Name: inducible and reversible dominant-negative (dn) protein inhibition
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition at JoVE.com

PCS2 + CB-Myc6 vektor var en gave fra Marshall Horwitz (University of Washington, Seattle, WA, USA). HEI-OC1 cellene fotograferingen av Fedrico Kalinec (David Geffen School of Medicine, UCLA, Los Angeles, CA, USA). Kundestøtte ble levert av UNMC musen genomet Engineering kjernen (C.B. Gurumurthy, Don Harms, Rolen Quadros) og Creighton University integrert biomedisinsk bildebehandling anlegget (Richard Hallworth, John Billheimer). I UNMC musen genomet Engineering ble støttet av en institusjonell utvikling pris (idé) fra NIH/NIGMS, gi nummer P20 GM103471. Integrert biomedisinsk bildebehandling anlegget ble støttet av Creighton University School of Medicine og gir GM103427 og GM110768 fra NIH/NIGMS. Anlegget ble bygget med støtte fra tilskudd fra National Center for forskning ressurser (RR016469) og NIGMS (GM103427). Musen linjene generert i denne studien ble opprettholdt på Creighton Universitys dyr ressurs anlegget, som infrastruktur ble forbedret gjennom et stipend ved NIH/NCRR G20RR024001. Dette arbeidet fikk forbi støtte gjennom en NIH/NCRR 5P20RR018788 - NIH/NIGMS 8P20GM103471 COBRE gi (til Shelley D. Smith), NIH/ORIP R21OD019745-01A1 (S.M.R.-S.) og en nye forskningsstipend fra Hearing Health Foundation (til S. Tarang). Innholdet i denne forskningen er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til National Institutes of Health.

Generasjon av transgene CBRb musen og alle dyr omsorg og eksperimenter med studien ble godkjent av Creighton University institusjon for dyr og bruk Committee (IACUC) og fremført av sine retningslinjer.
1. transgene CB-Myc6-Rb1 konstruksjon
Merk: Kloning av CBRb i en pTet_Splice vektor ble gjort i en flertrinnsprosess (figur 1A og 1B).
<ol><li>
Utføre første stadium kloning i pCS2...

