Name: inducible and reversible dominant-negative (dn) protein inhibition
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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PCS2 + CB Myc6 벡터 마샬 츠 (워싱턴 대학교, 시애틀, 워싱턴, 미국)에서 선물 했다. 헤이-OC1 셀 Fedrico Kalinec (데이비드 게 펜의과 대학, UCLA, 로스 앤젤레스, 캘리포니아, 미국)에 의해 친절 하 게 제공 되었다. 기술 지원 UNMC 마우스 게놈 엔지니어링 핵심 (cb를 Gurumurthy, 돈 Harms, 롤 렌 Quadros) 그리고 Creighton 대학 통합 생물 의학 이미징 시설 (리처드 Hallworth, 존 Billheimer)에 의해 제공 되었다. P20 GM103471 번호 부여 UNMC 마우스 게놈 엔지니어링/NIGMS, NIH에서에서 기관 개발 수상 (IDea는)에 의해 지원 되었다. 통합 생물 의학 이미징 시설 의학 및 GM103427 및 GM110768는 NIH/NIGMS에서 보조금 크레이 톤 대학에 의해 지원 되었다. 시설 연구 자원 (RR016469)에 대 한 국립 센터에서 교부 금 지원으로 건립 되었다 고 NIGMS (GM103427). 이 연구에서 생성 된 마우스 라인 크레이 톤 대학교 동물 자원 시설, 누구의 인프라 NIH/NCRR G20RR024001에 의해 부여를 통해 개량 되었다 유지 되었다. 과거는 NIH/NCRR 5P20RR018788-/ NIH/NIGMS 8P20GM103471 COBRE 부여 (셸리 D. 스미스), NIH/ORIP R21OD019745-01A1 (S. S.M.R.), 그리고는 신흥 연구 부여 심리 건강 재단에서 (S. Tarang)를 통해 지원 받은이 작품. 이 연구의 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다.

유전자 변형 CBRb 마우스와 모든 동물 보호 및 연구와 관련 된 실험의 세대 Creighton 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 되었고 그들의 지침에 의해 수행.
1. 유전자 변형 CB-Myc6-Rb1 구문
참고: CBRb의 pTet_Splice 벡터에 클로닝 다단계 과정 (그림 1A 및 1B)에서 이루어졌다.
<ol><li>
PCS...

