Name: inducible and reversible dominant-negative (dn) protein inhibition
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition at JoVE.com

PCS2 + CB-Myc6 vektör Marshall Horwitz (University of Washington, Seattle, WA, ABD) bir hediye oldu. Hee OC1 hücreleri nazikçe Fedrico Kalinec (David Geffen School of Medicine, UCLA, Los Angeles, Kaliforniya, ABD) tarafından temin edilmiştir. Teknik destek UNMC fare genom mühendislik çekirdek (C.B. Gurumurthy, Don Harms, rol Brezilya'lı) ve Creighton Üniversitesi entegre Biyomedikal görüntüleme tesis (Richard Hallworth, John Billheimer) tarafından sağlandı. UNMC fare genom mühendislik NIH/NIGMS, bir Kurumsal Geliştirme Ödülü (fikir) tarafından desteklenen sayı P20 GM103471 verin. Entegre Biyomedikal görüntüleme tesisin Creighton Üniversitesi Tıp ve hibe GM103427 ve GM110768 NIH/NIGMS dan tarafından desteklenmiştir. Tesisin Ulusal Merkezi gelen hibe desteği için araştırma kaynakları (RR016469) ile inşa edilmiştir ve NIGMS (GM103427). Bu çalışmada oluşturulan fare satırları Creighton Üniversitesi'nin hayvan kaynak tesis olan altyapı bir hibe NIH/NCRR G20RR024001 tarafından geliştirildi, muhafaza. Bu eser geçmiş COBRE vermek (Shelley D. Smith ile) bir NIH/NCRR 5P20RR018788-/ NIH/NIGMS 8P20GM103471, NIH/ORIP R21OD019745-01A1 (S.M.R.-S.) ve işitme Sağlık Vakfı (S. Tarang için) bir ortaya çıkan araştırma hibe yoluyla destek aldı. Bu araştırma içeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor.

Transgenik CBRb fare ve tüm hayvan bakımı ve çalışma ile ilgili deneyler nesil Creighton Üniversitesi Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve kendi kurallarına göre yapılır.
1. transgenik CB-Myc6-Rb1 yapı
Not: CBRb bir pTet_Splice vektör klonlama bir çok adımlı işlem (Şekil 1A ve 1B) yapıldı.
<ol><li>
İlk sahne klonlama p...