<ol>
	<li>Li, F. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+MyoD+homodimer+formation+demonstrated+by+a+general+method+of+dominant+negative+mutation+employing+fusion+with+a+lysosomal+protease.">Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease.</a> Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).</li><li>Tarang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+retinoblastoma+(rb)1-inducible+dominant-negative+(DN)+mouse+model.">Generation of a retinoblastoma (rb)1-inducible dominant-negative (DN) mouse model.</a> Frontiers Cellular Neuroscience. 9 (52), (2015).</li><li>Kominami, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+selective+role+of+cathepsins+B+and+D+in+the+lysosomal+degradation+of+endogenous+and+exogenous+proteins.">The selective role of cathepsins B and D in the lysosomal degradation of endogenous and exogenous proteins.</a> FEBS Letters. 287 (1-2), 189-192 (1991).</li><li>Cortellino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+ciliogenesis,+embryonic+lethality+and+severe+impairment+of+the+sonic+hedgehog+pathway+caused+by+inactivation+of+the+mouse+complex+A+intraflagellar+transport+gene+Ift122/Wdr10,+partially+overlapping+with+the+DNA+repair+gene+Med1/Mbd4.">Defective ciliogenesis, embryonic lethality and severe impairment of the sonic hedgehog pathway caused by inactivation of the mouse complex A intraflagellar transport gene Ift122/Wdr10, partially overlapping with the DNA repair gene Med1/Mbd4.</a> Developmental Biology. 325 (1), 225-237 (2009).</li><li>Ferreira, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+embryonic+lethality+of+H+ferritin+gene+deletion+in+mice.">Early embryonic lethality of H ferritin gene deletion in mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3021-3024 (2000).</li><li>Lee, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+deficient+for+rb+are+nonviable+and+show+defects+in+neurogenesis+and+haematopoiesis.">Mice deficient for rb are nonviable and show defects in neurogenesis and haematopoiesis.</a> Nature. 359 (6393), 288-294 (1992).</li><li>Turlo, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+cre-mediated+recombination+in+mice+does+not+result+in+protein+loss.">When cre-mediated recombination in mice does not result in protein loss.</a> Genetics. 186 (3), 959-967 (2010).</li><li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+cell-cycle+reentry+and+cell+death+after+acute+inactivation+of+the+retinoblastoma+gene+product+in+postnatal+cochlear+hair+cells.">Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+knockout+mouse+model+of+retinoblastoma.">The first knockout mouse model of retinoblastoma.</a> Cell Cycle. 3 (7), 952-959 (2004).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletions+of+retinoblastoma+1+(Rb1)+and+its+repressing+target+S+phase+kinase-associated+protein+2+(Skp2)+are+synthetic+lethal+in+mouse+embryogenesis.">Deletions of retinoblastoma 1 (Rb1) and its repressing target S phase kinase-associated protein 2 (Skp2) are synthetic lethal in mouse embryogenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10201-10209 (2016).</li><li>Yamasaki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+E2F-1+reduces+tumorigenesis+and+extends+the+lifespan+of+Rb1(+/-)+mice.">Loss of E2F-1 reduces tumorigenesis and extends the lifespan of Rb1(+/-) mice.</a> Nature Genetics. 18 (4), 360-364 (1998).</li><li>Li, F. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+a+dominant+negative+retinoblastoma+protein+(RB)+inhibiting+satellite+myoblast+differentiation+implies+an+indirect+interaction+between+MyoD+and+RB.">Selection of a dominant negative retinoblastoma protein (RB) inhibiting satellite myoblast differentiation implies an indirect interaction between MyoD and RB.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5129-5139 (2000).</li><li>Pitkanen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+human+retinoblastoma+gene+product+in+mouse+fibroblasts:+Effects+on+cell+proliferation+and+susceptibility+to+transformation.">Expression of the human retinoblastoma gene product in mouse fibroblasts: Effects on cell proliferation and susceptibility to transformation.</a> Experimental Cell Research. 207 (1), 99-106 (1993).</li><li>Chano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+abundance+of+RB1CC1+contributes+to+the+non-proliferating+enlarged+cell+phenotype+through+both+RB1+maintenance+and+TSC1+degradation.">Neuromuscular abundance of RB1CC1 contributes to the non-proliferating enlarged cell phenotype through both RB1 maintenance and TSC1 degradation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 18 (3), 425-432 (2006).</li><li>Kole, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+therapeutics:+Beyond+RNA+interference+and+antisense+oligonucleotides.">RNA therapeutics: Beyond RNA interference and antisense oligonucleotides.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 11 (2), 125-140 (2012).</li><li>Yamamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ons+and+offs+of+inducible+transgenic+technology:+A+review.">The ons and offs of inducible transgenic technology: A review.</a> Neurobiology of Disease. 8 (6), 923-932 (2001).</li><li>Houdebine, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+animal+models+in+biomedical+research.">Transgenic animal models in biomedical research.</a> Methods in Molecular Biology. 360, 163-202 (2007).</li><li>Brehm, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoblastoma+protein+recruits+histone+deacetylase+to+repress+transcription.">Retinoblastoma protein recruits histone deacetylase to repress transcription.</a> Nature. 391 (6667), 597-601 (1998).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E2F-HDAC+complexes+negatively+regulate+the+tumor+suppressor+gene+ARHI+in+breast+cancer.">E2F-HDAC complexes negatively regulate the tumor suppressor gene ARHI in breast cancer.</a> Oncogene. 25 (2), 230-239 (2006).</li><li>Magnaghi-Jaulin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoblastoma+protein+represses+transcription+by+recruiting+a+histone+deacetylase.">Retinoblastoma protein represses transcription by recruiting a histone deacetylase.</a> Nature. 391 (6667), 601-605 (1998).</li></ol>

For å omgå begrensningene knyttet til tradisjonelle transgene strategier, forsøkte vi å generere en musemodell der en endogen POI kan betinget deaktiveres av overexpressing en DN mutant form for det på en spatiotemporal måte. For å avskaffe funksjonen av endogene severdigheter, er flere alternativer foreslått15,16,17. Vi har endret en tidligere genetisk strategi1 ved å kombinere Dox-avhengige tra...