<ol>
	<li>Li, F. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+MyoD+homodimer+formation+demonstrated+by+a+general+method+of+dominant+negative+mutation+employing+fusion+with+a+lysosomal+protease.">Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease.</a> Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).</li><li>Tarang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+retinoblastoma+(rb)1-inducible+dominant-negative+(DN)+mouse+model.">Generation of a retinoblastoma (rb)1-inducible dominant-negative (DN) mouse model.</a> Frontiers Cellular Neuroscience. 9 (52), (2015).</li><li>Kominami, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+selective+role+of+cathepsins+B+and+D+in+the+lysosomal+degradation+of+endogenous+and+exogenous+proteins.">The selective role of cathepsins B and D in the lysosomal degradation of endogenous and exogenous proteins.</a> FEBS Letters. 287 (1-2), 189-192 (1991).</li><li>Cortellino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+ciliogenesis,+embryonic+lethality+and+severe+impairment+of+the+sonic+hedgehog+pathway+caused+by+inactivation+of+the+mouse+complex+A+intraflagellar+transport+gene+Ift122/Wdr10,+partially+overlapping+with+the+DNA+repair+gene+Med1/Mbd4.">Defective ciliogenesis, embryonic lethality and severe impairment of the sonic hedgehog pathway caused by inactivation of the mouse complex A intraflagellar transport gene Ift122/Wdr10, partially overlapping with the DNA repair gene Med1/Mbd4.</a> Developmental Biology. 325 (1), 225-237 (2009).</li><li>Ferreira, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+embryonic+lethality+of+H+ferritin+gene+deletion+in+mice.">Early embryonic lethality of H ferritin gene deletion in mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3021-3024 (2000).</li><li>Lee, E. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+cre-mediated+recombination+in+mice+does+not+result+in+protein+loss.">When cre-mediated recombination in mice does not result in protein loss.</a> Genetics. 186 (3), 959-967 (2010).</li><li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+cell-cycle+reentry+and+cell+death+after+acute+inactivation+of+the+retinoblastoma+gene+product+in+postnatal+cochlear+hair+cells.">Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+knockout+mouse+model+of+retinoblastoma.">The first knockout mouse model of retinoblastoma.</a> Cell Cycle. 3 (7), 952-959 (2004).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletions+of+retinoblastoma+1+(Rb1)+and+its+repressing+target+S+phase+kinase-associated+protein+2+(Skp2)+are+synthetic+lethal+in+mouse+embryogenesis.">Deletions of retinoblastoma 1 (Rb1) and its repressing target S phase kinase-associated protein 2 (Skp2) are synthetic lethal in mouse embryogenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10201-10209 (2016).</li><li>Yamasaki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+E2F-1+reduces+tumorigenesis+and+extends+the+lifespan+of+Rb1(+/-)+mice.">Loss of E2F-1 reduces tumorigenesis and extends the lifespan of Rb1(+/-) mice.</a> Nature Genetics. 18 (4), 360-364 (1998).</li><li>Li, F. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+a+dominant+negative+retinoblastoma+protein+(RB)+inhibiting+satellite+myoblast+differentiation+implies+an+indirect+interaction+between+MyoD+and+RB.">Selection of a dominant negative retinoblastoma protein (RB) inhibiting satellite myoblast differentiation implies an indirect interaction between MyoD and RB.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5129-5139 (2000).</li><li>Pitkanen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+human+retinoblastoma+gene+product+in+mouse+fibroblasts:+Effects+on+cell+proliferation+and+susceptibility+to+transformation.">Expression of the human retinoblastoma gene product in mouse fibroblasts: Effects on cell proliferation and susceptibility to transformation.</a> Experimental Cell Research. 207 (1), 99-106 (1993).</li><li>Chano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+abundance+of+RB1CC1+contributes+to+the+non-proliferating+enlarged+cell+phenotype+through+both+RB1+maintenance+and+TSC1+degradation.">Neuromuscular abundance of RB1CC1 contributes to the non-proliferating enlarged cell phenotype through both RB1 maintenance and TSC1 degradation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 18 (3), 425-432 (2006).</li><li>Kole, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+therapeutics:+Beyond+RNA+interference+and+antisense+oligonucleotides.">RNA therapeutics: Beyond RNA interference and antisense oligonucleotides.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 11 (2), 125-140 (2012).</li><li>Yamamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ons+and+offs+of+inducible+transgenic+technology:+A+review.">The ons and offs of inducible transgenic technology: A review.</a> Neurobiology of Disease. 8 (6), 923-932 (2001).</li><li>Houdebine, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+animal+models+in+biomedical+research.">Transgenic animal models in biomedical research.</a> Methods in Molecular Biology. 360, 163-202 (2007).</li><li>Brehm, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoblastoma+protein+recruits+histone+deacetylase+to+repress+transcription.">Retinoblastoma protein recruits histone deacetylase to repress transcription.</a> Nature. 391 (6667), 597-601 (1998).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E2F-HDAC+complexes+negatively+regulate+the+tumor+suppressor+gene+ARHI+in+breast+cancer.">E2F-HDAC complexes negatively regulate the tumor suppressor gene ARHI in breast cancer.</a> Oncogene. 25 (2), 230-239 (2006).</li><li>Magnaghi-Jaulin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoblastoma+protein+represses+transcription+by+recruiting+a+histone+deacetylase.">Retinoblastoma protein represses transcription by recruiting a histone deacetylase.</a> Nature. 391 (6667), 601-605 (1998).</li></ol>

우회 전통적인 유전자 변형 전략와 관련 된 한계, 우리는 내 생 포 수 수 조건부로 비활성화 spatiotemporal 방식에서 그것의 DN 돌연변이 형태를 overexpressing에 의해 마우스 모델을 생성 하고자 했다. 내 생 Poi의 기능을 폐지 하 고 몇 가지 옵션이 제안된15,,1617되었습니다. 우리 그 식의 표현에 영향을 미치는 돌연변이 펩 티 드를 생?...

