Name: inducible and reversible dominant-negative (dn) protein inhibition
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition at JoVE.com

PCS2 + CB-Myc6 вектор был подарок от Хорвитц Маршалл (Вашингтонский университет, Сиэтл, Вашингтон, США). ХЕЙ-OC1 клетки были любезно предоставлены Fedrico Kalinec (Дэвид Геффен школа медицины, Калифорнийского университета, Лос-Анджелес, Калифорния, США). Техническая поддержка была оказана UNMC мыши генома инженерных ядро (К.Б. Gurumurthy, Дон Хармс, Rolen Quadros) и Крейтон университета комплексной биомедицинских изображений объекта (Richard Hallworth, Джон Billheimer). UNMC мыши генома инженерных была поддержана институционального развития Award (IDea) от NIH/NIGMS, предоставьте номер P20 GM103471. Интегрированный биомедицинских изображений объекта было поддержано Крейтон университета Школа медицины и грантов, GM103427 и GM110768 от NIH/NIGMS. Объект был построен при поддержке грантов от национального центра для исследования ресурсов (RR016469) и NIGMS (GM103427). Мыши линии, созданные в этом исследовании были сохранены на Крейтон университета животных ресурсов Фонда, инфраструктура которой была улучшена посредством гранта NIH/NCRR G20RR024001. Эта работа получила в прошлом поддержка через низ/NCRR 5P20RR018788-/ низ/NIGMS 8P20GM103471 КОБРЕ предоставить (Shelley д. Смит), NIH/ORIP R21OD019745-01A1 (Ш.М.Р-S.) и возникающих исследовательский грант от фонда здравоохранения слушания (для S. таранг). Содержание этого исследования является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения национальных институтов здоровья.

Поколение трансгенные мыши НАСВВП и ухода за животными и эксперименты, связанные с исследованием были одобрены Крейтон университета институциональный уход за животными и использования Комитет (IACUC) и осуществляется их руководящих принципов.
1. трансгенных CB-Myc6-Rb1 ко...

