staurosporine</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CyQuant NF cell proliferation kit&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C35007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Retinoblastoma 1 antibody</td>
			<td style="width:228px;">Abcam</td>
			<td>Ab6075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">c-Myc antibody</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td>M5546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">b-actin</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td>A5316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ki-67&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">MA5-14520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Phallodin</td>
			<td style="width:228px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence microplate reader</td>
			<td style="width:228px;">FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Epifluorescence microscope&#160;</td>
			<td style="width:228px;">NikonEclipse80i</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:601px;">The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011.&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducible and reversible dominant-negative (dn) protein inhibition

प्रमुख-नकारात्मक (डीएन) प्रोटीन निषेध एक शक्तिशाली करने के लिए प्रोटीन समारोह में हेरफेर विधि है और अंय जीनोम पर कई लाभ प्रदान करता है आधारित दृष्टिकोण । उदाहरण के लिए, हालांकि chimeric और Cre-LoxP लक्ष्यीकरण रणनीतियों व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है, इन रणनीतियों की आंतरिक सीमाओं (यानी, टपकाना प्रमोटर गतिविधि, मोज़ेक Cre अभिव्यक्ति, आदि) काफी प्रतिबंधित है उनके अनुप्रयोग. इसके अलावा, कई अंतर्जात जीन का एक पूरा विलोपन भ्रूण घातक है, यह असंभव जन्मोत्तर जीवन में जीन समारोह का अध्ययन करने के लिए बना । इन चुनौतियों का पता करने के लिए, हम एक प्रारंभिक आनुवंशिक इंजीनियरिंग प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण परिवर्तन किया है और एक lysosomal procathepsin (सीबी) के साथ Rb1 जीन के एक छोटे (ट्रांसजेनिक) संस्करण संयुक्त, Rb1 (CBRb) के एक DN माउस मॉडल उत्पंन करने के लिए । एक lysosomal की उपस्थिति के कारण, पूरे सीबी-RB1 फ्यूजन प्रोटीन और उसके बातचीत जटिल proteasome-मध्यस्थता क्षरण के लिए रूट कर रहे हैं । इसके अलावा, ट्रांसजेनिक निर्माण में एक टेट्रासाइक्लिन उत्प्रेरण (rtTA) तत्व की उपस्थिति RB1 प्रोटीन के एक inducible और प्रतिवर्ती विनियमन सक्षम बनाता है । CBRb माउस मॉडल में एक सर्वव्यापी रोजा-सीएजी प्रमोटर की मौजूदगी यह क्षणिक और प्रतिवर्ती Rb1 जीन पृथक को बाहर निकालने के लिए एक उपयोगी उपकरण बनाती है और शोधकर्ताओं को वस्तुतः किसी भी कोशिका प्रकार में अपनी गतिविधि को समझने के लिए एक संसाधन प्रदान करती है जहां Rb1 व्यक्त किया जाता है ।

आम तौर पर, एक डीएन उत्परिवर्तन डिजाइनिंग की संरचना और POI के समारोह के बारे में जानकारी का एक काफी राशि की आवश्यकता है । इसके विपरीत, डीएन रणनीति यहां प्रस्तुत विशेष रूप से उपयोगी है जब POI के लि?...

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Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition

यहां हम एक के लिए एक प्रमुख नकारात्मक inducible प्रणाली है, जिसमें किसी भी प्रोटीन सशर्त यह के एक प्रमुख नकारात्मक उत्परिवर्ती संस्करण व्यक्त reversibly द्वारा निष्क्रिय किया जा सकता है विकसित करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद हैं ।

Inducible और प्रतिवर्ती प्रमुख-नकारात्मक (डीएन) प्रोटीन निषेध

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...

