Name: inducible and reversible dominant-negative (dn) protein inhibition
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition at JoVE.com

Den pCS2 + CB-Myc6 vector var en gåva från Marshall Horwitz (University of Washington, Seattle, WA, USA). HEI-OC1 cellerna var vänligen tillhandahållen av Fedrico Kalinec (David Geffen School of Medicine, UCLA, Los Angeles, CA, USA). Tekniskt stöd tillhandahölls av UNMC mus genomet Engineering kärnan (C.B. Carstens, Don Harms, Rolen Quadros) och Creighton University integrerad biomedicinsk Imaging anläggningen (Richard Hallworth, John Billheimer). I UNMC mus genomet Engineering stöddes av en institutionell utveckling Award (IDea) från NIH/NIGMS, bevilja nummer P20 GM103471. Integrerad biomedicinsk Imaging anläggningen stöddes av den Creighton University School of Medicine och bidrag GM103427 och GM110768 från den NIH/NIGMS. Anläggningen byggdes med stöd från bidrag från nationellt centrum för forskningsresurser (RR016469) och NIGMS (GM103427). Mus raderna genereras i denna studie kvarstod vid Creighton University's Animal resurs anläggning, vars infrastruktur förbättrades genom ett bidrag av NIH/NCRR G20RR024001. Detta arbete fick förbi stöd genom en NIH/NCRR 5P20RR018788 - NIH/NIGMS 8P20GM103471 COBRE bevilja (Shelley D. Smith), NIH/ORIP R21OD019745-01A1 (S.M.R.-S.) och en framväxande forskningsanslag från stiftelsen förhandlingen hälsa (till S. Tarang). Innehållet i denna forskning är enbart ansvar av författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av National Institutes of Health.

Generation av transgena CBRb musen och alla djurvård och experiment som är associerad med studien godkändes av Creighton University institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) och utförs av deras riktlinjer.
1. transgena CB-Myc6-Rb1 konstruera
Obs: Kloning av CBRb i en pTet_Splice vektor skedde i en process i flera steg (figur 1A och 1B).
<ol><li>
Utföra förs...