<ol>
	<li>Li, F. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+MyoD+homodimer+formation+demonstrated+by+a+general+method+of+dominant+negative+mutation+employing+fusion+with+a+lysosomal+protease.">Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease.</a> Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).</li><li>Tarang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+retinoblastoma+(rb)1-inducible+dominant-negative+(DN)+mouse+model.">Generation of a retinoblastoma (rb)1-inducible dominant-negative (DN) mouse model.</a> Frontiers Cellular Neuroscience. 9 (52), (2015).</li><li>Kominami, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+selective+role+of+cathepsins+B+and+D+in+the+lysosomal+degradation+of+endogenous+and+exogenous+proteins.">The selective role of cathepsins B and D in the lysosomal degradation of endogenous and exogenous proteins.</a> FEBS Letters. 287 (1-2), 189-192 (1991).</li><li>Cortellino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+ciliogenesis,+embryonic+lethality+and+severe+impairment+of+the+sonic+hedgehog+pathway+caused+by+inactivation+of+the+mouse+complex+A+intraflagellar+transport+gene+Ift122/Wdr10,+partially+overlapping+with+the+DNA+repair+gene+Med1/Mbd4.">Defective ciliogenesis, embryonic lethality and severe impairment of the sonic hedgehog pathway caused by inactivation of the mouse complex A intraflagellar transport gene Ift122/Wdr10, partially overlapping with the DNA repair gene Med1/Mbd4.</a> Developmental Biology. 325 (1), 225-237 (2009).</li><li>Ferreira, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+embryonic+lethality+of+H+ferritin+gene+deletion+in+mice.">Early embryonic lethality of H ferritin gene deletion in mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3021-3024 (2000).</li><li>Lee, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+deficient+for+rb+are+nonviable+and+show+defects+in+neurogenesis+and+haematopoiesis.">Mice deficient for rb are nonviable and show defects in neurogenesis and haematopoiesis.</a> Nature. 359 (6393), 288-294 (1992).</li><li>Turlo, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+cre-mediated+recombination+in+mice+does+not+result+in+protein+loss.">When cre-mediated recombination in mice does not result in protein loss.</a> Genetics. 186 (3), 959-967 (2010).</li><li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+cell-cycle+reentry+and+cell+death+after+acute+inactivation+of+the+retinoblastoma+gene+product+in+postnatal+cochlear+hair+cells.">Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+knockout+mouse+model+of+retinoblastoma.">The first knockout mouse model of retinoblastoma.</a> Cell Cycle. 3 (7), 952-959 (2004).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletions+of+retinoblastoma+1+(Rb1)+and+its+repressing+target+S+phase+kinase-associated+protein+2+(Skp2)+are+synthetic+lethal+in+mouse+embryogenesis.">Deletions of retinoblastoma 1 (Rb1) and its repressing target S phase kinase-associated protein 2 (Skp2) are synthetic lethal in mouse embryogenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10201-10209 (2016).</li><li>Yamasaki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+E2F-1+reduces+tumorigenesis+and+extends+the+lifespan+of+Rb1(+/-)+mice.">Loss of E2F-1 reduces tumorigenesis and extends the lifespan of Rb1(+/-) mice.</a> Nature Genetics. 18 (4), 360-364 (1998).</li><li>Li, F. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+a+dominant+negative+retinoblastoma+protein+(RB)+inhibiting+satellite+myoblast+differentiation+implies+an+indirect+interaction+between+MyoD+and+RB.">Selection of a dominant negative retinoblastoma protein (RB) inhibiting satellite myoblast differentiation implies an indirect interaction between MyoD and RB.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5129-5139 (2000).</li><li>Pitkanen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+human+retinoblastoma+gene+product+in+mouse+fibroblasts:+Effects+on+cell+proliferation+and+susceptibility+to+transformation.">Expression of the human retinoblastoma gene product in mouse fibroblasts: Effects on cell proliferation and susceptibility to transformation.</a> Experimental Cell Research. 207 (1), 99-106 (1993).</li><li>Chano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+abundance+of+RB1CC1+contributes+to+the+non-proliferating+enlarged+cell+phenotype+through+both+RB1+maintenance+and+TSC1+degradation.">Neuromuscular abundance of RB1CC1 contributes to the non-proliferating enlarged cell phenotype through both RB1 maintenance and TSC1 degradation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 18 (3), 425-432 (2006).</li><li>Kole, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+therapeutics:+Beyond+RNA+interference+and+antisense+oligonucleotides.">RNA therapeutics: Beyond RNA interference and antisense oligonucleotides.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 11 (2), 125-140 (2012).</li><li>Yamamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ons+and+offs+of+inducible+transgenic+technology:+A+review.">The ons and offs of inducible transgenic technology: A review.</a> Neurobiology of Disease. 8 (6), 923-932 (2001).</li><li>Houdebine, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+animal+models+in+biomedical+research.">Transgenic animal models in biomedical research.</a> Methods in Molecular Biology. 360, 163-202 (2007).</li><li>Brehm, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoblastoma+protein+recruits+histone+deacetylase+to+repress+transcription.">Retinoblastoma protein recruits histone deacetylase to repress transcription.</a> Nature. 391 (6667), 597-601 (1998).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E2F-HDAC+complexes+negatively+regulate+the+tumor+suppressor+gene+ARHI+in+breast+cancer.">E2F-HDAC complexes negatively regulate the tumor suppressor gene ARHI in breast cancer.</a> Oncogene. 25 (2), 230-239 (2006).</li><li>Magnaghi-Jaulin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoblastoma+protein+represses+transcription+by+recruiting+a+histone+deacetylase.">Retinoblastoma protein represses transcription by recruiting a histone deacetylase.</a> Nature. 391 (6667), 601-605 (1998).</li></ol>