De fleste tilnærminger sikte på gene og protein ablations stole på permanent prosesser, som vanligvis fører til fullstendig eliminering eller trunkering av genet, RNA sekvenser eller protein av interesse (POI). Det overordnede målet med denne metoden er å en rekombinant protein for å avskaffe funksjonen endogene, vill-type protein. Vi har revisited og fornyet en alternativ strategi1,2, som gir den midlertidige ablation en POI gjennom DN hemming. Denne metoden fungerer for både multimeric og monomerisk peptider men er best egnet for proteiner som fungerer i en multimeric samling.
Metoden består av blander den lysosomale protease CB til en undergruppe til en multimeric POI (CB fusion komplekse). Den resulterende CB fusion komplekse kan samhandle med og proteolytically fordøye endogene protein eller viderekoble hele CB-POI komplisert å lysosome være dårligere3. Dessuten, en kombinasjon av CB fusion kompleks med induserbart natur tetracycline-kontrollerte transcriptional Aktivisering (Tejo) systemet gir uttrykk induserbart og kontrollert av transgene i en reversibel mote2. Selv om det er nyttig i mange tilfeller, kan fullstendig sletting av gener eller proteiner i vivo føre dødelighet4,5,6. Likeledes, vev-spesifikke, betinget sletting av noen gener eller proteiner ved hjelp av grobunn/Lox systemet kan ikke være enkelt, som det vil til slutt føre til permanent tap av kritisk genomisk elements7. Derfor, avhengig av genet eller POI, ingen av disse metodene vil være effektiv inne skaffer nyttig modell for etterfølgende studier, spesielt gener eller proteiner funksjonelle studier i slutten postnatal og voksen mus.
For å omgå problemene knyttet til slike tilnærminger og gi bevis-av-prinsippet om effektiviteten av foreslåtte metoden, har vi valgt å teste metoden presentert her ved å generere en betinget DN versjon av Retinoblastoma 1 (RB1) protein. Flere alternativer er foreslåtte8,9,10 å avskaffe funksjonen av endogene RB1; men alle av dem møtte noen av de samme begrensningene som er beskrevet ovenfor: permanent germline sletting av RB1 er embryonically dødelig, og samsvar med sin tumor suppressor rolle, permanente RB1 betinget sletting fører til en rekke svulster11. Selv om en DN versjon av RB1 ikke synes å oppstå naturlig, et bedre alternativ tilgjengelig strategier bør tillate en timelig kontrollert inaktivering av endogene RB1 og tilbyr en alternativ mekanisme til slutt gjenopprette sine funksjonen. Grunnlaget for slik en konstruksjon ble beskrevet over to tiår siden1. Men på grunn av teknologiske begrensninger manglet det en mekanisme for å kontrollere transgene aktivering, svar og vev spesifisitet. Denne studien er først til å kombinere eleganse doxycycline (Dox)-avhengige transcriptional system med en konstruert transgene konstruere lysosomale protease CB og Rb1 proteiner. Den resulterende CBRb mus modellen gir en midlertidig regulert Dox-mediert RB1 forskrift2. Fordelen av benytter slik proteom-basert tilnærming til å studere gen funksjon er at det kan bli vedtatt for noen genet av interesse, med minimal informasjon om sin virksomhet.
Den foreslåtte DN transgene strategien gir mange fordeler over tradisjonelle tilnærminger. Først fører DN protein hemming til bare en delvis ablasjon i protein aktivitet, dermed bevare en gjenværende endogene uttrykk. Slikt resultat er svært ønskelig i situasjoner der en fullstendig eliminering av protein aktivitet fører til embryonale dødelighet, sterkt begrense en undersøkelse for å studere gen funksjon i levende mus. Andre kan tilstedeværelsen av Tejo systemet transgene aktivisering kun gjennom en antibiotika, noe som gir en effektiv og reversibel kontroll av transgene aktivitet. Dermed transgene systemet kan deaktiveres ved opphør av antibiotikumet administrasjon, og et vanlig RB1 uttrykk er tilbake på plass. Tredje kan spesifisiteten av transgene uttrykket variere avhengig av arrangøren av valg. Mens vi har valgt allestedsnærværende ROSA-CAG arrangøren for bevis-av-prinsippet, er plassere transgene under en vev-spesifikke promoter sannsynlig å begrense uønsket transgene uttrykk og lette studier på terapeutiske anvendelse av denne transgene metodikk.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:768px;" width="769">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:255px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium, DMEM</td>
			<td style="width:228px;">GIBCO-BRL</td>
			<td style="width:119px;">11965-084</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Minimum Essential Medium Eagle, MEME&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">M8042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F2442&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Lipofectamine&#160;</td>
			<td style="width:228px;">DharmaFECT</td>
			<td style="width:119px;">T-2010-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Sal I</td>
			<td style="width:228px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11745622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">EcoRV-HF</td>
			<td style="width:228px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R3195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">NotI</td>
			<td style="width:228px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">13090730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CaspaTag&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">APT523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">DAPI</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Staurosporine</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CyQuant NF cell proliferation kit&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C35007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Retinoblastoma 1 antibody</td>
			<td style="width:228px;">Abcam</td>
			<td>Ab6075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">c-Myc antibody</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td>M5546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">b-actin</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td>A5316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ki-67&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">MA5-14520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Phallodin</td>
			<td style="width:228px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence microplate reader</td>
			<td style="width:228px;">FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Epifluorescence microscope&#160;</td>
			<td style="width:228px;">NikonEclipse80i</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:601px;">The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011.&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducible and reversible dominant-negative (dn) protein inhibition