<ol>
	<li>Li, F. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+MyoD+homodimer+formation+demonstrated+by+a+general+method+of+dominant+negative+mutation+employing+fusion+with+a+lysosomal+protease.">Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease.</a> Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).</li><li>Tarang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+retinoblastoma+(rb)1-inducible+dominant-negative+(DN)+mouse+model.">Generation of a retinoblastoma (rb)1-inducible dominant-negative (DN) mouse model.</a> Frontiers Cellular Neuroscience. 9 (52), (2015).</li><li>Kominami, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+selective+role+of+cathepsins+B+and+D+in+the+lysosomal+degradation+of+endogenous+and+exogenous+proteins.">The selective role of cathepsins B and D in the lysosomal degradation of endogenous and exogenous proteins.</a> FEBS Letters. 287 (1-2), 189-192 (1991).</li><li>Cortellino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+ciliogenesis,+embryonic+lethality+and+severe+impairment+of+the+sonic+hedgehog+pathway+caused+by+inactivation+of+the+mouse+complex+A+intraflagellar+transport+gene+Ift122/Wdr10,+partially+overlapping+with+the+DNA+repair+gene+Med1/Mbd4.">Defective ciliogenesis, embryonic lethality and severe impairment of the sonic hedgehog pathway caused by inactivation of the mouse complex A intraflagellar transport gene Ift122/Wdr10, partially overlapping with the DNA repair gene Med1/Mbd4.</a> Developmental Biology. 325 (1), 225-237 (2009).</li><li>Ferreira, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+embryonic+lethality+of+H+ferritin+gene+deletion+in+mice.">Early embryonic lethality of H ferritin gene deletion in mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3021-3024 (2000).</li><li>Lee, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+deficient+for+rb+are+nonviable+and+show+defects+in+neurogenesis+and+haematopoiesis.">Mice deficient for rb are nonviable and show defects in neurogenesis and haematopoiesis.</a> Nature. 359 (6393), 288-294 (1992).</li><li>Turlo, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+cre-mediated+recombination+in+mice+does+not+result+in+protein+loss.">When cre-mediated recombination in mice does not result in protein loss.</a> Genetics. 186 (3), 959-967 (2010).</li><li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+cell-cycle+reentry+and+cell+death+after+acute+inactivation+of+the+retinoblastoma+gene+product+in+postnatal+cochlear+hair+cells.">Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+knockout+mouse+model+of+retinoblastoma.">The first knockout mouse model of retinoblastoma.</a> Cell Cycle. 3 (7), 952-959 (2004).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletions+of+retinoblastoma+1+(Rb1)+and+its+repressing+target+S+phase+kinase-associated+protein+2+(Skp2)+are+synthetic+lethal+in+mouse+embryogenesis.">Deletions of retinoblastoma 1 (Rb1) and its repressing target S phase kinase-associated protein 2 (Skp2) are synthetic lethal in mouse embryogenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10201-10209 (2016).</li><li>Yamasaki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+E2F-1+reduces+tumorigenesis+and+extends+the+lifespan+of+Rb1(+/-)+mice.">Loss of E2F-1 reduces tumorigenesis and extends the lifespan of Rb1(+/-) mice.</a> Nature Genetics. 18 (4), 360-364 (1998).</li><li>Li, F. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+a+dominant+negative+retinoblastoma+protein+(RB)+inhibiting+satellite+myoblast+differentiation+implies+an+indirect+interaction+between+MyoD+and+RB.">Selection of a dominant negative retinoblastoma protein (RB) inhibiting satellite myoblast differentiation implies an indirect interaction between MyoD and RB.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5129-5139 (2000).</li><li>Pitkanen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+human+retinoblastoma+gene+product+in+mouse+fibroblasts:+Effects+on+cell+proliferation+and+susceptibility+to+transformation.">Expression of the human retinoblastoma gene product in mouse fibroblasts: Effects on cell proliferation and susceptibility to transformation.</a> Experimental Cell Research. 207 (1), 99-106 (1993).</li><li>Chano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+abundance+of+RB1CC1+contributes+to+the+non-proliferating+enlarged+cell+phenotype+through+both+RB1+maintenance+and+TSC1+degradation.">Neuromuscular abundance of RB1CC1 contributes to the non-proliferating enlarged cell phenotype through both RB1 maintenance and TSC1 degradation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 18 (3), 425-432 (2006).</li><li>Kole, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+therapeutics:+Beyond+RNA+interference+and+antisense+oligonucleotides.">RNA therapeutics: Beyond RNA interference and antisense oligonucleotides.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 11 (2), 125-140 (2012).</li><li>Yamamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ons+and+offs+of+inducible+transgenic+technology:+A+review.">The ons and offs of inducible transgenic technology: A review.</a> Neurobiology of Disease. 8 (6), 923-932 (2001).</li><li>Houdebine, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+animal+models+in+biomedical+research.">Transgenic animal models in biomedical research.</a> Methods in Molecular Biology. 360, 163-202 (2007).</li><li>Brehm, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoblastoma+protein+recruits+histone+deacetylase+to+repress+transcription.">Retinoblastoma protein recruits histone deacetylase to repress transcription.</a> Nature. 391 (6667), 597-601 (1998).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E2F-HDAC+complexes+negatively+regulate+the+tumor+suppressor+gene+ARHI+in+breast+cancer.">E2F-HDAC complexes negatively regulate the tumor suppressor gene ARHI in breast cancer.</a> Oncogene. 25 (2), 230-239 (2006).</li><li>Magnaghi-Jaulin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoblastoma+protein+represses+transcription+by+recruiting+a+histone+deacetylase.">Retinoblastoma protein represses transcription by recruiting a histone deacetylase.</a> Nature. 391 (6667), 601-605 (1998).</li></ol>

Чтобы обойти ограничения, связанные с традиционными трансгенных стратегии, мы стремились создать модель мыши, в котором эндогенного POI могут быть условно инактивированная экспрессирующих DN мутантные формы его на основе пространственно-временных. Чтобы отменить функцию эндогенного POI...