일반적으로 완전 한 제거 또는 유전자, RNA 시퀀스, 또는 관심사 (POI)의 단백질의 자르기 이어질 영구 프로세스에 의존 하는 유전자 및 단백질 제거를 목표로 대부분 접근. 이 방법의 전반적인 목표는 내 생, 야생-타입 단백질의 기능을 폐지 하 고 재조합 단백질 하입니다. 우리가 재검토 하 고 개편 한 대체 전략1,2, DN 억제를 통해 POI의 임시 제거를 허용. 이 방법은 multimeric와 단위체 펩 티 드에 대 한 작동 하지만 단백질 multimeric 어셈블리에 기능을 위해 가장 적합 한.
메서드를 융합 하는 lysosomal 효소 CB multimeric POI (CB 퓨전 복잡 한)의 소 단위를 이루어져 있다. 복잡 한 결과 CB 퓨전 수 상호 작용 및 proteolytically 생 단백질 소화 또는 전체 CB POI 복잡 한 수 저하3리소좀을 전환. 또한, 유도할 수 있는 자연 항생물질 제어 transcriptional 활성화 (TetO) 시스템의 복잡 한 CB 융해의 함께 가역 패션2transgene의 제어 하 고 유도할 수 있는 표현에 대 한 수 있습니다. 많은 경우에 유용 하지만 치4,,56유전자 또는 vivo에서 단백질의 완전 한 삭제 될 수 있습니다. 궁극적으로, 중요 한 게놈 요소7의 영구 손실 이어질 것입니다, 마찬가지로, 일부 유전자 또는 단백질 Cre/Lox 체계를 사용 하 여 조직 관련, 조건부 삭제 간단 되지 않을 수 있습니다. 따라서, 유전자 또는 POI에 따라 이러한 접근의 후속 연구에 대 한 유용한 모델을 제공 효과가 있을 것입니다 특히 유전자 또는 단백질의 기능 연구 늦은 출생 후와 성인 쥐에.
이러한 접근법과 관련 된 문제를 회피 하 고 제공 증거의 원칙에 제안된 된 방법의 효과 선택 했습니다 Retinoblastoma 1 (RB1) 단백질의 조건부 DN 버전을 생성 하 여 여기에 제시 된 메서드를 테스트 하려면. 몇 가지 옵션이 제안된8,,910 생 RB1;의 기능을 폐지 하 고 있다 그러나, 그들의 모두 위에서 설명한 동일한 제한 사항 중 일부에 직면: RB1의 영구적인 생식 삭제 embryonically 치명적인 이며, 종양11의 다양 한 종양 억제기 역할, 영구 RB1 조건부 삭제 리드. RB1의 DN 버전 자연스럽 게 발생 하지 않는, 비록 현재 사용할 수 있는 전략에 대 한 더 나은 대안 생 RB1의 일시적으로 제어 비활성화에 대 한 허용 해야 하 고 결국 복원 하는 대체 메커니즘을 제공의 기능입니다. 이러한 구문으로 2 년간 전 설명 했다1. 그러나, 기술적 제한으로 인해 그것은 메커니즘 제어 transgene 활성화, 응답, 및 조직 특이성을 부족. 이 연구는 먼저 doxycycline (Dox)의 우아함과 결합-lysosomal 효소 CB 및 Rb1 단백질의 조작된 유전자 변형 구문으로 종속 transcriptional 시스템. 결과 CBRb 마우스 모델 일시적으로 규제 Dox 중재 RB1 허용 규정2. 이러한 프로테옴 기반 접근을 사용 하 여 유전자 기능을 연구 하의 장점은 어떤 유전자의, 그것의 활동에 대 한 최소한의 정보에 대 한 채택 될 수 있다.
제안 된 DN transgene 전략 전통적인 접근에 많은 이점이 있습니다. 첫째, DN 단백질 억제 단백질 활동, 따라서 잔여 생 식 보존에 부분 절제를 리드. 이러한 결과 단백질 활동의 완전 한 제거 라이브 마우스에서 유전자 기능 연구에 어떤 조사를 크게 제한 하는 배아 치 사 율을 리드 하는 상황에서 매우 바람직합니다. 둘째, TetO 시스템의 존재는 transgene 활동의 효율적이 고 가역 제어할 수 있는 항생제, 존재만 transgene 활성화를 수 있습니다. 따라서, 항생제 관리를 중단 하 여 유전자 변형 시스템을 비활성화할 수 있습니다, 하 고는 정상적인 RB1 식이 다시 자리에에서 키를 누릅니다. 셋째, transgene 식의 특이성의 선택의 발기인에 따라 달라질 수 있습니다. 우리는 증거의 원칙에 대 한 유비 쿼터 스로 사 CAG 발기인 선택, 조직 관련 발기인 아래 transgene 삽입 가능성이 높습니다 원치 않는 transgene 식 제한이 transgene의 치료 응용 프로그램에 대 한 연구를 촉진 하 입니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:768px;" width="769">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:255px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium, DMEM</td>
			<td style="width:228px;">GIBCO-BRL</td>
			<td style="width:119px;">11965-084</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Minimum Essential Medium Eagle, MEME&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">M8042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F2442&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Lipofectamine&#160;</td>
			<td style="width:228px;">DharmaFECT</td>
			<td style="width:119px;">T-2010-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Sal I</td>
			<td style="width:228px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11745622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">EcoRV-HF</td>
			<td style="width:228px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R3195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">NotI</td>
			<td style="width:228px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">13090730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CaspaTag&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">APT523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">DAPI</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Staurosporine</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CyQuant NF cell proliferation kit&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C35007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Retinoblastoma 1 antibody</td>
			<td style="width:228px;">Abcam</td>
			<td>Ab6075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">c-Myc antibody</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td>M5546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">b-actin</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td>A5316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ki-67&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">MA5-14520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Phallodin</td>
			<td style="width:228px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence microplate reader</td>
			<td style="width:228px;">FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Epifluorescence microscope&#160;</td>
			<td style="width:228px;">NikonEclipse80i</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:601px;">The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011.&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducible and reversible dominant-negative (dn) protein inhibition