<ol>
	<li>Li, F. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+MyoD+homodimer+formation+demonstrated+by+a+general+method+of+dominant+negative+mutation+employing+fusion+with+a+lysosomal+protease.">Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease.</a> Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).</li><li>Tarang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+retinoblastoma+(rb)1-inducible+dominant-negative+(DN)+mouse+model.">Generation of a retinoblastoma (rb)1-inducible dominant-negative (DN) mouse model.</a> Frontiers Cellular Neuroscience. 9 (52), (2015).</li><li>Kominami, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+selective+role+of+cathepsins+B+and+D+in+the+lysosomal+degradation+of+endogenous+and+exogenous+proteins.">The selective role of cathepsins B and D in the lysosomal degradation of endogenous and exogenous proteins.</a> FEBS Letters. 287 (1-2), 189-192 (1991).</li><li>Cortellino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+ciliogenesis,+embryonic+lethality+and+severe+impairment+of+the+sonic+hedgehog+pathway+caused+by+inactivation+of+the+mouse+complex+A+intraflagellar+transport+gene+Ift122/Wdr10,+partially+overlapping+with+the+DNA+repair+gene+Med1/Mbd4.">Defective ciliogenesis, embryonic lethality and severe impairment of the sonic hedgehog pathway caused by inactivation of the mouse complex A intraflagellar transport gene Ift122/Wdr10, partially overlapping with the DNA repair gene Med1/Mbd4.</a> Developmental Biology. 325 (1), 225-237 (2009).</li><li>Ferreira, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+embryonic+lethality+of+H+ferritin+gene+deletion+in+mice.">Early embryonic lethality of H ferritin gene deletion in mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3021-3024 (2000).</li><li>Lee, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+deficient+for+rb+are+nonviable+and+show+defects+in+neurogenesis+and+haematopoiesis.">Mice deficient for rb are nonviable and show defects in neurogenesis and haematopoiesis.</a> Nature. 359 (6393), 288-294 (1992).</li><li>Turlo, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+cre-mediated+recombination+in+mice+does+not+result+in+protein+loss.">When cre-mediated recombination in mice does not result in protein loss.</a> Genetics. 186 (3), 959-967 (2010).</li><li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+cell-cycle+reentry+and+cell+death+after+acute+inactivation+of+the+retinoblastoma+gene+product+in+postnatal+cochlear+hair+cells.">Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+knockout+mouse+model+of+retinoblastoma.">The first knockout mouse model of retinoblastoma.</a> Cell Cycle. 3 (7), 952-959 (2004).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletions+of+retinoblastoma+1+(Rb1)+and+its+repressing+target+S+phase+kinase-associated+protein+2+(Skp2)+are+synthetic+lethal+in+mouse+embryogenesis.">Deletions of retinoblastoma 1 (Rb1) and its repressing target S phase kinase-associated protein 2 (Skp2) are synthetic lethal in mouse embryogenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10201-10209 (2016).</li><li>Yamasaki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+E2F-1+reduces+tumorigenesis+and+extends+the+lifespan+of+Rb1(+/-)+mice.">Loss of E2F-1 reduces tumorigenesis and extends the lifespan of Rb1(+/-) mice.</a> Nature Genetics. 18 (4), 360-364 (1998).</li><li>Li, F. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+a+dominant+negative+retinoblastoma+protein+(RB)+inhibiting+satellite+myoblast+differentiation+implies+an+indirect+interaction+between+MyoD+and+RB.">Selection of a dominant negative retinoblastoma protein (RB) inhibiting satellite myoblast differentiation implies an indirect interaction between MyoD and RB.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5129-5139 (2000).</li><li>Pitkanen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+human+retinoblastoma+gene+product+in+mouse+fibroblasts:+Effects+on+cell+proliferation+and+susceptibility+to+transformation.">Expression of the human retinoblastoma gene product in mouse fibroblasts: Effects on cell proliferation and susceptibility to transformation.</a> Experimental Cell Research. 207 (1), 99-106 (1993).</li><li>Chano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+abundance+of+RB1CC1+contributes+to+the+non-proliferating+enlarged+cell+phenotype+through+both+RB1+maintenance+and+TSC1+degradation.">Neuromuscular abundance of RB1CC1 contributes to the non-proliferating enlarged cell phenotype through both RB1 maintenance and TSC1 degradation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 18 (3), 425-432 (2006).</li><li>Kole, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+therapeutics:+Beyond+RNA+interference+and+antisense+oligonucleotides.">RNA therapeutics: Beyond RNA interference and antisense oligonucleotides.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 11 (2), 125-140 (2012).</li><li>Yamamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ons+and+offs+of+inducible+transgenic+technology:+A+review.">The ons and offs of inducible transgenic technology: A review.</a> Neurobiology of Disease. 8 (6), 923-932 (2001).</li><li>Houdebine, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+animal+models+in+biomedical+research.">Transgenic animal models in biomedical research.</a> Methods in Molecular Biology. 360, 163-202 (2007).</li><li>Brehm, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoblastoma+protein+recruits+histone+deacetylase+to+repress+transcription.">Retinoblastoma protein recruits histone deacetylase to repress transcription.</a> Nature. 391 (6667), 597-601 (1998).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E2F-HDAC+complexes+negatively+regulate+the+tumor+suppressor+gene+ARHI+in+breast+cancer.">E2F-HDAC complexes negatively regulate the tumor suppressor gene ARHI in breast cancer.</a> Oncogene. 25 (2), 230-239 (2006).</li><li>Magnaghi-Jaulin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoblastoma+protein+represses+transcription+by+recruiting+a+histone+deacetylase.">Retinoblastoma protein represses transcription by recruiting a histone deacetylase.</a> Nature. 391 (6667), 601-605 (1998).</li></ol>

För att kringgå de begränsningar som är associerade med traditionella transgena strategier, försökte vi generera en musmodell där en endogen POI villkorligt kan inaktiveras genom överuttryck en DN muterade formen av det på en spatiotemporal sätt. För att avskaffa funktionen av endogena intressepunkter, har flera alternativ varit föreslagna15,16,17. Vi har ändrat en tidigare genetiska strategi1</sup...