यह विधि विभिन्न प्रकार के क्षेत्रों में महत्वपूर्ण प्रश्नों के उत्तर देने में मदद कर सकती है, जिसमें ब्याज के जीन की सशर्त और क्षणिक निष्क्रियता की आवश्यकता होती है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह प्रोटीन गतिविधि में केवल आंशिक एब्लेशन की अनुमति देता है, इस प्रकार, अवशिष्ट अंतर्जात अभिव्यक्ति को संरक्षित करता है। हालांकि, यहां हम आरबी प्रोटीन की स्थिति निष्क्रियता का वर्णन करते हैं, जो एक बहुमेरिक असेंबली में कार्य करता है, इस पद्धति को मोनोमेरिक प्रोटीन पर भी लागू किया जा सकता है।उमेश प्यारुरेल, हमारी प्रयोगशाला तकनीकी और पांडुलिपि में एक सहलेखक प्रक्रियाओं का प्रदर्शन करेंगे । शुरू करने के लिए, NIH3T3 कोशिकाओं को विकसित करें, विक्रेता के विनिर्देशों के बाद, 5% CO2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर, अनुशंसित सेल संस्कृति माध्यम का उपयोग करके जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम होता है। पीटीईटी-स्प्लिस और पीसीएमवी-टेट3जी वैक्टर का उपयोग करके कोशिकाओं को सहसंरेखित करने के लिए, पहले लिपिड-आधारित ट्रांसफेक्शन रिएजेंट के दो से चार माइक्रोलीटर को अच्छी तरह से मिलाएं, और 15 मिलीलीटर ट्यूब में अपूर्ण डीएमईएम का एक मिलीलीटर, और कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।इस ट्रांसफैक्शन रीएजेंट के डीएमईएम मिक्स में प्रति अच्छी तरह से दो से तीन माइक्रोग्राम प्लाज्मा डीएनए जोड़ें । कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए मिश्रण और इनक्यूबेट। NIH3T3 कोशिकाओं के साथ छह अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए DMEM में डीएनए और ट्रांसफेक्शन अभिकर्ण युक्त मिश्रण का एक मिलीलीटर जोड़ें ।5% CO2 के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन के तीन से चार घंटे के बाद, पूर्ण माध्यम के एक मिलीलीटर जोड़ें । इसके बाद प्रत्येक कुएं में डॉक्सीसाइक्लिन स्टॉक के 2 माइक्रोलीटर डालें और प्लेट को प्लस-डॉक्सीसाइक्लिन के रूप में चिह्नित करें। 5% CO2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट।अघोषित सेल प्रसार को बढ़ावा देने में टेटो-डीएन-सीबी-माइक6-आरबी 1 की कार्यक्षमता का आकलन करने के लिए डीएमईएम में संस्कृति एचईआई-ओसी 1 कोशिकाओं का निर्माण किया गया है जिसमें 10% एफबीएस होते हैं, जो स्वतंत्र परिस्थितियों में होते हैं। सेल प्रसार अध्ययन के लिए, एक सेल काउंटर का उपयोग कर HEI-OC1 कोशिकाओं की गिनती। प्लेट 10, 000 एचईआई-OC1 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से मात्रा के 200 माइक्रोलीटर में एक 96-अच्छी तरह से प्लेट पर प्रत्येक।5% CO2 के साथ 33 डिग्री सेल्सियस पर रात में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। ट्रांसजेन अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए, संक्रमित एचईआई-ओसी1 कोशिकाओं के सबसेट में डॉक्सीसाइक्लिन के एक माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर जोड़ें। नियंत्रण के रूप में माइनस-डॉक्सीसाइक्लिन और गैर-संक्रमित एचईआई-ओसी1 कोशिकाओं के रूप में लेबल किए गए अन्य सबसेट का उपयोग करें, और कोशिकाओं को 10% CO2 के साथ 33 डिग्री सेल्सियस के रूप में इनक्यूबेट करें।सेल प्रसार का आकलन करने के लिए, ट्रांसफैक्शन के 48 घंटे बाद, सेल कल्चर मीडियम को हटा दें और माइक्रो-प्लेट के प्रत्येक कुएं में सेल प्रसार किट से 1x डाई बाइंडिंग सॉल्यूशन के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। प्रत्येक नमूने की फ्लोरेसेंस तीव्रता को मापने के लिए फ्लोरेसेंस माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करें।इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री का उपयोग करके सेल प्रसार का आकलन करने के लिए, डीएमईएम में 12-अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं में रखे कवर ग्लास पर एचईआई-ओसी1 कोशिकाओं को प्लेट करें। कोशिकाओं को रात भर ३३ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें । अगले दिन, पीटीईटी-स्प्लिस और पीसीएमवी-टेट3जी वैक्टर के साथ दो कुओं में कोशिकाओं को सहसंस्करण करें, और फिर एक पर डॉक्सीसाइक्लिन उपचार करते हैं और साथ ही NIH3T3 कोशिकाओं के साथ किया जाता है।