지배적인 네거티브 (DN) 단백질 억제 단백질 기능을 조작 하는 강력한 방법 이며, 다른 게놈 기반 접근을 통해 여러 가지 이점을 제공 합니다. 예를 들어 비록 공상 Cre LoxP 타겟팅 전략을 널리 사용 되어 왔습니다, (즉, 새 발기인 활동, 모자이크 Cre 식, 등) 이러한 전략의 본질적인 한계 크게 제한 하 고 그들의 응용 프로그램입니다. 또한, 많은 내 생 유전자의 완전 한 삭제는 embryonically, 출생 후 생활에 유전자 기능을 연구 하는 게 불가능 한 만드는 치명적인입니다. 이러한 과제를 해결 하기 위해 우리는 초기 유전 공학 프로토콜 중요 한 변경 있고 Rb1 유전자의 짧은 (유전자 변형) 버전 lysosomal 효소와 결합 하 여 procathepsin B (CB), Rb1의 DN 마우스 모델 생성 (CBRb). Lysosomal 효소의 존재로 인해 전체 CB RB1 융합 단백질 및 그 상호 작용 복잡 한 프로테아좀 중재 저하에 라우팅됩니다. 또한, 유전자 변형 구문에서 항생물질 유도 (rtTA) 요소 있으면 RB1 단백질의 유도할 수 있는 고 가역 규칙을 수 있습니다. CBRb 마우스 모델에서 유비 쿼터 스로 사 CAG 발기인의 존재 하기가 일시적이 고 가역 Rb1 유전자 제거 수행 하 고 거의 모든 세포 유형에 있는 그것의 활동을 이해 하기 위한 연구는 리소스를 제공 하는 유용한 도구 RB1 표현 된다.

일반적으로, 상당한 양의 구조에 대 한 정보 및 POI의 기능 필요 DN 돌연변이 설계 합니다. 반면, 여기에 제시 된 DN 전략은 POI에 대 한 구조 및 기능 정보는 제한 하는 경우 특히 유용 합니다. 조립된 multimer 및, 잠재적으로, 생 subunits의 베이스와의 subcellular 전환의 조합을 통해 다른 ligands lysosomal 효소를 한 소 단위의 융합 POI multimeric 단백질 인 경우에, 억제 지배적 수는 multimer...

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Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition

여기 선물이 있는 어떤 단백질 수 수 조건부로 비활성화 역 그것의 지배적인 부정적인 돌연변이 버전 overexpressing에 의해 지배 부정적인 유도할 수 있는 시스템을 개발 하는 프로토콜.

유도할 수 있는 고 가역 지배-네거티브 (DN) 단백질 억제

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...