Geleneksel transgenik stratejileri ile ilgili sınırlamaları aşmak için hangi endojen bir POI koşullu olarak bir DN mutant formu kronolojik zamanmekansal bir şekilde overexpressing tarafından inaktive bir fare modeli oluşturmak çalıştı. Endojen İÇN fonksiyonu ortadan kaldırmak için çeşitli seçenekler önerilen15,16,17olmuştur. Bir önceki genetik strateji1 Dox bağımlı transkripsiyon...

Genellikle tam ortadan kaldırılması veya kesme gen, RNA dizileri veya protein (POI) ilgi neden kalıcı süreçleri, çoğu yaklaşımlar gen ve protein ablations amaçlayan güveniyor. Bu yöntem genel amacı endojen, vahşi tipi proteinin işlev kaldırılması için Rekombinant protein mühendisi etmektir. Biz revisited ve geçici ablasyon poi DN inhibisyonu yoluyla izin veren bir alternatif strateji1,2, revamped. Bu yöntem inşaat için her ikisi multimeric ve monomeric peptidler ama multimeric derlemesinde işlev proteinler için uygundur.
Yöntem bir multimeric POI (CB füzyon karmaşık) bir alt birim için lizozomal proteaz CB eritme oluşur. Sonuç CB füzyon karmaşık ile etkileşim ve proteolytically endojen protein sindirimi veya bozulmuş3olmak lysosome için tüm CB-POI karmaşık aktarma. Ayrıca, CB füzyon karmaşık bir birleşim tetrasiklin kontrollü transkripsiyon harekete geçirmek (TetO) sistem indüklenebilir doğası ile geri dönüşümlü moda2transgene indüklenebilir ve kontrollü bir ifade sağlar. Birçok durumda yararlı olsa da genleri veya proteinler içinde vivo tam silinmesine ölümcül4,5,6' neden olabilir. Bu sonuçta, kritik genomik elements7kalıcı kaybına yol açacaktır aynı şekilde, bazı genlerin veya Cre/Lox sistemini kullanarak proteinler doku özgü, koşullu silinmesine basit, olmayabilir. Bu nedenle, gen veya POI bağlı olarak, bu yaklaşımlardan hiçbiri sonraki çalışmaları için uzun bir faydalı model sağlanmasında etkili olacaktır özellikle genler veya protein fonksiyonel çalışmalarda geç Doğum sonrası ve yetişkin mice.
Bu tür yaklaşımlar ile ilgili sorunları aşmak ve sağlamak için ilke kanıt önerilen yöntemin etkinliği üzerine burada koşullu bir DN sürüm Retinoblastom 1 (RB1) protein üreten tarafından sunulan yöntemini sınamanızı sağlamak seçtik. Çeşitli seçenekler endojen RB1 fonksiyonu ortadan kaldırmak için önerilen8,9,10 olmuştur; Ancak, tüm bunların bazı yukarıda açıklanan aynı sınırlamaları karşı karşıya: RB1 silinmesiyle kalıcı germline embryonically öldürücü ve tümör baskılayıcı rolü, kalıcı ile tutarlı RB1 koşullu silme tümörler11çeşitli için yol açar. RB1 bir DN sürümü doğal olarak görünmüyor olsa da, şu anda mevcut stratejileri daha iyi bir alternatiftir endojen RB1 bir geçici kontrollü inactivation için izin ve sonunda geri yüklemek için alternatif bir mekanizmaya onun işlev. Böyle bir yapı için temel üzerinde yirmi yıl önce açıklanan1. Ancak, teknolojik sınırlamalar nedeniyle, denetim transgene harekete geçirmek, yanıt ve doku özgüllük bir mekanizma yoktu. Bu zarafeti doksisiklin (Dox) ile birleştirmek için ilk çalışmadır-bağımlı transkripsiyon sistemi lizozomal proteaz CB ve Rb1 proteinlerin bir mühendislik transgenik inşa ile. Elde edilen CBRb fare modeli için bir geçici olarak düzenlenmiş Dox aracılı RB1 sağlar düzenleme2. Gen işlevini incelemek için böyle bir Proteom tabanlı yaklaşım kullanmanın avantajı bu faaliyet hakkında çok az bilgi ile ilgi herhangi bir gen için kabul edilebilir olduğunu.
Önerilen DN transgene strateji geleneksel yaklaşımlar birçok avantaj sunar. İlk olarak, DN protein inhibisyon sadece kısmi bir ablasyon için böylece bir kalıntı endojen ifade koruyarak protein etkinliği olarak, yol açar. Böyle bir sonuç nereye embriyonik ölümcül, büyük ölçüde sınırlayan bir canlı fare işlevinde gen çalışmaya herhangi bir soruşturma için protein etkinlik tam bir kaldırılması çıktığını durumlarda son derece arzu edilir. İkinci olarak, sadece bir transgene faaliyet verimli ve tersinir denetimi için izin veren bir antibiyotik, huzurunda transgene harekete geçirmek TetO sistemi sağlar. Bu nedenle, antibiyotik yönetim çıkıyordu tarafından transgenik sistem devre dışı bırakılabilir ve normal RB1 ifade geri yerdir. Üçüncü olarak, transgene ifade özgüllük seçim düzenleyici bağlı olarak değişebilir. Her yerde ROSA-CAG organizatörü ilkesi kanıt için seçtik, bir doku özgü organizatörü altında transgene yerleştirerek istenmeyen transgene ifade kısıtlamak ve bu transgene tedavi uygulanması çalışmaları kolaylaştırmak muhtemeldir metodoloji.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:768px;" width="769">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:255px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium, DMEM</td>
			<td style="width:228px;">GIBCO-BRL</td>
			<td style="width:119px;">11965-084</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Minimum Essential Medium Eagle, MEME&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">M8042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F2442&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Lipofectamine&#160;</td>
			<td style="width:228px;">DharmaFECT</td>
			<td style="width:119px;">T-2010-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Sal I</td>
			<td style="width:228px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11745622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">EcoRV-HF</td>
			<td style="width:228px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R3195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">NotI</td>
			<td style="width:228px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">13090730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CaspaTag&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">APT523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">DAPI</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Staurosporine</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S4400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">CyQuant NF cell proliferation kit&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C35007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Retinoblastoma 1 antibody</td>
			<td style="width:228px;">Abcam</td>
			<td>Ab6075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">c-Myc antibody</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td>M5546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">b-actin</td>
			<td style="width:228px;">Sigma&#160;</td>
			<td>A5316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ki-67&#160;</td>
			<td style="width:228px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">MA5-14520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Phallodin</td>
			<td style="width:228px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence microplate reader</td>
			<td style="width:228px;">FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Epifluorescence microscope&#160;</td>
			<td style="width:228px;">NikonEclipse80i</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:601px;">The TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) mouse line is available from the Jackson Laboratory as JAX#032011.&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducible and reversible dominant-negative (dn) protein inhibition

