Name: inducible and reversible dominant-negative (dn) protein inhibition
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition at JoVE.com

O pCS2 + CB-Myc6 vector foi um presente do Marshall Horwitz (Universidade de Washington, Seattle, WA, Estados Unidos da América). As células de IES-OC1 foram gentilmente cedidas por Fedrico Kalinec (David Geffen School of Medicine, UCLA, Los Angeles, CA, EUA). Suporte técnico foi fornecido por UNMC Mouse genoma engenharia núcleo (C.B. Itala, Don Harms, Rolen Quadros) e a Creighton University Biomedical Imaging usina integrada (Richard Hallworth, John Billheimer). A engenharia de genoma UNMC Mouse foi apoiado por um prêmio de desenvolvimento institucional (ideia) do NIH/NIGMS, conceda número GM103471 P20. A usina integrada de imagem biomédica foi apoiada pela escola de medicina e doações GM103427 e GM110768 do NIH/NIGMS Universidade Creighton. A instalação foi construída com o apoio de subsídios do centro nacional para recursos de pesquisa (RR016469) e o NIGMS (GM103427). As linhas de rato geradas neste estudo foram mantidas em instalações de recurso Animal da Universidade de Creighton, cuja infra-estrutura foi melhorada através de uma concessão pelo NIH/NCRR G20RR024001. Este trabalho recebido passado apoio através de um NIH/NCRR 5P20RR018788-/ NIH/NIGMS 8P20GM103471 COBRE conceder (a Shelley D. Smith), NIH/ORIP R21OD019745-01A1 (S.M.R.-S.) e uma bolsa de investigação emergentes da Fundação de saúde auditiva (de S. Jorge). O conteúdo desta pesquisa é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do institutos nacionais da saúde.

Geração de transgênicos CBRb mouse e todos os cuidados com animais e experiências associadas com o estudo foram aprovadas pelos cuidados institucionais do Animal de Creighton University e uso Comité (IACUC) e realizado por suas orientações.
1. transgênicos CB-Myc6-construção de Rb1
Nota: A clonagem em um vetor de pTet_Splice de CBRb foi feita em um processo de várias etapa (figura 1A e 1B</st...

