Name: inducible and reversible dominant-negative (dn) protein inhibition
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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La pCS2 + CB-Myc6 vector fue un regalo de Marshall Horwitz (Universidad de Washington, Seattle, WA, USA). Las células de HEI-OC1 fueron amablemente proporcionadas por Fedrico Kalinec (escuela de medicina David Geffen, UCLA, Los Angeles, CA, USA). Asistencia técnica fue proporcionada por la UNMC ratón genoma ingeniería base (C.B. Gurumurthy, Don Harms, Rolen Quadros) y la Creighton University biomédica imagen instalación integrada (Richard Hallworth, John Billheimer). La UNMC ratón genoma Ingeniería fue apoyada por una concesión de desarrollo institucional (IDea) de los NIH/NIGMS, concesión número GM103471 P20. La instalación de imagen biomédica integrada fue apoyada por la Universidad de Creighton de la medicina y becas GM103427 y GM110768 de NIH/NIGMS. La instalación fue construida con el apoyo de becas del centro nacional para recursos de investigación (RR016469) y el NIGMS (GM103427). Las líneas de ratón generadas en este estudio fueron mantenidas en instalaciones de recursos Animal de la Universidad de Creighton, cuya infraestructura fue mejorada a través de una subvención por NIH/NCRR G20RR024001. Este trabajo recibida más allá del apoyo a través de un NIH/NCRR 5P20RR018788 - NIH/NIGMS 8P20GM103471 COBRE conceder (a Shelley D. Smith), NIH/D.I.I.P R21OD019745-01A1 (s. S.) y una beca de investigación emergente de la Fundación de salud auditiva (para S. Tarang). El contenido de esta investigación es únicamente responsabilidad de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud.

Generación de todo cuidado de los animales en el ratón transgénico de CBRb y experimentos relacionados con el estudio fueron aprobados por el cuidado de Animal institucional de Universidad de Creighton y el Comité uso (IACUC) y realizadas por sus orientaciones.
1. transgénicos CB-Myc6-construcción de Rb1
Nota: La clonación de CBRb en un vector de pTet_Splice fue hecha en un proceso de múltiples paso (figura 1A</...

<ol>
	<li>Li, F. 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Para eludir las limitaciones asociadas con las estrategias tradicionales de transgénicas, se buscó generar un modelo de ratón en el que un POI endógena puede ser condicional inactivado por overexpressing una forma mutante de DN de él de manera espacio-temporal. Para suprimir la función de POIs endógenos, varias opciones han sido propuestos15,16,17. Hemos modificado una estrategia genética anterior1</sup...