Baskın-negatif (DN) protein inhibisyonu protein işlevi işlemek için güçlü bir yöntemdir ve diğer genom tabanlı yaklaşımlar birkaç avantaj sunar. Örneğin, her ne kadar chimeric ve hedefleme stratejileri yaygın olarak kullanıldığını Cre-LoxP , bu stratejileri (Sızıntılı organizatörü etkinlik, mozaik Cre ifade, vb) iç sınırlamaları önemli ölçüde sınırlı onların uygulama. Ayrıca, birçok endojen genlerin tam silme postnatal hayatta gen işlevini incelemek imkansız hale embryonically, ölümcüldür. Bu sorunları ele almak üzere, biz erken bir genetik mühendisliği protokolü için yapılan önemli değişiklikler ve kısa bir (transgenik) sürüm Rb1 gen lizozomal bir proteaz ile kombine procathepsin B (Rb1 bir DN fare modeli oluşturmak için CB), (CBRb). Lizozomal bir proteaz varlığı nedeniyle, tüm CB-RB1 füzyon protein ve onun etkileşen karmaşık proteasome-aracılı bozulması için yönlendirilir. Ayrıca, tetrasiklin uyarıcı (rtTA) elementini transgenik yapısında varlığını indüklenebilir ve tersinir yönetmelik RB1 protein sağlar. CBRb fare modelindeki her yerde ROSA-CAG Organizatör varlığı nerede RB1 ifade edilir geçici ve tersinir Rb1 gen ablasyon taşımak ve araştırmacılar faaliyete hemen hemen herhangi bir hücreye anlamak için bir kaynak sağlamak için yararlı bir araç yapar.

Genellikle, bir DN mutasyon tasarlama yapısı hakkında bilgi önemli miktarda ve işlev poi gerektirir. Buna ek olarak, yapısal ve fonksiyonel bilgi POI için sınırlı olduğunda burada sunulan DN strateji özellikle yararlıdır. POI bir multimeric protein ise, lizozomal bir proteaz için bir alt birim bir füzyonu baskın monte multimer ve büyük olasılıkla, diğer ligandlar proteolizis endojen alt birimleri ve hücre altı saptırma bir birleşimi yoluyla engellediğini multime...

Watch this Scientific Journal Video about Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition at JoVE.com

Inducible and Reversible Dominant-negative DN Protein Inhibition

Burada içinde protein var koşullu olarak ters bir baskın negatif mutant yorum overexpressing tarafından inaktive bir baskın negatif indüklenebilir sistemi geliştirmek için bir iletişim kuralı mevcut.

İndüklenebilir ve tersinir baskın-negatif (DN) Protein inhibisyon

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...