De flesta metoder syftar de genen och protein ablationerna förlita sig på permanenta processer, som i allmänhet leder till fullständig eliminering eller trunkering av genen, RNA sekvenser eller protein av intresse (POI). Det övergripande målet med denna metod är att konstruera ett rekombinant protein för att avskaffa funktionen av endogena, vildtyps-protein. Vi har revisited och fräschas en alternativ strategi1,2, som tillåter tillfälliga ablation av en INTRESSEPUNKT genom DN hämning. Denna metod fungerar för både multimeric och monomer peptider men passar bäst för proteiner som fungerar i en multimeric församling.
Metoden består av fusing de lysosomala proteasen CB till en del av en multimeric POI (CB fusion komplexa). Den resulterande CB fusionen komplexa kan interagera med och proteolytically smälta det kroppsegna proteinet eller avleda CB-POI hela komplexet till Lysosomen vara försämrade3. Dessutom möjliggör en kombination av CB fusion komplex med tetracyklin-kontrollerade transkriptionell (TetO) aktiveringssystemet inducerbara natur inducerbara och kontrollerad uttryck för transgenens i en reversibel mode2. Även om det är användbart i många fall, kan komplett borttagning av gener eller proteiner i vivo resultera i dödlighet4,5,6. Jämväl, vävnadsspecifika, villkorligt borttagande av vissa gener eller proteiner som använder Cre/Lox systemet kanske inte okomplicerad, eftersom det kommer i slutändan leda till permanent förlust av kritiska genomisk elements7. Därför beroende på genen eller POI, ingen av dessa metoder kommer att vara effektiva i att tillhandahålla en användbar modell för senare studier, särskilt gener eller proteiner funktionella studier i sen födsel och vuxna möss.
För att kringgå problemen i samband med sådana metoder och ge proof-of-principle på effektiviteten av den föreslagna metoden, har vi valt att testa metoden presenteras här genom att generera en villkorlig DN version av retinoblastom 1 (RB1) protein. Flera alternativ har varit föreslagna8,9,10 att avskaffa funktionen av endogena RB1; men alla av dem inför några av de samma begränsningar som diskuteras ovan: permanent könsceller radering av RB1 är embryonically dödliga, och konsekvent med sin tumör suppressor roll, permanent RB1 villkorlig borttagning leder till en mängd olika tumörer11. Även om en DN version av RB1 inte verkar förekomma naturligt, ett bättre alternativ till de för närvarande tillgängliga strategierna bör möjliggöra en temporally kontrollerade inaktivering av den endogena RB1 och ge en alternativ mekanism så småningom återställa dess funktion. Grunden för en sådan konstruktion beskrevs över två decennier sedan1. Men på grund av tekniska begränsningar saknade det en mekanism för att kontroll transgenens aktivering, svar och vävnadsspecificitet. Denna studie är först som kombinerar elegansen i doxycyklin (Dox)-beroende transkriptionell system med en konstruerade transgena konstruktion av lysosomala proteas CB och Rb1 proteiner. Den resulterande CBRb musmodellen möjliggör en tillfälligt reglerade Dox-medierad RB1 förordning2. Fördelen med att använda en sådan proteom-baserade strategi för att studera geners funktion är att det kan antas för någon gen av intresse, med minimal information om sin verksamhet.
Den föreslagna DN transgenens strategin erbjuder många fördelar jämfört med traditionella metoder. Först leder DN protein hämning till endast en partiell ablation i proteinaktiviteten, därmed bevara ett kvarvarande endogen uttryck. Ett sådant resultat är önskvärt i situationer där en fullständig eliminering av proteinaktiviteten leder till embryonal dödlighet, kraftigt begränsa någon undersökning för att studera geners funktion i en levande mus. Andra, förekomsten av TetO systemet möjliggör transgenens aktiveringen endast i närvaro av ett antibiotikum, som möjliggör en effektiv och reversibel kontroll av transgenens aktiviteten. Således, av uppehåll antibiotikumet administrering, transgena systemet kan inaktiveras, och en normal RB1-uttryck är tillbaka på plats. För det tredje, specificiteten av transgenens uttryck kan variera beroende på arrangören av val. Medan vi har valt den allestädes närvarande ROSA-CAG promotorn för proof-of-principle, kommer placera transgenens under en vävnad-specifika promotorn sannolikt att begränsa oönskade transgenens uttryck och underlätta studier om terapeutiska tillämpningen av denna transgenens metodik.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:768px;" width="769">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:255px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium, DMEM</td>
			<td style="width:228px;">GIBCO-BRL</td>
			<td style="width:119px;">11965-084</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Minimum Essential Medium Eagle, MEME&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">M8042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F2442&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Lipofectamine&#160;</td>
			<td style="width:228px;">DharmaFECT</td>
			<td style="width:119px;">T-2010-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Sal I</td>
			<td style="width:228px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11745622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">EcoRV-HF</td>
			<td style="width:228px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R3195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">NotI</td>
			<td style="width:228px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">13090730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CaspaTag&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">APT523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">DAPI</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Staurosporine</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CyQuant NF cell proliferation kit&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C35007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Retinoblastoma 1 antibody</td>
			<td style="width:228px;">Abcam</td>
			<td>Ab6075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">c-Myc antibody</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td>M5546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">b-actin</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td>A5316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ki-67&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">MA5-14520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Phallodin</td>
			<td style="width:228px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence microplate reader</td>
			<td style="width:228px;">FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Epifluorescence microscope&#160;</td>
			<td style="width:228px;">NikonEclipse80i</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:601px;">The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011.&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducible and reversible dominant-negative (dn) protein inhibition

