Name: a visual guide for studying behavioral defenses to pathogen attacks in leaf-cutting ants
Uploaded: 2018-10-12T15:00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Visual Guide for Studying Behavioral Defenses to Pathogen Attacks in Leaf-Cutting Ants at JoVE.com

我们要感谢线 Vej Ugelvig 和柯尔希伊关于清洁机制的天线清洗器和拍摄设置的有益讨论。迈克尔鲍尔森是由一个 Villum 康比德拉斯穆森青年研究员奖学金 (VKR10101) 和塔比瑟无辜的玛丽居里夫人个人欧洲奖学金 (IEF 赠款 627949) 支持。我们还要感谢史密森热带研究所在巴拿马使用设施和后勤支助, 以及 Autoridad 全国安比恩特批准向丹麦收集和出口蚂蚁。

1. Escovopsis隔离
<ol><li>隔离Escovopsis菌株从Acromyrmex echinatior实验室殖民地, 通过放置真菌花园碎片, 与蚂蚁去除, 在一个培养皿与湿棉羊毛几天, 直到Escovopsis发芽和 sporulates。将孢子转移到马铃薯葡萄糖琼脂板 (PDA, 39 克/升) 和孵育在约两周. 23°c。 注意: 目前的研究中使用了一种菌株。</li>
	<li>使用无菌针头从这些第一个盘子中挑选出成熟的孢子。摘下足够的孢子来遮盖针头的尖端。</li>
	<li>在无菌条件下在新盘子上接种孢子, 在约两周内孵育约23摄氏度。</li>
	<li>当菌丝覆盖整个板块并长成成熟的褐色孢子, 重复步骤 1.3, 但这次与孢子从新的 PDA 板。</li>
	<li>重复此过程, 直到获得每株Escovopsis的清洁库存 (在板材表面或下方没有可见污染物)。</li>
</ol>2. 实验设置
<ol><li>使用三A. echinatior殖民地。 注意: 这里的殖民地 Ae160b, Ae322 和 Ae263 被使用。</li>
	<li>从每个殖民地, 使12个子殖民地。在0小时和六次菌落后, 进行六次菌落观测, 观察72小时后的观测结果。这总共提供了36个子殖民地;标记一半的子殖民地从每个 ' 父 ' 殖民地作为控制, 另一半为 "Escovopsis治疗"。 注意: 在父殖民地, 女王的存在会影响工人的行为, 我们期望 (尽管这不能保证), 在实验运行的短时间内, 无皇后的子殖民地很可能表现为 queenright 殖民地。</li>
	<li>对于每个子菌落, 使用长度为方形的方框: 约3.15 英寸 (8 厘米), 宽度: ~ 2.17 英寸 (5.5 厘米) 和深度 ~ 1.77 英寸 (4.5 厘米)。 注意: 重要的一点是为真菌碎片外的蚂蚁提供足够的空间来觅食和倾倒废弃物, 但同时使盒子足够小, 拍摄和行为识别是可行的。</li>
	<li>对于每个子菌落, 添加一个茶勺大小 (大约2.2 厘米3和 1.2 g) 的一部分的真菌花园 (gongylophorus) 的中心部分从原来的殖民地, 一对夫妇的荆棘树叶, 和一块棉羊毛浸泡在水中。 注: 棉羊毛提供湿度。它不应该滴水, 不应该接触真菌花园。</li>
	<li>对于用Escovopsis治疗的亚菌落, 使用接种循环并填充开口, 使其仅由Escovopsis孢子覆盖。通过轻轻敲击真菌花园的一个小的局部部分十到二十次, 使孢子不太聚集, 从而接种孢子。</li>
	<li>对于用作控制的子菌落, 模拟Escovopsis在真菌园中的应用, 并进行无菌接种循环。 注意: 虽然在本实验中没有这样做, 但在现阶段可以进行无菌粉末 (如石墨或滑石粉) 的接种, 以区分病原体和惰性剂的感染。</li>
	<li>对于72 小时观察, 在加入蚂蚁或开始录像之前, 在引入Escovopsis后, 将一半的子菌落 (控制和感染) 保留72小时。 注意: 在没有蚂蚁的情况下等待72小时可能会导致Escovopsis孢子发芽 (未发表的体外数据);虽然这也增加了其他感染的机会 (例如, 从真菌花园中已经存在的真菌), 这个时间段是最好的治疗, 以代表已建立的感染的早期阶段。</li>