<ol>
	<li>Li, F. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+MyoD+homodimer+formation+demonstrated+by+a+general+method+of+dominant+negative+mutation+employing+fusion+with+a+lysosomal+protease.">Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease.</a> Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).</li><li>Tarang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+retinoblastoma+(rb)1-inducible+dominant-negative+(DN)+mouse+model.">Generation of a retinoblastoma (rb)1-inducible dominant-negative (DN) mouse model.</a> Frontiers Cellular Neuroscience. 9 (52), (2015).</li><li>Kominami, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+selective+role+of+cathepsins+B+and+D+in+the+lysosomal+degradation+of+endogenous+and+exogenous+proteins.">The selective role of cathepsins B and D in the lysosomal degradation of endogenous and exogenous proteins.</a> FEBS Letters. 287 (1-2), 189-192 (1991).</li><li>Cortellino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+ciliogenesis,+embryonic+lethality+and+severe+impairment+of+the+sonic+hedgehog+pathway+caused+by+inactivation+of+the+mouse+complex+A+intraflagellar+transport+gene+Ift122/Wdr10,+partially+overlapping+with+the+DNA+repair+gene+Med1/Mbd4.">Defective ciliogenesis, embryonic lethality and severe impairment of the sonic hedgehog pathway caused by inactivation of the mouse complex A intraflagellar transport gene Ift122/Wdr10, partially overlapping with the DNA repair gene Med1/Mbd4.</a> Developmental Biology. 325 (1), 225-237 (2009).</li><li>Ferreira, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+embryonic+lethality+of+H+ferritin+gene+deletion+in+mice.">Early embryonic lethality of H ferritin gene deletion in mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3021-3024 (2000).</li><li>Lee, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+deficient+for+rb+are+nonviable+and+show+defects+in+neurogenesis+and+haematopoiesis.">Mice deficient for rb are nonviable and show defects in neurogenesis and haematopoiesis.</a> Nature. 359 (6393), 288-294 (1992).</li><li>Turlo, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+cre-mediated+recombination+in+mice+does+not+result+in+protein+loss.">When cre-mediated recombination in mice does not result in protein loss.</a> Genetics. 186 (3), 959-967 (2010).</li><li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+cell-cycle+reentry+and+cell+death+after+acute+inactivation+of+the+retinoblastoma+gene+product+in+postnatal+cochlear+hair+cells.">Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+knockout+mouse+model+of+retinoblastoma.">The first knockout mouse model of retinoblastoma.</a> Cell Cycle. 3 (7), 952-959 (2004).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletions+of+retinoblastoma+1+(Rb1)+and+its+repressing+target+S+phase+kinase-associated+protein+2+(Skp2)+are+synthetic+lethal+in+mouse+embryogenesis.">Deletions of retinoblastoma 1 (Rb1) and its repressing target S phase kinase-associated protein 2 (Skp2) are synthetic lethal in mouse embryogenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10201-10209 (2016).</li><li>Yamasaki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+E2F-1+reduces+tumorigenesis+and+extends+the+lifespan+of+Rb1(+/-)+mice.">Loss of E2F-1 reduces tumorigenesis and extends the lifespan of Rb1(+/-) mice.</a> Nature Genetics. 18 (4), 360-364 (1998).</li><li>Li, F. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+a+dominant+negative+retinoblastoma+protein+(RB)+inhibiting+satellite+myoblast+differentiation+implies+an+indirect+interaction+between+MyoD+and+RB.">Selection of a dominant negative retinoblastoma protein (RB) inhibiting satellite myoblast differentiation implies an indirect interaction between MyoD and RB.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5129-5139 (2000).</li><li>Pitkanen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+human+retinoblastoma+gene+product+in+mouse+fibroblasts:+Effects+on+cell+proliferation+and+susceptibility+to+transformation.">Expression of the human retinoblastoma gene product in mouse fibroblasts: Effects on cell proliferation and susceptibility to transformation.</a> Experimental Cell Research. 207 (1), 99-106 (1993).</li><li>Chano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+abundance+of+RB1CC1+contributes+to+the+non-proliferating+enlarged+cell+phenotype+through+both+RB1+maintenance+and+TSC1+degradation.">Neuromuscular abundance of RB1CC1 contributes to the non-proliferating enlarged cell phenotype through both RB1 maintenance and TSC1 degradation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 18 (3), 425-432 (2006).</li><li>Kole, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+therapeutics:+Beyond+RNA+interference+and+antisense+oligonucleotides.">RNA therapeutics: Beyond RNA interference and antisense oligonucleotides.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 11 (2), 125-140 (2012).</li><li>Yamamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ons+and+offs+of+inducible+transgenic+technology:+A+review.">The ons and offs of inducible transgenic technology: A review.</a> Neurobiology of Disease. 8 (6), 923-932 (2001).</li><li>Houdebine, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+animal+models+in+biomedical+research.">Transgenic animal models in biomedical research.</a> Methods in Molecular Biology. 360, 163-202 (2007).</li><li>Brehm, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoblastoma+protein+recruits+histone+deacetylase+to+repress+transcription.">Retinoblastoma protein recruits histone deacetylase to repress transcription.</a> Nature. 391 (6667), 597-601 (1998).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E2F-HDAC+complexes+negatively+regulate+the+tumor+suppressor+gene+ARHI+in+breast+cancer.">E2F-HDAC complexes negatively regulate the tumor suppressor gene ARHI in breast cancer.</a> Oncogene. 25 (2), 230-239 (2006).</li><li>Magnaghi-Jaulin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoblastoma+protein+represses+transcription+by+recruiting+a+histone+deacetylase.">Retinoblastoma protein represses transcription by recruiting a histone deacetylase.</a> Nature. 391 (6667), 601-605 (1998).</li></ol>

Para contornar as limitações associadas com as estratégias tradicionais de transgénicas, procuramos gerar um modelo de mouse em que um POI endógena pode ser condicionalmente inativado pela superexpressão uma forma mutante de DN do de uma forma spatiotemporal. Suprimir a função de POIs endógenas, várias opções foram propostos15,16,17. Modificamos um anterior estratégia genética1 , combinando ...