Enfoques más con el objetivo de la ablación del gen y la proteína dependen de procesos permanentes, que generalmente conducen a la eliminación completa o el truncamiento de la gene, secuencias de ARN o proteínas de interés (POI). El objetivo general de este método es diseñar una proteína recombinante para suprimir la función de la proteína endógena, tipo salvaje. Hemos revisado y renovado una estrategia alternativa1,2, que permite la ablación temporal de un POI a través de la inhibición de la DN. Este método funciona para multiméricas y péptidos monoméricos pero es el más adecuado para las proteínas que funcionan en una Asamblea de multimérica.
El método consiste en fundir la proteasa lisosomal CB a una subunidad de un multimérica POI (complejo de fusión de la CB). La fusión resultante de CB complejo puede interactuar con proteolytically digerir la proteína endógena y desviar todo el complejo de POI CB al lisosoma para ser degradados3. Por otra parte, una combinación de la fusión de CB compleja con el carácter inducible del sistema de activación transcripcional controlado por tetraciclina (TetO) permite una expresión inducible y controlada del transgén en una manera reversible2. Aunque útil en muchas circunstancias, la supresión completa de genes o proteínas in vivo puede resultar en mortalidad4,5,6. Además, eliminación de tejidos específicos, condicional de algunos genes o proteínas mediante el sistema Cre/Lox puede no ser sencillo, ya que provocaría, en última instancia, a la pérdida permanente de elementos genómicos críticos7. Por lo tanto, dependiendo de la genética o POI, ninguno de estos enfoques será eficaz en proporcionar un modelo útil para estudios posteriores, particularmente genes o proteínas los estudios funcionales en ratones adultos y postnatales tardíos.
Para eludir los problemas asociados con estos enfoques y proporcionar prueba de principio sobre la efectividad del método propuesto, hemos optado por probar el método presentado aquí por generar una versión DN condicional de la proteína Retinoblastoma 1 (RB1). Varias opciones han sido propuestos8,9,10 para suprimir la función de RB1 endógeno; sin embargo, todos ellos frente a algunas de las mismas limitaciones mencionadas: eliminación permanente del germline de RB1 es catequizador letal y, coherente con su función de supresor de tumor, permanente borrado condicional RB1 conduce a una variedad de tumores11. Aunque una versión de DN de RB1 parece no ocurre naturalmente, una mejor alternativa a las estrategias actualmente disponibles debe permitir una inactivación temporal controlada de RB1 endógeno y proporcionar un mecanismo alternativo para finalmente restaurar su función. La base para dicha construcción fue descrita hace más de dos décadas1. Sin embargo, debido a limitaciones tecnológicas, carecía de un mecanismo de control transgen activación, la respuesta y la especificidad de tejido. Este estudio es el primero en combinar la elegancia de la doxiciclina (Dox)-sistema transcripcional dependiente con una construcción transgénica ingeniería de proteínas de CB y Rb1 proteasa lisosomal. El modelo de ratón de CBRb resultante permite una RB1 mediada por Dox temporalmente regulada regulación2. La ventaja de utilizar un enfoque basado en el proteoma para estudiar la función genética es que puede adoptarse para cualquier gen de interés, con la mínima información sobre su actividad.
La estrategia propuesta de transgen DN ofrece muchas ventajas sobre los enfoques tradicionales. En primer lugar, inhibición de la proteína DN conduce a solamente una ablación parcial en actividad de la proteína, preservando así una expresión endógena residual. Ese resultado es muy conveniente en situaciones donde una eliminación completa de la actividad de la proteína conduce a mortalidad embrionaria, limitando grandemente cualquier investigación para estudiar la función del gen en un ratón vivo. En segundo lugar, la presencia del sistema TetO permite activación de transgen sólo en presencia de un antibiótico, que permite un control eficaz y reversible de la actividad del transgen. Así, al dejar la administración de antibióticos, se puede desactivar el sistema de transgénico, y es una expresión normal de RB1 en lugar. En tercer lugar, la especificidad de la expresión del transgen puede variar según el promotor de la opción. Aunque hemos optado por el promotor de ROSA-CAG ubicuo para la prueba de principio, colocar el transgén en un promotor tejido específico es probable restringir la expresión del transgén no deseados y facilitar estudios sobre la aplicación terapéutica de este transgén metodología.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:768px;" width="769">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:255px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium, DMEM</td>
			<td style="width:228px;">GIBCO-BRL</td>
			<td style="width:119px;">11965-084</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Minimum Essential Medium Eagle, MEME&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">M8042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F2442&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Lipofectamine&#160;</td>
			<td style="width:228px;">DharmaFECT</td>
			<td style="width:119px;">T-2010-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Sal I</td>
			<td style="width:228px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11745622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">EcoRV-HF</td>
			<td style="width:228px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R3195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">NotI</td>
			<td style="width:228px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">13090730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CaspaTag&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">APT523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">DAPI</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Staurosporine</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CyQuant NF cell proliferation kit&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C35007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Retinoblastoma 1 antibody</td>
			<td style="width:228px;">Abcam</td>
			<td>Ab6075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">c-Myc antibody</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td>M5546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">b-actin</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td>A5316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ki-67&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">MA5-14520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Phallodin</td>
			<td style="width:228px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence microplate reader</td>
			<td style="width:228px;">FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Epifluorescence microscope&#160;</td>
			<td style="width:228px;">NikonEclipse80i</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:601px;">The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011.&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducible and reversible dominant-negative (dn) protein inhibition

Dominante negativa inhibición de la proteína (DN) es un método potente para manipular la función de la proteína y ofrece varias ventajas sobre otros enfoques basados en el genoma. Por ejemplo, aunque quimérica y Cre-LoxP estrategias objetivos han sido ampliamente utilizados, las limitaciones intrínsecas de estas estrategias (es decir, actividad de promotor agujereado, expresión del Cre de mosaico, etc.) han restringido significativamente su aplicación. Por otra parte, una canceladura completa de numerosos genes endógenos es catequizador letal, lo que hace imposible para el estudio de funciones de los genes en la vida postnatal. Para enfrentar estos desafíos, hemos hecho cambios significativos a un protocolo de ingeniería genética temprana y combina una versión corta (transgénica) del gen Rb1 con una proteasa lysosomal B procathepsin (CB), para generar un modelo de ratón de DN de Rb1 (CBRb). Debido a la presencia de una proteasa lisosomal, la proteína de la fusión completa de CB-RB1 y su complejo de interacción se dirigen para la degradación mediada por el proteasoma. Por otra parte, la presencia de un elemento inductor (rtTA) de tetraciclina en la construcción de transgénico permite una regulación inducible y reversible de la proteína de RB1. La presencia de un promotor de ROSA-CAG omnipresente en el modelo de ratón de CBRb es una herramienta útil para realizar ablación de gene Rb1 transitoria y reversible y proporcionar a los investigadores un recurso para comprender su actividad en prácticamente cualquier tipo de célula donde se expresa el RB1.