एक नियंत्रण के रूप में एक असंक्रमित अच्छी तरह से प्रयोग करें। Ki-67 लेबलिंग के लिए कोशिकाओं को संसाधित करने के लिए, उन्हें कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए पीबीएस में 4% पैराफॉर्मल्डिहाइड के साथ ठीक करें। उसके बाद, उन्हें पांच मिनट के लिए बर्फ से ठंडे पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।पीबीएस में 0.25% नॉनएनिक डिटर्जेंट जोड़ें, और 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। पीबीएस में तीन बार पांच मिनट के लिए वॉश दोहराएं। कोशिकाओं को ब्लॉक करने के लिए 10% सीरम का उपयोग करें।कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए एक आर्द्र कक्ष में। की-67 प्राथमिक एंटीबॉडी के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें और चार डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। कोशिकाओं को फिर से पांच मिनट के लिए पीबीएस में तीन बार धोएं ।माध्यमिक एंटीबॉडी का एक मिलीलीटर जोड़ें और अंधेरे में कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। सेकेंडरी एंटीबॉडी सॉल्यूशन को हटाने के बाद, कोशिकाओं को फिर से अंधेरे में पीबीएस में पांच मिनट के लिए तीन बार धोएं। एचईआई-OC1 कोशिकाओं को फालोडिन के साथ लेबल करने के लिए, उन्हें कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 1:200 फालोडिन में इनक्यूबेट करें।कोशिका नाभिक को लेबल करने के लिए, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए DAPI के पांच माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें । ट्रांसजीन चूहों के वितरण के बाद, पांडुलिपि में वर्णित सीबीआरबी 1 संलयन क्षेत्र के लिए विशिष्ट प्राइमर सेट का उपयोग करके पिल्ले को जीनोटाइप करें। नस्ल वयस्क Teto-DN-CB-myc6-Rb1 चूहों को रोजा-कैग-आरटीए और टेट्रासिकलाइन प्रेरक लाइन को प्रायोगिक डीएन-सीबीआरबी चूहों को उत्पन्न करने के लिए, और पांडुलिपि में वर्णित उनकी संतानों को जीनोटाइप करें।NIH3T3 अंतर्जात RB1 प्रोटीन व्यक्त नहीं करता है, इसलिए यहां देखी गई मजबूत RB1 अभिव्यक्ति डॉक्स की उपस्थिति में ट्रांसजीन प्रेरण के कारण है, लेकिन इसकी अनुपस्थिति में नहीं, टेटो-डीएन-सीबी-myc6-RB1 मिक्स आरबी 1 निर्माण के कुशल सक्रियण की पुष्टि करता है। इसके विपरीत, HEK293 कोशिकाओं में अंतर्जात RB1 अभिव्यक्ति होती है। डॉक्सीसाइक्लिन के अलावा TetO-DN-CB-myc6-Rb1 सक्रियण और RB1 नीचे विनियमन के लिए नेतृत्व किया ।मीडिया से डॉक्सीसाइक्लिन को हटाने के 21 घंटे बाद RB1 अभिव्यक्ति फिर से शुरू की गई । एचईआई-OC1 कोशिकाओं को एक ही वैक्टर के साथ संक्रमित, कोशिका संख्या में एक मामूली लेकिन महत्वपूर्ण वृद्धि प्रदर्शित डॉक्सीसाइक्लिन उपचार का पालन करें ट्रांस संक्रमित कोशिकाओं के साथ इलाज नहीं doxycycline के साथ इलाज नहीं है, और असंक्रमित कोशिकाओं । सीटू संकरण में फ्लोरोसेंट ने चूहों में टेटो-डीएन-सीबी-myc6-RB1 ट्रांसजीन के जीनोमिक सम्मिलन की पुष्टि की।नियंत्रण समूह की तुलना में तीन दिनों के लिए डॉक्सीसाइक्लिन के साथ इलाज ट्रांसजेनिक चूहों के कॉकलिया में कुल RB1 प्रोटीन अभिव्यक्ति में प्रारंभिक वृद्धि हुई थी । हालांकि, सात और 10 दिनों के लिए doxocycline के साथ इलाज समूहों में, RB1 अभिव्यक्ति में एक महत्वपूर्ण कमी देखी गई थी । ऊतक का विश्लेषण किए जाने की परवाह किए बिना, डॉक्सोसाइक्लिन के साथ इलाज किए गए ट्रांसजेनिक चूहों में आरबी 1 प्रोटीन में महत्वपूर्ण कमी देखी गई, लेकिन नियंत्रण समूह में नहीं, टेटो-डीएन-सीबी-माइक6-आरबी 1 निर्माण की दक्षता की पुष्टि।इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, यह सत्यापित करना महत्वपूर्ण है कि ट्रांसजीन के प्रत्येक कोडिंग तत्व एक दूसरे के साथ फ्रेम में हैं। यदि इस रिपोर्ट में वर्णित कैथेप्सिन बी और रेटिनोब्लास्टोमा के कोडिंग क्षेत्र, संयोग से, फ्रेम से जुड़े थे, तो यह अभीष्ट संलयन प्रोटीन नहीं निकलेगा। इस प्रकार, डीएनए अनुक्रम सत्यापन एकल कोशिकीय माउस भ्रूण में ट्रांसजीन इंजेक्शन से पहले किया जाना चाहिए ।इस प्रक्रिया के बाद, सर्वव्यापी कैग प्रमोटर को विशिष्ट प्रमोटरों के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है ताकि कोशिका के विशिष्ट तरीके से जीन कार्य का अध्ययन किया जा सके ।