Dominant-negativ (DN) protein hämning är en kraftfull metod att manipulera proteinfunktion och erbjuder flera fördelar jämfört med andra tillvägagångssätt genomet. Till exempel även om chimär och Cre-LoxP inriktning strategier har använts i stor utsträckning, de inneboende begränsningarna av dessa strategier (dvs, läckande arrangören aktivitet, mosaik Cre uttryck, etc.) har avsevärt begränsat deras ansökan. Ett fullständigt borttagande av många endogena gener är dessutom embryonically dödliga, vilket gör det omöjligt att studera geners funktion i postnatal liv. För att möta dessa utmaningar, vi har gjort betydande ändringar i en tidig genteknik-protokoll och en kort (transgena) version av genen Rb1 i kombination med ett lysosomalt proteas procathepsin B (CB), att generera en DN musmodell av Rb1 (CBRb). På grund av närvaron av ett lysosomalt proteas dirigeras hela CB-RB1 fusion proteinet och dess samverkande komplex för proteasom-medierad nedbrytning. Dessutom kan förekomsten av en tetracyklin inducerare (rtTA) element i den transgena bygga en inducerbara och reversibel förordning av proteinet RB1. Förekomsten av en allestädes närvarande ROSA-CAG-arrangören i CBRb musmodell gör det ett användbart verktyg att utföra övergående och reversibla Rb1 gen ablation och ge forskarna en resurs för att förstå dess aktivitet i praktiskt taget alla celltyp där RB1 uttrycks.

Allmänhet, utforma en DN mutation kräver en ansenlig mängd information om struktur och funktion av POI. Däremot är DN strategin presenteras här särskilt användbart när den strukturella och funktionella informationen för POI är begränsad. Om POI är ett multimeric protein, en fusion av en delenhet till ett lysosomalt proteas dominant kan hämma den monterade multimer, och eventuellt andra ligander genom en kombination av proteolys av endogena subunitsna och subcellulär avledni...

Watch this Scientific Journal Video about Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition at JoVE.com

Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition

Här presenterar vi ett protokoll för att utveckla en dominant-negativ inducerbara system, där något protein villkorligt kan inaktiveras genom att reversibelt överuttryck av en dominant-negativ mutant version av den.