Dominerende-negativ (DN) protein hemming er en kraftig metode å manipulere protein funksjon og tilbyr flere fordeler over andre genomet tilnærminger. For eksempel, selv om chimeric og Grobunn-LoxP målretting strategier mye brukt, iboende begrensninger av disse strategiene (dvs. lekk promoter aktivitet, mosaikk grobunn uttrykk, etc.) har betydelig begrenset deres program. Videre er en fullstendig sletting av mange endogene gener embryonically dødelig, gjør det umulig å studere gen funksjon i postnatal liv. For å møte disse utfordringene vi har gjort betydelige endringer i en tidlig genteknologi protokoll og kombinert kort (transgene) versjon av Rb1 genet med en lysosomale protease procathepsin B (CB), til å generere en DN musemodell av Rb1 (CBRb). På grunn av tilstedeværelsen av en lysosomale protease rutes hele CB-RB1 fusion protein og dens samspill kompleks til proteasome-mediert fornedrelse. Videre kan tilstedeværelsen av et tetracycline induser (rtTA) element i transgene Konstruer en induserbart og reversibel regulering av RB1 protein. Tilstedeværelsen av en allestedsnærværende ROSA-CAG promoter i CBRb musemodell gjør det en nyttig verktøyet å utføre forbigående og reversibel Rb1 gene ablasjon og gi forskerne en ressurs for å forstå sin virksomhet i nesten en celle type hvor RB1 er uttrykt.

Vanligvis krever utforme en DN mutasjon en betydelig mengde informasjon om strukturen og funksjon av POI. Derimot er DN strategien presenteres her spesielt nyttig når strukturelle og funksjonelle informasjonen for SEVERDIGHETEN er begrenset. Hvis POI er et protein som multimeric, en blanding av én delenhet til en lysosomale protease nesten kun kan hemme den sammensatte multimer og eventuelt andre ligander gjennom en kombinasjon av proteolyse av de endogene underenheter og subcellular av...

Watch this Scientific Journal Video about Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition at JoVE.com

Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition

Her presenterer vi en protokoll for å utvikle en dominerende-negativ induserbart system, der alle protein kan betinget deaktiveres av reversibel overexpressing en dominerende-negativ mutert versjon av den.