A maioria das abordagens visando os gene e proteína ablações dependem de processos de permanentes, que geralmente levam à eliminação completa ou truncamento do gene, sequências de RNA ou proteína de interesse (POI). O objetivo geral deste método é engenheiro uma proteína recombinante para suprimir a função da proteína endógena, selvagem-tipo. Nós temos revisitado e renovada uma estratégia alternativa1,2, que permite a ablação temporária de um POI através da inibição de DN. Esse método funciona para ambos multiméricas e peptídeos monoméricos, mas é o mais adequado para as proteínas que funcionam em um assembly multiméricas.
O método consiste em fundir a protease lisossômica CB para uma subunidade de uma multiméricas POI (fusão de CB complexo). A fusão de CB resultante complexa pode interagir com e proteoliticamente digerir a proteína endógena ou desviar todo o complexo para o lisossoma para ser degradada3CB-POI. Além disso, uma combinação da fusão CB complexa com a natureza inducible do sistema controlado por tetraciclina ativação transcricional (TetO) permite uma expressão inducible e controlada do transgene em uma moda reversível2. Embora útil em muitas circunstâncias, a completa eliminação de genes ou proteínas in vivo pode resultar em letalidade4,5,6. Da mesma forma, exclusão condicional, tecido-específica de alguns genes ou proteínas utilizando o sistema Cre/Lox pode não ser simples, como, em última análise, conduzirá à perda permanente de elementos críticos de genômica7. Portanto, dependendo do gene ou POI, nenhuma dessas abordagens será eficaz em fornecer um modelo útil para estudos posteriores, particularmente dos genes ou dos proteínas estudos funcionais em camundongos adultos e pós-natal atrasados.
Para contornar os problemas associados com tais abordagens e fornecer prova de princípio sobre a eficácia do método proposto, decidimos testar o método apresentado aqui, gerando uma versão DN condicional da proteína do Retinoblastoma 1 (RB1). Várias opções foram propostos8,9,10 para abolir a função de RB1 endógena; no entanto, todos eles enfrentaram algumas das mesmas limitações discutidas acima: exclusão permanente germline de RB1 é embryonically letal, e, coerente com seu papel de supressor de tumor, permanente exclusão condicional RB1 leva a uma variedade de tumores11. Apesar de uma versão do DN de RB1 não parece ocorrer naturalmente, uma alternativa melhor para as estratégias atualmente disponíveis deve permitir uma inativação temporalmente controlada do RB1 endógena e fornecem um mecanismo alternativo para eventualmente restaurar sua função. A base para tal uma construção foi descrita há mais de duas décadas atrás1. No entanto, devido às limitações tecnológicas, faltava-lhe um mecanismo de controle do transgene ativação de resposta e especificidade de tecido. Este estudo é o primeiro a combinar a elegância de doxiciclina (Dox)-sistema transcriptional dependente com uma engenharia construção transgênica de protease lisossômica CB e Rb1 proteínas. O modelo resultante do rato CBRb permite um temporariamente regulamentado RB1 mediada por Dox regra2. A vantagem de usar uma abordagem baseada em proteoma para estudar a função dos genes é que pode ser adotado para qualquer gene de interesse, com informações mínimas sobre a sua actividade.
A estratégia proposta do transgene DN oferece muitas vantagens sobre as abordagens tradicionais. Primeiro, inibição da proteína de DN leva a apenas uma ablação parcial na atividade da proteína, preservando assim uma expressão residual endógena. Esse resultado é altamente desejável em situações onde uma eliminação completa da atividade da proteína leva a letalidade embrionária, limitando grandemente qualquer investigação para estudar a função do gene em um rato vivo. Em segundo lugar, a presença do sistema de TetO permite ativação do transgene apenas na presença de um antibiótico, o que permite um controle eficiente e reversível da atividade do transgene. Assim, por cessar a administração de antibióticos, o sistema transgênico pode ser desativado, e uma expressão normal de RB1 está de volta em casa. Em terceiro lugar, a especificidade da expressão do transgene pode variar dependendo do promotor da escolha. Enquanto nós escolhemos o promotor ROSA-CAG onipresente para prova de princípio, colocar o transgene sob um promotor de tecido-específica é susceptível de restringir a expressão do transgene indesejados e facilitar estudos sobre a aplicação terapêutica deste transgene metodologia.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:768px;" width="769">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:255px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium, DMEM</td>
			<td style="width:228px;">GIBCO-BRL</td>
			<td style="width:119px;">11965-084</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Minimum Essential Medium Eagle, MEME&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">M8042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F2442&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Lipofectamine&#160;</td>
			<td style="width:228px;">DharmaFECT</td>
			<td style="width:119px;">T-2010-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Sal I</td>
			<td style="width:228px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11745622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">EcoRV-HF</td>
			<td style="width:228px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R3195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">NotI</td>
			<td style="width:228px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">13090730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CaspaTag&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">APT523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">DAPI</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Staurosporine</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CyQuant NF cell proliferation kit&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C35007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Retinoblastoma 1 antibody</td>
			<td style="width:228px;">Abcam</td>
			<td>Ab6075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">c-Myc antibody</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td>M5546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">b-actin</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td>A5316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ki-67&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">MA5-14520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Phallodin</td>
			<td style="width:228px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence microplate reader</td>
			<td style="width:228px;">FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Epifluorescence microscope&#160;</td>
			<td style="width:228px;">NikonEclipse80i</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:601px;">The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011.&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducible and reversible dominant-negative (dn) protein inhibition