Большинство подходов, направленных на генов и белков аблаций полагаются на постоянные процессы, которые обычно приводят к полной ликвидации или усечение гена, РНК последовательности или протеин интереса (POI). Общая цель этого метода является инженер рекомбинантных белков отменить функцию эндогенные, одичал тип протеина. У нас пересмотреть и обновленный альтернативная стратегия1,2, который позволяет для временного абляции POI через ингибитирование DN. Этот метод работает для multimeric и мономерных пептидов, но лучше всего подходит для белков, которые функционируют в сборке multimeric.
Этот метод состоит из фьюзинга лизосомальных протеазы CB для субблока multimeric Пои (CB фьюжн комплекс). Результирующая CB фьюжн комплекс может взаимодействовать с и proteolytically дайджест эндогенного белка или отвлекать весь комплекс CB-Пои для Лизосома деградированных3. Кроме того сочетание CB фьюжн комплекс с индуцибельной характер системы контролируемой тетрациклин transcriptional активации (Тето) позволяет выражение индуцибельной и контролируемых трансген в реверсивные мода2. Хотя полезно во многих случаях, полное исключение генов или белков в естественных условиях может привести к летальность4,5,6. Аналогичным образом ткани конкретным, условного удаления некоторых генов или белки, с использованием системы Cre/Lox не может быть простым, как это в конечном счете, приведет к постоянной потере критических геномной элементы7. Таким образом, в зависимости от гена или POI, ни один из этих подходов будет эффективным в предоставлении полезной моделью для последующих исследований, особенно генов или белки функциональных исследований в конце послеродового и взрослых мышей.
Чтобы обойти проблемы, связанные с такими подходами и обеспечить доказательство принципа эффективности предложенного метода, мы выбрали для тестирования метода, представленные здесь, создавая условный DN версию белка ретинобластомы 1 (RB1). Несколько вариантов были предлагаемые8,9,10 отменить функцию эндогенного RB1; Однако, все они сталкиваются некоторые из те же ограничения, обсуждавшиеся выше: исключить постоянное микрофлорой RB1 embryonically смертельной, и, в соответствии с его опухоль подавитель роль, постоянного RB1 условного удаления приводит к различных опухолей11. Даже несмотря на то, что версия DN RB1, как представляется, не происходят естественно, лучшей альтернативы для имеющихся в настоящее время стратегии позволяют временно контролируемых инактивации эндогенного RB1 и предоставить альтернативный механизм в конечном итоге восстановить ее функция. Основой для такой конструкции был описан более двух десятилетий назад1. Однако из-за технологических ограничений, это не механизм для активации управления трансген, ответ и специфика ткани. Это исследование является первым, чтобы совместить элегантность доксициклин (Dox)-зависимых транскрипционный анализ системы с конструкцией инженерии трансгенных лизосомальных протеазы CB и Rb1 белков. Полученная в результате модель мыши НАСВВП позволяет временно регулируемых Dox опосредованной RB1 правила2. Преимущество использования такого подхода, основанного на протеома для изучения функции гена является, что он может быть принят для любого гена интереса, с минимальной информации о своей деятельности.
Предлагаемая стратегия трансген DN имеет много преимуществ над традиционными подходами. Во-первых DN белка ингибирование приводит к только частичное абляции активности белка, таким образом, сохраняя остаточного эндогенного выражение. Такой результат является весьма желательным в ситуациях, где полная ликвидация деятельности белка приводит к эмбриональной летальность, значительно ограничивает любое расследование для изучения функции гена в живой мыши. Во-вторых наличие системы Тето позволяет трансген активации только в присутствии антибиотик, который позволяет для эффективной и обратимым контроль деятельности трансген. Таким образом путем прекращения антибиотиков, трансгенных система может быть отключена, и нормальное выражение RB1 обратно на место. В-третьих специфика трансген выражение может варьироваться в зависимости от промоутера выбора. В то время как мы выбрали вездесущие Роза-CAG промоутер для доказательства в принципе, поместив трансген под ткани конкретной промоутера, скорее всего ограничить нежелательные трансген выражение и облегчения исследования терапевтического применения этой трансген методология.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:768px;" width="769">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:255px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium, DMEM</td>
			<td style="width:228px;">GIBCO-BRL</td>
			<td style="width:119px;">11965-084</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Minimum Essential Medium Eagle, MEME&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">M8042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F2442&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Lipofectamine&#160;</td>
			<td style="width:228px;">DharmaFECT</td>
			<td style="width:119px;">T-2010-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Sal I</td>
			<td style="width:228px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11745622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">EcoRV-HF</td>
			<td style="width:228px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R3195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">NotI</td>
			<td style="width:228px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">13090730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CaspaTag&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">APT523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">DAPI</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Staurosporine</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CyQuant NF cell proliferation kit&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C35007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Retinoblastoma 1 antibody</td>
			<td style="width:228px;">Abcam</td>
			<td>Ab6075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">c-Myc antibody</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td>M5546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">b-actin</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td>A5316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ki-67&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">MA5-14520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Phallodin</td>
			<td style="width:228px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence microplate reader</td>
			<td style="width:228px;">FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Epifluorescence microscope&#160;</td>
			<td style="width:228px;">NikonEclipse80i</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:601px;">The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011.&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducible and reversible dominant-negative (dn) protein inhibition