	<li>对于0 小时的观察, 直接在步骤2.6 和记录前的30分钟后, 添加两个育雏, 四名小工人和四主要工人同时从父殖民地到每个箱子。<ol>
<li>使用两个主要工人从花园内是年轻的浅色颜料, 与放线菌覆盖大部分角质层。从花园外拿另外两个, 深色颜料和放线菌只覆盖 laterocervical 板。</li>
	</ol>
</li>
	<li>对于72 小时观察, 在记录前30分钟重复2.8 和 2.8.1,即71.5 小时, 接种后与Escovopsis。 注: 实验子菌落比已建立的天然Acromyrmex菌落要小得多。为了准确记录行为, 这是必要的。虽然这可能会影响一些行为的频率定性, 子殖民地的组成被选择以反映在自然殖民地的工人混合, 更有可能定性地反映行为的相互作用。</li>
</ol>3. 视频录制和评分行为
<ol><li>使用连接到笔记本电脑 (或等效) 的 USB 内窥镜, 并提供足够的光线。</li>
	<li>对于每个子群, 执行4小时的视频录制 (从0小时或 72 h 后感染)。</li>
	<li>在记录了36个子殖民地后, 回顾了144小时的素材, 并对每个子群中的所有个人感兴趣的行为进行评分。 注: 在目前的实验示例中, 由于Escovopsis以外的真菌感染, 我们必须排除两个子菌落 (从菌落 Ae160b 和处理子群 Ae322 的控制), 从而减少观察的总小时数。到136。</li>
	<li>每次观察到行为时, 将其记录为1发生。 注意:行为可以是短的或长的持续时间, 但只得分为 > 1 如果它被另一个行为中断, 或者如果蚂蚁是被动的一段时间。</li>
</ol>4. 行为
注意: 行为定义是使用以前的研究23、27、28、31、45和个人观察的组合描述进行的。有关识别行为的协议中使用的重要形态学结构的详细说明, 请参阅图 1。
<ol><li>自我梳理和天线清洗(视频 1)<ol>
<li>注意如果蚂蚁停止腿部运动开始自我梳理。检查天线是否通过前面腿上的清洁器 (图 1), 在胫骨-多孔关节上的一个钳状结构, 由一个凹槽面对一个具有不同大小的毛刷和梳45的杂波, 46。</li>
		<li>清洁天线后, 观察蚂蚁将清洁腿部和天线清洁剂, 通过口器拉腿, 去除颗粒和舌的潜在病原体 (图 1)。 注意: 自我梳理可以包括清洁天线和随后的天线清洁器 (图 1), 但也使用口器清洁腿部。当蚂蚁正在清洁它的腿时, 它通常会连续清洗所有的六条腿。</li>
	</ol></li>
	<li>真菌梳理 (视频 2)
	<ol>
<li>请注意, 如果蚂蚁停止在真菌花园的固定点的腿部运动。观察天线是静止的和平行指向真菌, 使景观和索之间的角度 (图 1) 大约 45°, 和天线的尖端几乎相互接触, 接近下颌骨的提示 (图 1)。</li>
		<li>请注意, 上部 (上颌骨) 和下部 (唇) 口器是开放的, 舌 (图 1) 正在出现来舔真菌。</li>
	</ol></li>
	<li>Allogrooming (视频 3)
	<ol>
<li>当一个或多个蚂蚁接近另一个 (接收者) 蚂蚁或反之亦然时, 观察这种行为。在行为过程中, 蚂蚁停止运动, 与身体接触紧密地站在一起。梳理蚂蚁可能略有移动, 以覆盖接收者蚂蚁身体的较大区域。</li>
		<li>观察演员的触角可以是静止的, 指向接收蚂蚁的特定点, 或移动和轻轻敲击接收器。景观和索之间的角度 (图 1) 大约 45°, 具体取决于它们是固定在特定点上还是轻敲。演员的触角的尖端通常是互相靠近和下颌骨的提示 (图 1)。</li>
		<li>请注意, 上部 (上颌骨) 和下部 (唇) 口器是打开的, 舌 (图 1) 正在出现, 以舔接收器蚂蚁。</li>
	</ol></li>
	<li>Metapleural 腺体梳理 (视频 4)<ol>
<li>观察蚂蚁何时停止运动以启动 metapleural 腺 (图 1) 梳理。请注意, 蚂蚁倾斜到一侧, 以达到它的前腿之一, 以擦开 (道) 的 metapleural 腺 (例如, 右前腿)。 注意: 另一条前腿同时 (在本例中为左前腿) 被舌舔 (图 1)。</li>
		<li>检查蚂蚁倾斜到相反的一侧, 并切换腿和重复相同的运动与相反的腿。蚂蚁继续将前腿移动到 metapleural 腺体, 随后舌在腿部之间不断切换 (图 1)。 注意: 在本例中, ant 现在将左前腿传递到 metapleural 腺体和右前腿到舌 (图 1)。在 metapleural 腺体 (图 1) 梳理后, 蚂蚁通常会启动自我梳理 (步骤 4.1)。</li>