En general, diseñar una mutación DN requiere una cantidad considerable de información sobre la estructura y función de la PDI. En contraste, la estrategia de DN presentada aquí es particularmente útil cuando la información estructural y funcional para el POI es limitada. Si el POI es una proteína multimérica, una fusión de una subunidad a una proteasa lysosomal dominante puede inhibir multimer montado y, potencialmente, otros ligandos a través de una combinación de la proteól...

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Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition

Aquí presentamos un protocolo para desarrollar un sistema inducible negativo dominante, en el que cualquier proteína puede ser condicional inactivada por overexpressing reversiblemente una versión mutante dominante negativo de él.

Inhibición de la proteína inducible y Reversible dominante negativo (DN)

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en una amplia variedad de campos que requieren inactivación condicional y transitoria de un gen de interés al sobre-expresar de manera reversible una versión negativa dominante del índolo. La principal ventaja de esta técnica es que sólo permite una ablación parcial en la actividad proteica, preservando así una expresión endógena residual. Aunque, aquí describimos la condición de inactivación de la proteína RB, que funciona en un ensamblaje multimérico, esta metodología también se puede aplicar a proteínas monoméricas.Umesh Pyakurel, nuestro teciniciano de laboratorio y coautor en el manuscrito demostrará los procedimientos. Para empezar, el cultivo de células NIH3T3, siguiendo las especificaciones del proveedor, a 37 grados Celsius con 5%CO2, utilizando el medio de cultivo celular recomendado que contiene 10%suero bovino fetal. Para coducduccionar las células usando vectores pTet-Splice y pCMV-Tet3G, primero mezcle de dos a cuatro microlitros del reactivo de transfección a base de lípidos por pozo, y un mililitro de DMEM incompleto por pozo en un tubo de 15 mililitros, e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente.Añadir de dos a tres microgramos de ADN plasmático por pozo a la mezcla DMEM de este reactivo de transfección. Mezclar e incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente. Añadir un mililitro de la mezcla que contiene ADN y el reactivo de transfección en DMEM a cada pocero de placa de seis pocillos con células NIH3T3.Después de tres a cuatro horas de incubación a 37 grados Celsius con 5%CO2, añadir un mililitro de medio completo. A continuación, agregue 2 microlitros de caldo de doxiciclina a cada pozo y marque la placa como más doxiciclina. Incubar las células a 37 grados centígrados con 5%CO2.Para evaluar la funcionalidad de la construcción TetO-DN-CB-myc6-Rb1 en la promoción de la proliferación celular no programada, cultivo de células HEI-OC1 en DMEM que contiene 10%FBS, en condiciones permisivas. Para estudios de proliferación celular, cuente las células HEI-OC1 utilizando un contador de células. Placa 10.000 células HEI-OC1 por pozo en una placa de 96 pozos en 200 microlitros de volumen cada una.Incubar las células durante la noche a 33 grados centígrados con 5%CO2. Para inducir la expresión de transgén, agregue un microgramos por mililitro de doxiciclina a un subconjunto de células HEI-OC1 transfectosas. Utilice el otro subconjunto etiquetado como menos-doxiciclina y las células HEI-OC1 no transfectadas como controles, e incubar las células como 33 grados Celsius con 10%CO2.Para evaluar la proliferación celular, 48 horas después de la transfección, retire el medio de cultivo celular y agregue 100 microlitros de solución de unión de tinte 1x de un kit de proliferación celular a cada pocólite de la microplaca. Siga el protocolo del fabricante e incubar durante una hora a 37 grados centígrados. Utilice un lector de microplacas de fluorescencia para medir la intensidad de fluorescencia de cada muestra.Para evaluar aún más la proliferación celular mediante inmunocitoquímica, placa las células HEI-OC1 en un vidrio de cubierta colocado en cada pozo de una placa de 12 pozos en DMEM. Incubar las células durante la noche a 33 grados centígrados. Al día siguiente, cotransfecta a las células en dos pozos con el pTet-Splice y los vectores pCMV-Tet3G, y luego realizar el tratamiento de doxiciclina en uno bien como se hace con las células NIH3T3.Utilice uno no infectado, así como un control. Para procesar las celdas para el etiquetado Ki-67, fijelas con 4%paraformaldehído en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de eso, lávelos tres veces con PBS helado durante cinco minutos cada uno.Añadir 0.25% detergente no iónico en PBS, e incubar durante 10 minutos. Repita el lavado tres veces en PBS durante cinco minutos cada uno. Usa 10% de suero para bloquear las células.En una cámara humidificada durante una hora a temperatura ambiente. Añadir 500 microlitros de anticuerpos primarios Ki-67 e incubar durante la noche a cuatro grados centígrados. Lave las células de nuevo tres veces en PBS durante cinco minutos cada una.Añadir un mililitro del anticuerpo secundario e incubar las células durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de extraer la solución secundaria de anticuerpos, lave las células de nuevo tres veces durante cinco minutos en PBS en la oscuridad. Para etiquetar las células HEI-OC1 con falhalloidina, incubarlas en 1:200 faloidein durante 30 minutos a temperatura ambiente.Para etiquetar los núcleos celulares, incubar las células con cinco microgramos por mililitro de DAPI Durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de la entrega de los ratones transgene, genotipo los cachorros utilizando un conjunto de imprimación específico para la región de fusión CBRb1 como se describe en el manuscrito. Criar ratones adultos TetO-DN-CB-myc6-Rb1 a la línea de inductores ROSA-CAG-rtTA y tetrecycline para generar ratones DN-CBRb experimentales, y genotipo su descendencia como se describe en el manuscrito.NIH3T3 no expresa la proteína RSB1 endógena, por lo que la robusta expresión RB1 que se ve aquí se debe a la inducción transgén en presencia de Dox, pero no en su ausencia, confirmando la activación eficiente de la construcción RB1 de mezcla TetO-DN-CB-myc6-Rb1. Por el contrario, las células HEK293 tienen expresión de RB1 endógena. La adición de doxiciclina llevó a TetO-DN-CB-myc6-Rb1 activación y RB1 down-regulation.La expresión RB1 se reanudó 21 horas después de que se retirara la doxiciclina de los medios. Las células HEI-OC1 cotransfectadas con los mismos vectores, mostraron un aumento modesto pero significativo en el número de células siguen el tratamiento de doxiciclina en comparación con las células transfectadas no tratadas con doxiciclina, y las células no transfectadas. La hibridación fluorescente in situ confirmó la inserción genómica del transgén TetO-DN-CB-myc6-RB1 en ratones.Hubo un aumento inicial en la expresión total de proteína RB1 en cóclea de los ratones transgénicos tratados con doxiciclina durante tres días en comparación con el grupo de control. Sin embargo, en grupos tratados con doxociclina durante siete y 10 días, se observó una reducción significativa en la expresión de RB1. Independientemente del tejido analizado, se observó una reducción significativa de la proteína RB1 en ratones transgénicos tratados con doxociclina, pero no en el grupo de control, lo que confirma la eficiencia de la construcción TetO-DN-CB-myc6-RB1.Al intentar este procedimiento, es importante comprobar que cada uno de los elementos de codificación del transgén están en fotograma entre sí. Si las regiones codificantes de Cathepsin B y el retinoblastoma descritos en este informe estuvieran, por casualidad, conectadas fuera de marco, no produciría la proteína de fusión prevista. Por lo tanto, la verificación de la secuencia de ADN debe realizarse antes de inyectar el transgén en embriones de ratón de una sola célula.Después de este procedimiento, el ubicuo promotor CAG puede ser reemplazado por promotores específicos con el fin de estudiar la función génica de la manera específica de una célula.