Bu yöntem, bir ilgi geninin koşullu ve geçici olarak inaktivasyonunu gerektiren çok çeşitli alanlardaki anahtar sorularının yanıtlanmasına yardımcı olarak, bunun baskın negatif bir sürümünü tersine çevirerek yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı protein aktivitesinde sadece kısmi ablasyon sağlar, böylece, bir kalıntı endojen ifade koruyarak. Burada multimerik bir montajda işlev gören RB proteininin inaktivasyonunu tanımlasak da, bu metodoloji monomerik proteinlere de uygulanabilir.Umesh Pyakurel, bizim laboratuvar teknikeri ve el yazması bir coauthor prosedürleri gösterecektir. Başlamak için,% 10 fetal sığır serumiçeren önerilen hücre kültürü ortamı kullanarak, 5% 5 CO2 ile 37 santigrat derece, satıcının özelliklerine göre NIH3T3 hücreleri büyümek. PTet-Splice ve pCMV-Tet3G vektörlerini kullanarak hücreleri cotransfect için, ilk iyi başına lipid bazlı transfeksiyon reagent iki ila dört mikrolitre karıştırın, ve bir mililitre eksik DMEM iyi başına 15 mililitrelik bir tüp, ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçka.Bu transfeksiyon reaktifinin DMEM karışımına her kuyuda 2-3 mikrogram plazma DNA'sı ekleyin. Oda sıcaklığında 20 dakika karıştırın ve kuluçkaya yatırın. NIH3T3 hücreleri ile altı iyi plaka her kuyuya DNA ve DMEM transfeksiyon reaktifiçeren karışımın bir mililitre ekleyin.%5 CO2 ile 37 santigrat derecede 3-4 saatlik kuluçkadan sonra, bir mililitre tam orta madde ekleyin. Sonra, her iyi doksisiklin stok 2 mikrolitre ekleyin ve artı-doksisiklin olarak plaka işaretleyin. Hücreleri %5 CO2 ile 37 derecede kuluçkaya yatırın.TetO-DN-CB-myc6-Rb1 yapısının işlevselliğini değerlendirmek için planlanmamış hücre çoğalmasını teşvik etmek için, DMEM'de %10 FBS içeren hei-OC1 hücrelerinin kültürü, izin verilen koşullar altında. Hücre çoğalması çalışmaları için, bir hücre sayacı kullanarak HEI-OC1 hücreleri saymak. Plaka 10, 000 HEI-OC1 hücreleri her biri hacmi 200 mikrolitre 96-iyi plaka üzerinde iyi başına.Hücreleri gece boyunca %5 CO2 ile 33 derecede kuluçkaya yatırın. Transgen ekspresyonunu indüklemek için, transfected HEI-OC1 hücrelerinin bir alt kümesine doksisiklin mililitre başına bir mikrogram ekleyin. Eksi-doksisiklin olarak etiketlenmiş diğer alt kümeyi ve transfected olmayan HEI-OC1 hücrelerini kontrol olarak kullanın ve hücreleri %10 CO2 ile 33 santigrat derece olarak kuluçkaya yatırın.Hücre çoğalmasını değerlendirmek için, transfeksiyondan 48 saat sonra, hücre kültürü ortamını çıkarın ve bir hücre çoğalma kitinden 100 mikrolitre boya bağlayıcı çözeltiyi mikro plakanın her kuyuya ekleyin. Üreticinin protokolünü uygulayın ve 37 santigrat derecede bir saat kuluçkaya yat. Her numunenin floresan yoğunluğunu ölçmek için floresan mikroplaka okuyucukullanın.