	</ol></li>
	<li>孢子除草 (视频 5)
	<ol>
<li>当蚂蚁在真菌花园的固定点停止腿部运动时, 观察这种行为。观察天线是静止和平行的, 指向真菌, 使景观和索之间的角度近似 45°, 和天线的尖端几乎相互接触和下颌骨的提示 (图 1)。</li>
		<li>检查 ant 是否打开了下颌骨 (图 1) 以抓住可见的Escovopsis孢子, 并将它们从真菌作物中分离出来。蚂蚁将孢子的簇从巢中移出, 而触角则轻轻地移动以寻找方向。通过天线清洁器 (图 1; 请参阅视频 1), 同时保持孢子簇。蚂蚁把孢子落在垃圾堆里。 注意: 在当前的实验中, 没有对废料桩周围的活动进行记录, 但这将是当前协议的适当扩展。</li>
	</ol></li>
	<li>真菌除草 (视频 6)
	<ol>
<li>当蚂蚁在真菌的固定点停止腿部运动时, 观察这种行为。天线是松散地指向真菌的一部分, 蚂蚁试图去除, 而轻微地敲击真菌片。</li>
		<li>观察蚂蚁使用它的下颌骨来切割真菌作物以分离指定区域, 或者用它的下颌骨抓住真菌片的一部分 (图 1)。蚂蚁会同时从一侧到一侧的腿上摇摆, 而它会从真菌中抽出一块。 注意: 除草可以由多名工人和未成年人和专业人士完成。如果是这样, 一些蚂蚁做真菌切割, 其他进行摇摆和拉动运动。真菌的分离部分在巢外进行, 并在废料堆中掉落。在目前的试验中, 没有对废弃的沉积物进行记录, 但将是现行议定书的适当延伸。</li>
	</ol></li>
	<li>粪便液梳理 (视频 7)
	<ol>
<li>当蚂蚁在真菌花园的固定点停止腿部运动时, 观察这种行为。蚂蚁弯曲它的胃 (图 1), 头朝对方应用一滴粪便流体到口器。</li>
		<li>观察蚂蚁通过下颌骨 (图 1) 将前腿拉出, 一次一次。随后, 蚂蚁通过天线清洁器 (图 1) 移动天线, 它位于前腿胫骨上的关节上。</li>
	</ol></li>
	<li>水滴返流 (视频 8)
	<ol>
<li>当蚂蚁在真菌的固定点停止腿部运动时, 观察这种行为。触角是静止的和平行的, 指向真菌, 使景观和索之间的角度近似 45°, 和天线的尖端几乎触及对方和下颌骨的提示 (图 1)。</li>
		<li>观察蚂蚁在真菌上反刍一滴液体, 从它的口器, 从透明到浅黄色甚至褐色不等。</li>
	</ol></li>
</ol>

作者没有什么可透露的。

本研究的主要目的是观察和记录具有Escovopsis真菌-花园感染的特征叶型蚂蚁防御行为, 创建参考片段供广大科学界使用。应该指出的是, 这些行为并不排斥从Escovopsis的殖民地防御, 但也可能在防御其他污染物和感染方面发挥作用6,7,8,9 ,10,11,12, 和在蚂蚁自己的防御42。我们的协议为更广泛地研究真菌生长的蚂蚁的防御提供了背景。这可能是特别有用的: (i) 对那些不熟悉这些行为的年轻研究员;(二) 确保一致的定义和行为的观察;(三) 促进研究和蚂蚁物种之间的比较;(iv) 由于这些行为的一些可能很少发生, 甚至有经验的研究人员可能从来没有观察到它们;(iv) 因为了解和识别实验室中受控条件下的行为有助于实地研究, 条件难以控制。
我们的行为研究的结果与以前的工作是一致的, 这表明, 小工人真菌新郎-关键如果感染及早发现-超过主要工人25,28,32。在这里, 主要工人增加了Escovopsis感染后的真菌梳理量 (图 2a)。这表明, 小工人是主要的真菌美容师, 但主要工人可以帮助防止更成熟的感染的传播。较大的主要工人可以更快地去除孢子, 而较小的工人则更适合移除不太容易获得的孢子。我们还发现, 在感染的时候, 工人们成功地去除了大约一半感染的孢子 (四出九), 因此可以及早发现病原体 (图 3c)。总的来说, 这指向一系列的行为反应, 蚂蚁首先尝试通过去除孢子 (并在感染蔓延之前这样做) 来阻止Escovopsis感染, 而不是去除真菌花园的部分 (图 3a, b).这种变化随着时间的推移, 如果传染进展, 当蚂蚁更有可能去除部分真菌花园28。虽然我们的样本尺寸太小, 无法断定, 但我们不能排除同时感染导致的除草行为, 我们的数据支持这种趋势, 真菌除草主要存在于感染的后期阶段 (图3 a)。通常较低的真菌除草水平可能表明, 蚂蚁使用其他防御措施 (例如, 化学物质) 来抑制Escovopsis的进一步生长, 或者我们的实验亚群没有太严重感染 (使不必要的更具破坏性的防御)。