Research

JoVE Journal

Genetics

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Inducible T7 आरएनए पोलीमरेज़ मध्यस्थता बहुउद्देशीय अभिव्यक्ति प्रणाली, पीएमजीएक्स

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

में फ्लोरोसेंट प्रोटीन Fusions की पीढ़ी<em&gt; कैंडिडा</em&gt; प्रजाति

Candida species, prevalent colonizers of the intestinal and genitourinary tracts, are the cause of the majority of invasive fungal infections in humans. ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Inducible क्षणिक अभिकर्मक के माध्यम से चलाया आयन चैनल अभिव्यक्ति

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection CRISPR/Cas9 प्रोटीन की चैनल कैटफ़िश, Ictalurus punctatus, जीन संपादन के लिए भ्रूण

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

गठन और Inducible सिस्टम के लिए आनुवंशिक Vivo में संशोधन माउस हेपैटोसाइट्स का उपयोग Hydrodynamic टेल नस इंजेक्शन

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

माउस भ्रूण में मुताबिक़ पुनर्संयोजन की घटनाओं की पहचान स्टेम दक्षिणी सोख्ता और पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया का उपयोग कोशिकाओं

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, सेल प्रकार- Arabidopsis में विशेष अभिव्यक्ति lhgr के माध्यम से thaliana-मध्यस्थता ट्रांस-सक्रियण

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित Proteomics विश्लेषण OpenProt डेटाबेस का उपयोग कर उपन्यास प्रोटीन गैर-विहित ओपन रीडिंग फ्रेम्स से अनुवादित

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

बैक्टीरिया में प्रोटीन-आरएनए बाइंडिंग की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक परख

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

इन विट्रो बायोकेमिकल परख का उपयोग कर के लिए Biotin लेबल का अध्ययन करने के लिए प्रोटीन-न्यूक्लिक एसिड इंटरेक्शन

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...