Доминант отрицательные (DN) белок является мощный способ манипулировать функции протеина и предлагает несколько преимуществ над другими подходы, основанные на геном. Например хотя химерных и Cre-LoxP ориентации стратегий широко использовались, встроенные ограничения этих стратегий (т.е., протекающая промоутер активность, мозаика Cre выражения и т.д.) значительно ограничили их приложения. Кроме того полное исключение много эндогенные генов embryonically смертельной, что делает невозможным для изучения функции гена в послеродовой период жизни. Для решения этих проблем, мы внесли значительные изменения в начале протокол генной инженерии и короткая (трансгенных) версия Rb1 гена в сочетании с лизосомальных протеазы procathepsin B (CB), чтобы создать модель мыши DN Rb1 (НАСВВП). Благодаря наличию лизосомальных протеазы весь CB-RB1 синтез белка и его взаимодействующих комплекса маршрутизируются протеасом опосредованной деградации. Кроме того присутствие элемента индуктором (rtTA) тетрациклина в трансгенных конструкция позволяет индуцибельной и обратимым регулирование RB1 белка. Наличие повсеместно Роза-CAG промоутер в мышиной модели НАСВВП делает его полезным инструментом для выполнения переходных и обратимым Rb1 гена абляции и исследователи ресурс для понимания ее деятельности в практически любой тип клеток, где выражается RB1.

Как правило проектирование DN мутация требуется значительное количество информации о структуре и функции POI. В отличие от DN стратегия, представленная здесь особенно полезна, когда структурной и функциональной информации для POI ограничен. Если Пои multimeric белок, слияние о...

Watch this Scientific Journal Video about Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition at JoVE.com

Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition

Здесь мы представляем протокол развивать систему индуцибельной Доминант отрицательных, в котором любой белок может быть условно инактивированная обратимо экспрессирующих черепашки версии Доминант отрицательные.

Ингибирование белков индуцибельной и обратимым Доминант отрицательной (DN)