Inibição de proteína dominante negativo (DN) é um método poderoso para manipular a função da proteína e oferece diversas vantagens sobre outras abordagens de genoma. Por exemplo, embora quimérico e Cre-LoxP alvos estratégias têm sido amplamente utilizadas, as limitações intrínsecas destas estratégias (ou seja, atividade de promotor gotejante, expressão Cre de mosaico, etc) têm significativamente restringido sua aplicação. Além disso, uma eliminação completa de muitos genes endógenos é embryonically letal, tornando impossível para estudar a função dos genes na vida pós-natal. Para enfrentar estes desafios, temos fez mudanças significativas para um protocolo de engenharia genética precoce e uma versão curta (transgênica) do gene Rb1 aliada a uma protease lisossômica procathepsin B (CB), para gerar um modelo de mouse DN de Rb1 (CBRb). Devido à presença de uma protease lisossômica, a proteína de fusão CB-RB1 inteira e seu complexo de interação são roteadas para degradação mediada por Proteassoma. Além disso, a presença de um elemento de indutor (rtTA) tetraciclina na construção transgênica permite um regulamento inducible e reversível da proteína RB1. A presença de um promotor de ROSA-CAG onipresente no modelo do rato de CBRb torna uma ferramenta útil para realizar ablação de gene Rb1 transitória e reversível e fornecer um recurso de pesquisadores para a compreensão de sua atividade em praticamente qualquer tipo de célula onde RB1 é expresso.

Geralmente, a concepção de uma mutação de DN exige uma quantidade considerável de informações sobre a estrutura e função do POI. Em contraste, a estratégia de DN apresentada aqui é particularmente útil quando as informações estruturais e funcionais para o POI são limitadas. Se o POI é uma proteína multiméricas, uma fusão de uma subunidade de uma protease lisossômica dominante pode inibir o multimer montado e, potencialmente, outros ligantes através de uma combinação...

Watch this Scientific Journal Video about Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition at JoVE.com

Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition

Aqui nós apresentamos um protocolo para desenvolver um sistema inducible negativo dominante, em que qualquer proteína pode ser condicionalmente inativada pela superexpressão reversivelmente uma versão mutante dominante negativo dele.