Research

JoVE Journal

Genetics

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Inducible T7 RNA polimerasa mediada Multigene Expression System, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Investigación

Genética

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Generación de fusiones de proteínas fluorescentes en<em&gt; Candida</em&gt; Especies

Candida species, prevalent colonizers of the intestinal and genitourinary tracts, are the cause of the majority of invasive fungal infections in humans. ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Expresión Ion Channel controlable a través de la transfección transitoria inducible

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinyección de la proteína CRISPR/Cas9 en bagre de canal, Ictalurus punctatus, embriones de Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Sistemas inducibles y constitutivos para la modificación genética In Vivo de hepatocitos de ratón mediante la inyección en la vena hidrodinámica cola

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identificación de eventos de recombinación homóloga en células madre embrionarias del ratón mediante Southern blot y reacción en cadena de polimerasa

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducibles, expresión de específicas del tipo celular en Arabidopsis thaliana mediada a través de LhGR Trans-activación

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Análisis de proteómica basada en espectrometría de masa usando la base de datos OpenProt para develar nuevas proteínas traducción de marcos de lectura abierto no-canónico

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

Un ensayo para cuantificar la unión de proteínas y ARN en bacterias

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

Ensayos bioquímicos in Vitro utilizando etiquetas de biotina para estudiar las interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...