Induserbart og reversibel dominerende-negativ (DN) Protein hemming

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål på en rekke felt som krever betinget og forbigående inaktivering av et gen av interesse ved å reversere over-uttrykke en dominerende negativ versjon av det. Den største fordelen med denne teknikken er at den bare tillater en delvis ablasjon i proteinaktivitet, og dermed bevare et gjenværende endogene uttrykk. Selv om vi her beskriver tilstanden inaktivering av RB-protein, som fungerer i en multimerisk montering, kan denne metodikken også brukes på monomeriske proteiner.Umesh Pyakurel, vår laboratorietekniniker og en medforfatter i manuskriptet vil demonstrere prosedyrene. Til å begynne, vokse NIH3T3 celler, etter leverandørens spesifikasjoner, på 37 grader Celsius med 5% CO2, ved hjelp av den anbefalte cellekultur medium som inneholder 10% foster storfe serum. For å samtidige cellene ved hjelp av pTet-Splice og pCMV-Tet3G vektorer, bland først to til fire mikroliter av lipidbasert transfection reagens per brønn, og en milliliter ufullstendig DMEM per brønn i et 15 milliliter rør, og inkuber i fem minutter ved romtemperatur.Tilsett to til tre mikrogram plasma-DNA per brønn i denne transfection reagens DMEM-blandingen. Bland og inkuber i 20 minutter ved romtemperatur. Tilsett en milliliter av blandingen som inneholder DNA og transfeksjonsreagensen i DMEM til hver brønn på seksbrønnsplate med NIH3T3-celler.Etter tre til fire timers inkubasjon ved 37 grader Celsius med 5% CO2, legg til en milliliter komplett medium. Deretter legger du til 2 mikroliter doxycyklin lager til hver brønn og merke platen som plus-doxycycline. Inkuber cellene ved 37 grader Celsius med 5%CO2.For å vurdere funksjonaliteten til TetO-DN-CB-myc6-Rb1 konstruere i å fremme ikke-planlagt celle spredning, kultur HEI-OC1 celler i DMEM inneholder 10% FBS, under tillatte forhold. For cellespredningsstudier teller du HEI-OC1-cellene ved hjelp av en celleteller. Plate 10, 000 HEI-OC1 celler per brønn på en 96-brønns plate i 200 mikroliter volum hver.Inkuber cellene over natten ved 33 grader Celsius med 5%CO2. For å indusere transgenuttrykk, legg til ett mikrogram per milliliter doxycyklin i et delsett av transfectede HEI-OC1-celler. Bruk det andre delsettet merket som minus-doxycyklin og de ikke-trans infiserte HEI-OC1-cellene som kontroller, og inkuber cellene som 33 grader Celsius med 10% CO2.For å vurdere cellespredning, 48 timer etter transfeksjon, fjern cellekulturmediet og legg til 100 mikroliter 1x fargestoffbindingsløsning fra et celleproliferasjonssett til hver brønn av mikroplaten. Følg produsentens protokoll og inkuber i en time ved 37 grader Celsius. Bruk en fluorescens mikroplateleser til å måle fluorescensintensiteten til hver prøve.For ytterligere å vurdere cellespredning ved hjelp av immunocytokjemi, plate HEI-OC1 cellene på et deksel glass plassert i hver brønn av en 12-brønns plate i DMEM. Inkuber cellene over natten ved 33 grader Celsius. På følgende dag, cotransfect til cellene i to brønner med pTet-spleis og pCMV-Tet3G vektorer, og deretter utføre doxycyklin behandling på en godt som ferdig med NIH3T3 celler.Bruk en uoversettt samt en kontroll. For å behandle cellene for Ki-67 merking, fikse dem med 4% paraformaldehyd i PBS i 10 minutter ved romtemperatur. Deretter vasker du dem tre ganger med iskald PBS i fem minutter hver.Legg til 0,25 % ikke-ionisk vaskemiddel i PBS, og inkuber i 10 minutter. Gjenta vasken tre ganger i PBS i fem minutter hver. Bruk 10 % serum til å blokkere cellene.I et fuktet kammer i en time ved romtemperatur. Tilsett 500 mikroliter ki-67 primære antistoff og inkuber over natten ved fire grader Celsius. Vask cellene igjen tre ganger i PBS i fem minutter hver.Tilsett en milliliter av det sekundære antistoffet og inkuber cellene i en time ved romtemperatur i mørket. Etter å ha fjernet den sekundære antistoffoppløsningen, vask cellene igjen tre ganger i fem minutter i PBS i mørket. For å merke HEI-OC1-cellene med falloidin, inkuber dem i 1:200 falloidin i 30 minutter ved romtemperatur.For å merke cellekjernene, inkuber cellene med fem mikrogram per milliliter DAPI I 10 minutter ved romtemperatur. Etter levering av transgenemusene, genotype valpene ved hjelp av en primer sett som er spesifikk for CBRb1 fusjonsregionen som beskrevet i manuskriptet. Avle voksne TetO-DN-CB-myc6-Rb1 mus til ROSA-CAG-rtTA og tetrecyklin inducer linje for å generere eksperimentelle DN-CBRb mus, og genotype sine avkom som beskrevet i manuskriptet.NIH3T3 uttrykker ikke endogene RB1 protein, så den robuste RB1 uttrykket sett her skyldes transgen induksjon i nærvær av Dox, men ikke i sitt fravær, bekrefter effektiv aktivering av TetO-DN-CB-CB-myc6-Rb1 mix RB1 konstruere. I motsetning har HEK293 celler endogene RB1-uttrykk. Tillegg av doxycycline førte til TetO-DN-CB-myc6-Rb1 aktivering og RB1 down-regulation.RB1-uttrykket ble gjenopptatt 21 timer etter at doxycyklin ble fjernet fra media. HEI-OC1-celler som er samtidig med de samme vektorene, viste en beskjeden, men signifikant økning i cellenummer følger doxycyklinbehandling sammenlignet med trans infiserte celler som ikke behandles med doxycyklin, og de uoversettte cellene. Fluorescerende in situ hybridisering bekreftet genomisk innsetting av TetO-DN-CB-myc6-RB1 transgene hos mus.Det var en innledende økning i totalt RB1 proteinuttrykk i sneglehuset av de transgene musene behandlet med doxycyklin i tre dager sammenlignet med kontrollgruppen. I grupper behandlet med doxocyklin i syv og ti dager ble det imidlertid observert en signifikant reduksjon i RB1-uttrykket. Uavhengig av vevet som ble analysert, ble det observert en signifikant reduksjon i RB1-protein hos transgene mus behandlet med doxocyklin, men ikke i kontrollgruppen, noe som bekrefter effektiviteten til TetO-DN-CB-myc6-RB1-konstruksjonen.Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å kontrollere at hvert av kodeelementene i transgene er i ramme med hverandre. Hvis kodeområdene Cathepsin B og retinoblastom beskrevet i denne rapporten ved en tilfeldighet var koblet ut av rammen, ville det ikke gi det tiltenkte fusjonsproteinet. Dermed må DNA sekvens verifisering gjøres før injisere transgene i encellede mus embryoer.Etter denne prosedyren kan den allestedsnærværende CAG-arrangøren erstattes med spesifikke arrangører for å studere genfunksjon på en celles spesifikke måte.