Inibição de proteína inducible e reversível dominante-negativo (DN)

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave em uma ampla variedade de campos que requerem inativação condicional e transitória de um gene de interesse, expressando reversivelmente uma versão negativa dominante dele. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite apenas uma ablação parcial na atividade proteica, preservando assim uma expressão endógena residual. Embora, aqui descrevemos a condição de inativação da proteína RB, que funciona em um conjunto multimédico, essa metodologia também pode ser aplicada a proteínas monoméricas.Umesh Pyakurel, nosso técnico de laboratório e coautor do manuscrito demonstrará os procedimentos. Para começar, cresça células NIH3T3, seguindo as especificações do fornecedor, a 37 graus Celsius com 5% de CO2, utilizando o meio de cultura celular recomendado contendo 10% de soro bovino fetal. Para cotransfectar as células usando os vetores pTet-Splice e pCMV-Tet3G, primeiro misture dois a quatro microliters do reagente de transfecção à base de lipídios por poço, e um mililitro de DMEM incompleto por poço em um tubo de 15 mililitros, e incubar por cinco minutos à temperatura ambiente.Adicione dois a três microgramas de DNA de plasma por poço à mistura de DMEM deste reagente de transfecção. Misture e incubar por 20 minutos em temperatura ambiente. Adicione um mililitro da mistura contendo DNA e o reagente de transfecção em DMEM a cada poço de placa de seis poços com células NIH3T3.Após três a quatro horas de incubação a 37 graus Celsius com 5% de CO2, adicione um mililitro de meio completo. Em seguida, adicione 2 microliters de estoque de doxiciclina a cada poço e marque a placa como plus-doxiciclina. Incubar as células a 37 graus Celsius com 5% de CO2.Para avaliar a funcionalidade da construção TetO-DN-CB-myc6-Rb1 na promoção da proliferação celular não programada, cultura células HEI-OC1 no DMEM contendo 10% de FBS, em condições permissivas. Para estudos de proliferação celular, conte as células HEI-OC1 usando um contador celular. Placa 10.000 células HEI-OC1 por poço em uma placa de 96 poços em 200 microliters de volume cada.Incubar as células durante a noite a 33 graus Celsius com 5% de CO2. Para induzir a expressão transgênica, adicione um micrograma por mililitro de doxiciclina a um subconjunto de células HEI-OC1 transfectadas. Use o outro subconjunto rotulado como menos-doxiciclina e as células HEI-OC1 não transfectadas como controles, e incubar as células como 33 graus Celsius com 10% de CO2.Para avaliar a proliferação celular, 48 horas após a transfecção, remova o meio de cultura celular e adicione 100 microliters de solução de ligação de corante 1x de um kit de proliferação celular a cada poço da microplacante. Siga o protocolo do fabricante e incubar por uma hora a 37 graus Celsius. Use um leitor de microplaca de fluorescência para medir a intensidade da fluorescência de cada amostra.Para avaliar ainda mais a proliferação celular usando a imunocitoquímica, aplaque as células HEI-OC1 em um copo de cobertura colocado em cada poço de uma placa de 12 poços em DMEM. Incubar as células durante a noite a 33 graus Celsius. No dia seguinte, cotransfecte para as células em dois poços com os vetores pTet-Splice e pCMV-Tet3G, e então realizar o tratamento de doxiciclina em um bem como feito com as células NIH3T3.Use um não transintratado, bem como um controle. Para processar as células para rotulagem Ki-67, fixe-as com 4% de paraformaldeído em PBS por 10 minutos à temperatura ambiente. Depois disso, lave-os três vezes com PBS gelado por cinco minutos cada.Adicione 0,25% de detergente noniônico na PBS e incubar por 10 minutos. Repita a lavagem três vezes em PBS por cinco minutos cada. Use 10% de soro para bloquear as células.Em uma câmara umidificada por uma hora em temperatura ambiente. Adicione 500 microliters de anticorpos primários Ki-67 e incubar durante a noite a quatro graus Celsius. Lave as células novamente três vezes em PBS por cinco minutos cada.Adicione um mililitro do anticorpo secundário e incuba as células por uma hora à temperatura ambiente no escuro. Depois de remover a solução de anticorpos secundários, lave as células novamente três vezes por cinco minutos em PBS no escuro. Para rotular as células HEI-OC1 com fábula, incuba-as em 1:200 phalloidin por 30 minutos em temperatura ambiente.Para rotular os núcleos celulares, incubar as células com cinco microgramas por mililitro de DAPI por 10 minutos à temperatura ambiente. Após a entrega dos camundongos transgênicos, o genótipo dos filhotes usando um conjunto de primer específico para a região de fusão CBRb1, conforme descrito no manuscrito. Crie camundongos TetO-DN-CB-myc6-Rb1 para a linha de indutor ROSA-CAG-rtTA e tetrecycline para gerar camundongos DN-CBRb experimentais, e genótipo de seus descendentes, conforme descrito no manuscrito.NIH3T3 não expressa proteína RB1 endógena, por isso a expressão robusta RB1 vista aqui se deve à indução transgênica na presença do Dox, mas não na sua ausência, confirmando a ativação eficiente da construção do mix RB1 TetO-DN-CB-myc6-Rb1. Em contraste, as células HEK293 têm expressão RB1 endógena. A adição de doxycycline levou à ativação TetO-DN-CB-myc6-Rb1 e à regulação de down-regulation RB1.A expressão RB1 foi retomada 21 horas após a doxilalina ser removida da mídia. As células HEI-OC1 cotransfectadas com os mesmos vetores, apresentaram um aumento modesto, mas significativo no número de células, seguindo o tratamento da doxiciclina em comparação com as células transfeinadas não tratadas com doxiciclina, e as células não transtravadas. A hibridização fluorescente in situ confirmou a inserção genômica do transgene TetO-DN-CB-myc6-RB1 em camundongos.Houve um aumento inicial na expressão total da proteína RB1 na cóclea dos camundongos transgênicos tratados com doxiciclina por três dias em comparação com o grupo controle. Entretanto, em grupos tratados com doxociclina durante sete e 10 dias, observou-se uma redução significativa na expressão RB1. Independentemente do tecido analisado, observou-se redução significativa da proteína RB1 em camundongos transgênicos tratados com doxocycline, mas não no grupo controle, confirmando a eficiência da construção TetO-DN-CB-myc6-RB1.Ao tentar este procedimento, é importante verificar se cada um dos elementos de codificação do transgene estão em quadro entre si. Se as regiões de codificação de Cathepsin B e retinoblastoma descritas neste relatório estivessem, por acaso, conectadas fora do quadro, não produziria a proteína de fusão pretendida. Assim, a verificação da sequência de DNA deve ser feita antes de injetar o transgene em embriões de camundongos unicelulares.Após esse procedimento, o onipresente promotor cag pode ser substituído por promotores específicos, a fim de estudar a função genética de forma específica de uma célula.