이 방법은 지배적 인 부정적인 버전을 뒤집음으로써 관심 유전자의 조건부 및 일시적인 비활성화가 필요한 다양한 분야에서 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단백질 활성에서 부분 절제만 허용하므로 잔류 내인성 발현을 보존한다는 것입니다. 비록, 여기서 우리는 다원어질 어셈블리에서 작동하는 RB 단백질의 상태를 기술하더라도, 이 방법론은 또한 단황 단백질에 적용될 수 있습니다.우리의 실험실 기술자이자 원고의 공동 저자인 Umesh Pyakurel이 절차를 시연합니다. 시작하려면, NIH3T3 세포를 성장, 공급 업체의 사양에 따라, 에서 섭씨 37 섭씨 5% CO2, 포함 권장 세포 배양 배지를 사용하여 10% 태아 소 혈청. pTet-Splice 및 pCMV-Tet3G 벡터를 사용하여 세포를 결합하기 위해, 먼저 지질 계 형 경질 시약의 2 ~4 마이크로리터를 잘 혼합하고, 15 밀리리터 튜브에서 잘 당 불완전한 DMEM의 1 밀리리터를 혼합하고, 실내 온도에서 5 분 동안 배양한다.이 트랜스펙트 시약의 DMEM 믹스에 잘 당 2 ~ 3 마이크로 그램의 플라즈마 DNA를 추가합니다. 실온에서 20분간 혼합하고 배양하세요. NIH3T3 세포를 가진 6웰 플레이트의 각 웰에 DNA와 DMEM에 있는 transfection 시약을 포함하는 혼합의 1 밀리리터를 추가합니다.3~4시간 동안 섭씨 37도에서 5%의 CO2를 받은 배양 후 완전한 배지 1밀리리터를 추가합니다. 그런 다음, 각 우물에 독시사이클린 스톡 2 마이크로리터를 추가하고 접시를 플러스 독시사이클린으로 표시합니다. 5%의 CO2로 37°C에서 세포를 배양합니다.예약되지 않은 세포 증식을 촉진하는 TetO-DN-CB-myc6-Rb1 구조의 기능을 평가하기 위해 DMEM의 배양 HEI-OC1 세포는 허용 조건하에서 10%의 FBS를 함유하고 있습니다. 세포 증식 연구의 경우 세포 카운터를 사용하여 HEI-OC1 세포를 계산합니다. 플레이트 10, 000 HEI-OC1 세포는 각각 200 마이크로리터의 96웰 플레이트에 잘 어울리라.밤에 세포를 33도에서 5 %의 CO2로 배양하십시오. 유전자 발현을 유도하려면, 전염된 HEI-OC1 세포의 하위 집합에 독시사이클린의 밀리리터 당 1 마이크로그램을 추가한다. 마이너스-독시사이클린및 비감염된 HEI-OC1 세포로 표시된 다른 서브세트를 대조군으로 사용하고, 세포를 섭씨 33도로 10%CO2로 배양한다.세포 증식을 평가하기 위해, 48 시간 형질 후, 세포 배양 배지를 제거하고 마이크로 플레이트의 각 웰에 세포 증식 키트에서 1x 염료 결합 용액100 마이크로 리터를 추가합니다. 제조업체의 프로토콜을 따르고 섭씨 37도에서 1시간 동안 인큐베이션을 사용하세요. 형광 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 각 샘플의 형광 강도를 측정합니다.면역 세포 화학을 사용하여 세포 증식을 추가로 평가하기 위해, DMEM의 12웰 플레이트의 각 웰에 놓인 커버 유리에 HEI-OC1 세포를 플레이트. 섭씨 33도에서 하룻밤 동안 세포를 배양하십시오. 다음 날, pTet-Splice 및 pCMV-Tet3G 벡터를 사용하여 두 개의 우물에서 세포에 대한 균질을 한 다음 NIH3T3 세포와 함께 수행되는 것과 마찬가지로 독시사이클린 치료를 수행한다.비감염되지 않은 것을 컨트롤로 잘 사용하십시오. Ki-67 라벨링에 대한 세포를 처리하려면 실온에서 10 분 동안 PBS에서 4 %의 파라 포름 알데히드로 수정하십시오. 그 후, 얼음 차가운 PBS로 각각 5 분 동안 세 번 씻으시면 됩니다.PBS에 0.25%의 니언 세제를 넣고 10분 동안 배양합니다. PBS에서 각각 5분간 세 번 세척을 반복합니다. 세포를 차단하기 위해 10% 혈청을 사용합니다.실온에서 1 시간 동안 가습 챔버에서. Ki-67 1차 항체의 마이크로리터 500기를 추가하고 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. PBS에서 각각 5분간 셀을 세 번 다시 씻으십시오.이차 항체의 1 밀리리터를 추가하고 어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 세포를 배양하십시오. 이차 항체 용액을 제거한 후, 어둠 속에서 PBS에서 5분 동안 세포를 다시 세 번 씻는다. HEI-OC1 세포를 판로이드인으로 표시하려면 실온에서 30분 동안 1:200 판로이드에 인큐베이션하십시오.세포 핵을 레이블을 지정하려면 실온에서 10 분 동안 DAPI 밀리리터 당 5 마이크로 그램으로 세포를 배양하십시오. 유전자 마우스의 전달 후, 원고에 기재된 바와 같이 CBRb1 융합 영역에 특이적인 프라이머 세트를 사용하여 새끼를 유전자형으로 한다. 실험적인 DN-CBRb 마우스를 생성하기 위해 로사-CAG-rtTA 및 테트레사이클린 유도선에 성인용 TetO-DN-CB-myc6-Rb1 마우스를 사육하고, 원고에 설명된 바와 같이 자손을 유전자형으로 한다.NIH3T3는 내인성 RB1 단백질을 발현하지 않으므로 여기서 볼 수 있는 견고한 RB1 발현은 Dox의 존재에 대한 유전자 유도에 기인하지만, 그 부재는 아니지만 TetO-DN-CB-myc6-Rb1 mix RB1 구분의 효율적인 활성화를 확인한다. 대조적으로, HEK293 세포는 내인성 RB1 발현을 갖는다. 독시사이클린의 추가는 TetO-DN-CB-myc6-Rb1 활성화 및 RB1 다운-규제로 이어졌습니다.RB1 발현은 독시사이클린이 미디어에서 제거된 후 21시간 후에 재개되었다. 동일한 벡터와 cotrans감염된 HEI-OC1 세포는 독시사이클린으로 치료되지 않은 전과 비교하여 독시사이클린 치료를 따르는 세포 수의 겸손하지만 유의한 증가를 표시하고, 비감염된 세포. 시상 혼성화에서 형광은 마우스에서 TetO-DN-CB-myc6-RB1 트랜스진의 게놈 삽입을 확인하였다.대조군에 비해 3일 동안 독시사이클린으로 처리된 형질전환마우스의 달팽이관에서 총 RB1 단백질 발현이 초기에 증가하였다. 그러나, 7일 및 10일 동안 독소사이클린으로 처리된 군에서 RB1 발현의 현저한 감소가 관찰되었다. 분석된 조직에 관계없이, RB1 단백질의 현저한 감소는 독소세포로 처리되었지만 대조군에서는 관찰되지 않아 TetO-DN-CB-myc6-RB1 생성물의 효율을 확인하였다.이 절차를 시도하는 동안, 트랜스진의 각 코딩 요소가 서로 프레임에 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 보고서에 설명된 카테신 B와 망막 모세포종의 코딩 영역이 우연히 프레임 밖으로 연결된경우 의도된 융합 단백질을 산출하지 못할 것입니다. 따라서, DNA 서열 검증은 단세포 마우스 배아에 전균유전자를 주입하기 전에 이루어져야 한다.이 절차에 따라, 유비쿼터스 CAG 프로모터는 세포의 특정 방식으로 유전자 기능을 연구하기 위해 특정 프로모터로 대체 될 수있다.