İmmünositokimya kullanarak hücre çoğalmasını daha fazla değerlendirmek için, HeI-OC1 hücrelerini DMEM'deki 12 kuyuluk plakanın her kuyunun her kuyununa yerleştirilen bir kapak camı üzerine yerleştirin. Hücreleri bir gecede 33 derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, pTet-Splice ve pCMV-Tet3G vektörleri ile iki kuyuda hücrelere cotransfect, ve sonra bir de doksisiklin tedavisi gerçekleştirmek ve NIH3T3 hücreleri ile yapılır.Bir untransfected iyi bir kontrol kullanın. Ki-67 etiketleme için hücreleri işlemek için, oda sıcaklığında 10 dakika pbs% 4 paraformaldehit ile düzeltin. Bundan sonra, beş er dakika buz gibi PBS ile üç kez yıkayın.PBS'ye %0.25 noniyonik deterjan ekleyin ve 10 dakika kuluçkaya yatırın. PBS'de üç kez beşer dakika yıkayın. Hücreleri engellemek için %10 serum kullanın.Oda sıcaklığında bir saat nemlendirilmiş bir odada. Ki-67 birincil antikor 500 mikrolitre ekleyin ve dört santigrat derece gecede kuluçka. Hücreleri pbs'de üçer kez beşer dakika yıkayın.İkincil antikor bir mililitre ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında bir saat boyunca hücreleri kuluçkaya yatırın. Sekonder antikor solüsyonu çıkardıktan sonra, karanlıkta PBS beş dakika boyunca hücreleri tekrar üç kez yıkayın. HEI-OC1 hücrelerini phalloidin ile etiketlemek için, 1:200 phalloidin ile oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın.Hücre çekirdeklerini etiketlemek için, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca dapi mililitre başına beş mikrogram ile hücreleri kuluçkaya yatırın. Transjen farelerin tesliminden sonra, el yazmasında açıklandığı gibi CBRb1 füzyon bölgesine özgü bir astar seti kullanarak yavruları genotip. Rosa-CAG-rtTA ve tetresikin indükleyici hattına yetişkin TetO-DN-CB-myc6-Rb1 fareleri üretin ve makalede açıklandığı gibi yavrularını genotipleyin.NIH3T3 endojen RB1 proteinini ifade etmez, bu nedenle burada görülen sağlam RB1 ekspresyonu Dox varlığında transjen indüksiyonundan kaynaklanır, ancak yokluğunda, TetO-DN-CB-myc6-Rb1 karışımı RB1 yapısının etkin aktivasyonunu onaylar. Buna karşılık, HEK293 hücreleri endojen RB1 ifadesine sahiptir. Doksisiklin eklenmesi TetO-DN-CB-myc6-Rb1 aktivasyonu ve RB1 aşağı regülasyon yol açtı.Doksisiklin medyadan çıkarıldıktan 21 saat sonra RB1 ekspresyonuna devam edildi. Hei-OC1 hücreleri aynı vektörler ile cotransfected, hücre sayısında mütevazı ama önemli bir artış doksisiklin ile tedavi edilmeyen transfected hücrelere göre doksisiklin tedavisi takip gösterdi, ve transfekssiz hücreler. Floresan in situ hibridizasyon farelerde TetO-DN-CB-myc6-RB1 transgeninin genomik yerleştirisini doğruladı.Kontrol grubuna göre üç gün boyunca doksisiklin ile tedavi edilen transgenik farelerin kokleasında toplam RB1 protein ekspresyonunda ilk artış saptandı. Ancak yedi ve 10 gün boyunca doksorusin ile tedavi edilen gruplarda RB1 ekspresyonunda anlamlı bir azalma gözlendi. Analiz edilen dokune bakılmaksızın, doksosikline ile tedavi edilen transgenik farelerde RB1 proteininde önemli bir azalma gözlendi, ancak kontrol grubunda değil, TetO-DN-CB-myc6-RB1 yapısının verimliliğini doğruladı.Bu yordamı denerken, transgenin kodlama öğelerinin her birinin birbiriyle aynı çerçevede olduğunu doğrulamak önemlidir. Bu raporda tanımlanan Cathepsin B ve retinoblastomun kodlama bölgeleri tesadüfen çerçeveden bağlı olsaydı, istenilen füzyon proteinini vermezdi. Bu nedenle transgeni tek hücreli fare embriyolarına enjekte etmeden önce DNA dizisi doğrulaması yapılmalıdır.Bu prosedürü takiben, her yerde CAG organizatörü bir hücrenin özel bir şekilde gen fonksiyonu çalışma için belirli organizatörler ile değiştirilebilir.