Inducerbara och reversibel Dominant-negativ (DN) Protein hämning

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom en mängd olika områden som kräver villkorlig och övergående inaktivering av en gen av intresse genom att reversibelt över-uttrycka en dominerande negativ version av den. Den största fördelen med denna teknik är att det tillåter endast en partiell ablation i proteinaktivitet, alltså, bevara en resterande endogena uttryck. Även om, här vi beskriver villkoret inaktivering av RB protein, som fungerar i en multimeric församling, kan denna metod också tillämpas på monomeric proteiner.Umesh Pyakurel, vår laboratorieteknik och en medförfattare i manuskriptet kommer att visa förfarandena. Till att börja med växa NIH3T3 celler, efter säljarens specifikationer, vid 37 grader Celsius med 5%CO2, med hjälp av den rekommenderade cellkultur mediet som innehåller 10%fetala nötkreatur serum. För att cotransfect cellerna med hjälp av pTet-Splice och pCMV-Tet3G vektorer, först blanda två till fyra mikroliter av lipid-baserade transfection reagens per brunn, och en milliliter ofullständig DMEM per brunn i en 15 milliliter röret, och inkubera i fem minuter vid rumstemperatur.Lägg till två till tre mikrogram plasma-DNA per brunn till denna transfektionsreagens's DMEM mix. Blanda och inkubera i 20 minuter i rumstemperatur. Tillsätt en milliliter av blandningen som innehåller DNA och transfektionsreagensen i DMEM till varje brunn av sex-brunnsplatta med NIH3T3-celler.Efter tre till fyra timmars inkubation vid 37 grader Celsius med 5%CO2, tillsätt en milliliter komplett medium. Tillsätt sedan 2 mikroliter av doxycyklin lager till varje brunn och markera plattan som plus-doxycyklin. Inkubera cellerna i 37 grader Celsius med 5%CO2.För att bedöma funktionaliteten hos TetO-DN-CB-myc6-Rb1 konstruera för att främja oplanerad cell spridning, kultur HEI-OC1 celler i DMEM som innehåller 10%FBS, under tillåtande villkor. För cellproliferationsstudier, räkna HEI-OC1-cellerna med hjälp av en cellräknare. Plate 10, 000 HEI-OC1 celler per brunn på en 96-brunnsplatta i 200 mikroliter volym vardera.Inkubera cellerna över natten vid 33 grader Celsius med 5%CO2. För att inducera transgenuttryck, lägg till ett mikrogram per milliliter doxycyklin till en delmängd av transfekterade HEI-OC1-celler. Använd den andra delmängden som är märkt som minus-doxycyklin och de icke-transfekterade HEI-OC1-cellerna som kontroller, och inkubera cellerna som 33 grader Celsius med 10%CO2.För att bedöma cellproliferation, 48 timmar efter transfektion, ta bort cellodlingsmediet och tillsätt 100 mikroliter av 1x färgämnesbindningslösning från en cellproliferationssats till varje brunn av mikroplattan. Följ tillverkarens protokoll och inkubera i en timme vid 37 grader Celsius. Använd en fluorescensmikroplattläsare för att mäta fluorescensintensiteten hos varje prov.För att ytterligare bedöma cell spridning med hjälp av immunocytochemistry, plåta HEI-OC1 cellerna på ett täckglas placeras i varje brunn av en 12-väl platta i DMEM. Inkubera cellerna över natten vid 33 grader Celsius. På följande dag, cotransfect till cellerna i två brunnar med pTet-Splice och pCMV-Tet3G vektorer, och sedan utföra doxycyklin behandling på en bra som gjort med NIH3T3 cellerna.Använd en icke-transfected well as en kontroll. För att bearbeta cellerna för Ki-67-märkning, fixa dem med 4%paraformaldehyd i PBS i 10 minuter vid rumstemperatur. Efter det tvätta dem tre gånger med iskall PBS i fem minuter vardera.Tillsätt 0,25%nonioniskt rengöringsmedel i PBS, och inkubera i 10 minuter. Upprepa tvätten tre gånger i PBS i fem minuter vardera. Använd 10%serum för att blockera cellerna.I en befuktad kammare i en timme i rumstemperatur. Tillsätt 500 mikroliter av Ki-67 primär antikropp och inkubera över natten vid fyra grader Celsius. Tvätta cellerna igen tre gånger i PBS i fem minuter vardera.Tillsätt en milliliter av den sekundära antikroppen och inkubera cellerna i en timme vid rumstemperatur i mörker. Efter att ha tagit bort den sekundära antikroppslösningen tvättar du cellerna igen tre gånger i fem minuter i PBS i mörker. För att märka HEI-OC1-cellerna med phalloidin, inkubera dem i 1:200 phalloidin i 30 minuter vid rumstemperatur.För att märka cellkärnorna, inkubera cellerna med fem mikrogram per milliliter DAPI I 10 minuter vid rumstemperatur. Efter leverans av transgenmössen, genotyp ungarna med hjälp av en primer uppsättning som är specifika för CBRb1 fusion regionen som beskrivs i manuskriptet. Rasen vuxna TetO-DN-CB-myc6-Rb1 möss till ROSA-CAG-rtTA och tetrecyklin inducerare linje för att generera experimentella DN-CBRb möss, och genotyp deras avkomma som beskrivs i manuskriptet.NIH3T3 uttrycker inte endogent RB1-protein, så det robusta RB1-uttrycket som ses här beror på transgeninduktion i närvaro av Dox, men inte i dess frånvaro, vilket bekräftar effektiv aktivering av TetO-DN-CB-myc6-Rb1 mix1-mix1-konstruktionen RB1. I motsats till detta har HEK293-celler endogent RB1-uttryck. Tillägget av doxycyklin ledde till TetO-DN-CB-myc6-Rb1 aktivering och RB1 down-förordning.RB1 uttryck återupptogs 21 timmar efter doxycyklin togs bort från media. HEI-OC1 celler cotransfected med samma vektorer, visas en blygsam men betydande ökning av cell nummer följa doxycyklin behandling jämfört med transfected celler som inte behandlats med doxycyklin, och de oöverständliga cellerna. Fluorescerande in situ-hybridisering bekräftade genomisk införing av TetO-DN-CB-myc6-RB1 transgen i möss.Det fanns en initial ökning av totala RB1 protein uttryck i cochlean av de transgena möss som behandlats med doxycyklin i tre dagar jämfört med kontrollgruppen. I grupper som behandlats med doxocyklin i sju och tio dagar observerades dock en signifikant minskning av RB1-uttryck. Oavsett vävnad analyseras, en betydande minskning av RB1 protein observerades i transgena möss behandlas med doxocyklin, men inte i kontrollgruppen, bekräftar effektivitet TetO-DN-CB-myc6-RB1 konstruera.När du försöker den här proceduren är det viktigt att kontrollera att var och en av de kodande elementen i transgenen är i ram med varandra. Om de kodningsregioner av Cathepsin B och retinoblastom som beskrivs i denna rapport var, av en slump, anslutna ur ramen, skulle det inte ge den avsedda fusionprotein. Således måste DNA-sekvensverifiering göras innan transgenen injiceras i encelliga musembryon.Efter detta förfarande kan den allestädes närvarande CAG promotorn ersättas med specifika promotorer för att studera genfunktion i en cell specifika sätt.