Research

JoVE Journal

Genetics

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Sistema Induzível de Expressão Multigênica mediada por polimerização T7 de T7, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Genética

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Produção de fusões de proteína fluorescente em<em&gt; Candida</em&gt; Espécies

Candida species, prevalent colonizers of the intestinal and genitourinary tracts, are the cause of the majority of invasive fungal infections in humans. ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Controlável Expressão Ion Canal através de transfecção transiente Induzível

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjeção de proteína CRISPR/Cas9 em bagre do canal, Ictalurus punctatus, embriões para Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutivos e Inducible sistemas para modificação genética In Vivo dos hepatócitos de rato usando injeção de veia de cauda hidrodinâmica

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identificação de eventos de recombinação homóloga em células-tronco embrionárias de camundongo usando Southern Blotting e reação em cadeia da polimerase

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, expressão de tipo específico de célula em Arabidopsis thaliana mediada através de LhGR Trans-ativação

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Espectrometria de massa-baseado Proteomics análises usando banco de dados OpenProt para desvendar novas proteínas traduzidas de Frames de leitura abertos não-canônicos

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

Um ensaio para quantificar a ligação de RNA de proteína em bactérias

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

Ensaios bioquímicos in vitro utilizando rótulos de biotina para estudar interações ácido proteína-nucleico

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...