Research

JoVE Journal

Genetics

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

유도 성 T7 RNA 중합 효소 매개 멀티젠 발현 시스템, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

연구

유전학

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

에 형광 단백질 융합의 시대<em&gt; 칸디다</em&gt; 종

Candida species, prevalent colonizers of the intestinal and genitourinary tracts, are the cause of the majority of invasive fungal infections in humans. ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

유도 성 과도 형질을 통해 제어 이온 채널 식

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

CRISPR/Cas9 단백질의 유전자 편집에 대 한 채널 메기, Ictalurus punctatus, 배아로 microinjection

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

유체역학 꼬리 정 맥 주입을 사용 하 여 마우스 Hepatocytes의 유전 Vivo에서 수정에 대 한 제정 및 유도할 수 있는 시스템

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

마우스 배아 줄기 세포 사용 하 여 남부 럽 연쇄 반응에서에서 동종 재결합 이벤트의 식별

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

유도할 수 있는, 애기 thaliana 통해 LhGR 중재 트랜스에 셀 형식 관련 식-활성화

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

질량 분석 기반 Proteomics 분석 소설 단백질을 공개할 OpenProt 데이터베이스를 사용 하 여 비 정식 열려있는 독서 프레임에서 번역

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

박테리아에서 단백질 RNA 결합을 정량화하기위한 분석

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

비오틴 라벨을 사용하여 단백질-핵산 상호 작용을 연구하는 생체외 생화학 적 분석을 통해

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...