Research

JoVE Journal

Genetics

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Inducerbart T7 RNA Polymerase-mediert Multigen Expressions System, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Generering av Fluorescent Protein Fusions i<em&gt; Candida</em&gt; Arter

Candida species, prevalent colonizers of the intestinal and genitourinary tracts, are the cause of the majority of invasive fungal infections in humans. ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Kontrollerbar Ion Channel Expression gjennom induserbar Transient Transfeksjon

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection CRISPR/Cas9 protein i kanalen Gråsteinbit, Ictalurus punctatus, embryo for Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Grunnleggende og induserbart systemer for genetisk i Vivo endring av musen hepatocytter bruker etter halen blodåre injeksjon

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identifikasjon av homologe rekombinasjon hendelser i mus embryonale stamceller Southern Blotting og polymerasekjedereaksjons

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Induserbart, celle Type-spesifikk uttrykk i Arabidopsis thaliana gjennom LhGR-mediert Trans-aktivisering

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Masse massespektrometri-baserte Proteomikk analyser bruker OpenProt databasen å avsløre romanen proteiner oversatt fra ikke-kanoniske åpent lesing rammer

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

En analyse for kvantifisere protein-RNA binding i bakterier

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

I vitro biokjemiske analyser ved hjelp av biotin etiketter for å studere protein-nukleinsyre acid interaksjoner

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...