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в самых разнообразных областях, требующих условной и преходящей инактивации гена интереса путем обратимого чрезмерного выражения доминирующей негативной версии его. Основным преимуществом этой методики является то, что она допускает лишь частичную абляцию белковой активности, таким образом, сохраняя остаточную эндогенную экспрессию. Хотя, здесь мы описываем состояние инактивации белка РБ, который функционирует в мультимерной сборке, эта методология также может быть применена к мономерным белкам.Умеш Пякурел, наш лабораторный техник и соавтор рукописи, продемонстрирует процедуры. Для начала выращивайте клетки NIH3T3, следуя спецификациям поставщика, при 37 градусах Цельсия с 5%CO2, используя рекомендуемую клеточную культуру среды, содержащую 10%фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Для cotransfect клетки с помощью pTet-Splice и pCMV-Tet3G векторов, сначала смешать два-четыре микролитров липидной основе трансфекции реагента на колодец, и один миллилитр неполной DMEM на колодец в 15 миллилитров трубки, и инкубировать в течение пяти минут при комнатной температуре.Добавьте два-три микрограмма плазменной ДНК на колодец в смесь DMEM этого трансфектного реагента. Смешайте и инкубировать в течение 20 минут при комнатной температуре. Добавьте один миллилитр смеси, содержащей ДНК и реагент трансфекции в DMEM, к каждому колодец из шести хорошо пластины с клетками NIH3T3.После трех-четырех часов инкубации при 37 градусах Цельсия с 5%CO2, добавьте один миллилитр полной среды. Затем добавьте 2 микролитров доксициклина к каждому колодец и отметйте пластину как плюс-доксициклин. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию с 5%CO2.Оценить функциональность конструкции TetO-DN-CB-myc6-Rb1 в содействии незапланированному распространению клеток, культуры клеток HEI-OC1 в DMEM, содержащих 10%FBS, в разрешительных условиях. Для исследований пролиферации клеток, подсчитайте клетки HEI-OC1 с помощью клеточного счетчика. Плита 10 000 клеток HEI-OC1 на колодец на пластине 96 колодец в 200 микролитров объема каждый.Инкубировать клетки в течение ночи при 33 градусах по Цельсию с 5%CO2. Чтобы вызвать трансгенное выражение, добавьте один микрограмм на миллилитр доксициклина в подмножество трансфицированных клеток HEI-OC1. Используйте другой подмножество помечены как минус-доксициклин и не-трансфицированных HEI-OC1 клеток в качестве элементов управления, и инкубировать клетки как 33 градусов по Цельсию с 10%CO2.Чтобы оценить пролиферацию клеток, через 48 часов после трансфекции удалите среду клеточной культуры и добавьте 100 микролитров раствора связывания красителя 1x из комплекта пролиферации клеток в каждую колодец микро-пластины. Следуйте протоколу производителя и инкубировать в течение одного часа при 37 градусах по Цельсию. Используйте считыватель микроплюсов флуоресценции для измерения интенсивности флуоресценции каждого образца.Для дальнейшей оценки пролиферации клеток с использованием иммуноцитохимии, пластины HEI-OC1 клетки на крышку стекла размещены в каждом хорошо 12-хорошо пластины в DMEM. Инкубировать клетки на ночь при 33 градусах по Цельсию. На следующий день, cotransfect к клеткам в 2 скважинах с pTet-Splice и векторами pCMV-Tet3G, и после этого выполняет обработку доксициклина на одном наилучшим образом и сделано с клетками NIH3T3.Используйте один неперераженый хорошо в качестве управления. Для обработки клеток для маркировки Ki-67, исправить их с 4%paraformaldehyde в PBS в течение 10 минут при комнатной температуре. После этого, мыть их три раза с ледяной PBS в течение пяти минут каждый.Добавить 0,25%неионные моющие средства в PBS, и инкубировать в течение 10 минут. Повторите мыть три раза в PBS в течение пяти минут каждый. Используйте 10%сыворотки, чтобы блокировать клетки.В увлажненной камере в течение одного часа при комнатной температуре. Добавьте 500 микролитров первичного антитела Ки-67 и инкубировать на ночь при четырех градусах Цельсия. Вымойте клетки снова три раза в PBS в течение пяти минут каждый.Добавьте один миллилитр вторичного антитела и инкубировать клетки в течение одного часа при комнатной температуре в темноте. После удаления вторичного раствора антитела, мыть клетки снова три раза в течение пяти минут в PBS в темноте. Чтобы обозначить клетки HEI-OC1 фаллоидином, инкубировать их в 1:200 фаллоидин в течение 30 минут при комнатной температуре.Чтобы обозначить ядра клеток, инкубировать клетки с пятью микрограммами на миллилитр DAPI в течение 10 минут при комнатной температуре. После доставки трансгенных мышей генотип щенков с помощью грунтовки специфичен для области синтеза CBRb1, как описано в рукописи. Порода взрослых TetO-DN-CB-myc6-Rb1 мышей ROSA-CAG-rtTA и тетрекилин индуктор линии для создания экспериментальных DN-CBRb мышей, и генотип их потомство, как описано в рукописи.NIH3T3 не выражает эндогенный белок RB1, поэтому надежное выражение RB1, увиденное здесь, связано с индукцией трансгена в присутствии Dox, но не в его отсутствии, подтверждая эффективную активацию конструкции TetO-DN-CB-myc6-Rb1. В отличие от этого, HEK293 клетки имеют эндогенное выражение RB1. Добавление доксициклина привело к активации TetO-DN-CB-myc6-Rb1 и регулирования RB1.Выражение RB1 было возобновлено через 21 час после удаления доксициклина из СМИ. Клетки HEI-OC1, котрансфицированные теми же переносчиками, показали скромное, но значительное увеличение числа клеток после лечения доксициклином по сравнению с трансфицированными клетками, не обработанными доксициклином, и нетрансфицированными клетками. Флуоресцентная гибридизация на месте подтвердила геномную вставку трансгена TetO-DN-CB-myc6-RB1 у мышей.Было первоначальное увеличение общего экспрессии белка RB1 в улитке трансгенных мышей, обработанных доксициклином в течение трех дней по сравнению с контрольной группой. Однако в группах, обработанных доксоциклиным в течение семи и 10 дней, наблюдалось значительное снижение экспрессии РБ1. Независимо от анализируемой ткани, значительное снижение белка RB1 наблюдалось у трансгенных мышей, обработанных доксоциклином, но не в контрольной группе, что подтверждает эффективность конструкции TetO-DN-CB-myc6-RB1.При попытке этой процедуры важно проверить, что каждый из элементов кодирования трансгена находится в кадре друг с другом. Если бы описанные в настоящем докладе области кодирования катепсина В и ретинобластомы были случайно соединены из кадра, это не дало бы предполагаемого белка синтеза. Таким образом, проверка последовательности ДНК должна быть сделана перед введением трансгена в одноклеточные эмбрионы мыши.Следуя этой процедуре, вездесущий промоутер CAG может быть заменен конкретными промоутерами для того, чтобы изучать функцию гена в специфической манере клетки.