Research

JoVE Journal

Genetics

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Inducerbart T7-RNA-polymeras-medierat multigenexpressionssystem, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Generering av fluorescerande protein Fusioner i<em&gt; Candida</em&gt; Arter

Candida species, prevalent colonizers of the intestinal and genitourinary tracts, are the cause of the majority of invasive fungal infections in humans. ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Kontrollerbar jonkanalen uttryck genom inducerbara Transient transfektion

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Mikroskop av CRISPR/Cas9 Protein till kanal havskatt, Ictalurus punctatus, embryon för Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Konstituerande och inducerbara system för genetiska In Vivo modifiering av mus hepatocyter använder hydrodynamiska svans ven injektion

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identifiering av homolog rekombination händelser i mus embryonala stamceller med södra Blotting och Polymerase Chain Reaction

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducerade, Cell typspecifika uttryck i Arabidopsis thaliana genom LhGR-medierad Trans-aktivering

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Mass Spectrometry-baserad proteomik analyser med hjälp av databasen OpenProt att avslöja nya proteiner översatt från icke-kanoniska öppen läsning ramar

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

Ett test för att kvantifiera protein-RNA-bindning i bakterier

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

In vitro biokemiska analyser med biotin-märkning för att studera interaktioner mellan protein-nukleinsyror

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...