Research

JoVE Journal

Genetics

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

İndüklenebilir T7 RNA Polimeraz aracılı Çok Boylu İfade Sistemi, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Floresan protein füzyonları üretilmesi<em&gt; Candida</em&gt; Türler

Candida species, prevalent colonizers of the intestinal and genitourinary tracts, are the cause of the majority of invasive fungal infections in humans. ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

İndüklenebilir geçici transfeksiyon yoluyla kontrol edilebilir iyon kanal İfade

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

CRISPR/Cas9 Protein gen düzenleme için mikroenjeksiyon kanal yayın balığı, Ictalurus yılan, embriyo içine

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Hidrodinamik kuyruk ven enjeksiyon kullanarak fare tetkikine genetik Vivo içinde değişiklik kurucu ve indüklenebilir sistemleri

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Fare embriyonik kök hücre kullanarak Southern blot ve polimeraz zincir reaksiyonu Homolog rekombinasyon olaylar tanımlaması

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

İndüklenebilir, hücre türüne özgü ifade Arabidopsis thaliana aracılığıyla LhGR-aracılı Trans-harekete geçirmek

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Kütle spektrometresi tabanlı proteomik analizleri roman proteinler açıklayacak OpenProt veritabanı kullanarak kanonik olmayan açık okuma çerçevesi tercüme

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

Bakterilerde protein RNA bağlayıcı ölçümü için bir tahlil

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

Protein-Nüklik asit etkileşimlerini Incelemek için biotin etiketlerini kullanarak In vitro biyokimyasal asder

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...