Research

JoVE Journal

Genetics

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Индуцируемая T7-РНК-полимераза-опосредованная мультигенная экспрессия, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Поколение флуоресцентных слитых белков в<em&gt; Кандида</em&gt; Виды

Candida species, prevalent colonizers of the intestinal and genitourinary tracts, are the cause of the majority of invasive fungal infections in humans. ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Управляемая Expression ионного канала через Индуцибельные временная трансфекция

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Микроинъекции ТРИФОСФАТЫ/Cas9 белка в канал сома, сомик punctatus, эмбрионы для редактирования гена

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Учредительные и индуцибельной систем для генетических в естественных условиях изменения мыши гепатоцитов, используя инъекции Вену гидродинамических хвост

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Определение события гомологичная рекомбинация в мышиных эмбриональных стволовых клеток с использованием южный Blotting и цепной реакции полимеразы

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Индуцибельной, выражение определенного типа клеток в Arabidopsis thaliana через LhGR-опосредованной транс-активация

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Масса на основе спектрометрии протеомики анализа с использованием базы данных OpenProt откроет новые белки перевод с неканоническим открытом чтения фреймов

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

Анализ для количественной протеино-РНК Связывания в бактериях

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

В vitro биохимические анализы с использованием биотина этикетки для изучения белково-нуклеиновой кислоты взаимодействия

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...