我们的发现表明, 使用粪便液进行自我梳理是蚂蚁进入真菌花园的特征, 并作为预防措施, 而不是与感染相关。在进入巢或处理作物27的时候, foundress 女性也看到了类似的观察, 它们在新郎自己并将粪便滴与嘴巴转移到腿上。如果去除的受感染的物质在垃圾堆中进行和丢弃, 理论上的感染应该增加真菌花园边缘工人的活动。因此, 粪便液的梳理也可能在感染期间间接增加, 以尽量减少疾病传播。我们预计, 严重感染的相反模式, 在真菌花园边缘的移动减少, 因为工人要么放弃真菌或采取更极端的措施, 如化学防御。
虽然粪便液可以作为一个重要的预防性化学物质的单个, allogrooming 被使用的巢队友在其他工人, 如果他们检测外来微粒或微生物。我们观察到粪液梳理 (n = 304) 和 allogrooming (n = 48) 的频率 (表 1) 之间的显著差异可能表明病原体检测有差异。蚂蚁无法用触角轻易地检测病原体;allogrooming 的另一只手是由巢队友做的, 他们可以检查蚂蚁的整个身体, 并且只选择在必要时新郎。由于Escovopsis是真菌花园的寄生虫, 而不是蚂蚁, 这也可能解释低量的 allogrooming。
我们很少观察 metapleural 腺体的梳理, 而且只有在感染的后期阶段。具有丰富Pseudonocardia细菌覆盖的真菌生长的蚂蚁的种类新郎 metapleural 腺体小于或无盖25,47的物种。作为. echinatior有丰富的共生47, 这可能解释低腺体梳理频率。metapleural 腺分泌物也很昂贵, 生产30, 并且可能被储存在 infrabuccal 口袋里较长的时间, 这意味着需要 metapleural 腺体的梳理可能是少见的。在 metapleural 腺体梳理期间, 蚂蚁同时切换腿和舔刚刚修剪腺体的腿;孢子被转移到 infrabuccal 口袋, 其中腺体分泌物是抑制Escovopsis潜在的后续发芽25的关键。小工人是更丰富的巢内和有更大的 metapleural 腺体单位体质量30, 表明他们是负责的大多数 metapleural 腺分泌物。这也可以解释为什么, 在我们的研究中, 真菌美容的最高频率是在小工人。
我们预计观察到的行为表明, 积极使用抗生素从细菌共生Pseudonocardia, 通常观察到Acromyrmex工人的角质层和已知发挥作用, 以防御Escovopsis36,39,40. 不遵守这种行为的最有可能的解释是, 这些抗生素的应用可能被纳入其他行为, 如自我梳理后, 真菌梳理和/或除草, 这可能会使它很难观察作为不同的行为。
我们观察到真菌花园反刍液滴的异常行为。nestmates 的食物反流已经在叶切蚁22中描述过了。在我们的实验中, 水滴在颜色上不同于透明到深褐色, 这表明它们可能是其他蚂蚁和/或提供水的食物来源。我们只观察了两次, 其他蚂蚁从液滴中饮用, 所以我们无法确定水滴是否有益于其他蚂蚁, 或者在湿度低的情况下为真菌补充水分。这种行为的大多数观察在Escovopsis感染期间, 这可能意味着一个防御作用, 如免疫启动通过反流的抗菌肽16,48。由于这种行为是罕见的, 我们不能得出坚定的结论, 但这将是一个有趣的行进一步调查, 例如, 通过确定水滴是否具有抗菌性质。
由于对叶刀蚂蚁复杂防御行为的观测研究, 包括与真菌园感染的任何比较, 在野外很难进行, 实验数据可以提供有价值的见解。这些行为在更受控制的条件下。虽然在实验室条件下所做的观察可能与自然条件下的行为不同, 但我们需要开发诸如我们的关键防御行为目录等工具, 以改进未来的实验和实地研究。然而, 实验方法可以部分解释为什么某些行为在我们使用这些行为定义的演示中非常罕见 (例如allogrooming、metapleural 腺体梳理)。因此, 未来的研究可能会考虑这一实验设置的局限性, 以便找到更自然的观察方法。还可以将其他因素纳入目前的议定书, 例如区分放线菌 (年轻) 工人和较不丰富的覆盖率的老年工人, 这可能对Escovopsis的威胁作出不同的反应。感染。在使观察更准确 (例如通过评分焦点个体), 或具有更大的子菌落大小 (更多的工人数量) 之间进行权衡, 以及在给定的情况下可以拍摄的子殖民地或个人的时间或数量时间点。然而, 虽然可以将设置扩展为更大的行为研究, 侧重于处理行为目标, 但在这种情况下, 我们专注于成功地展示了一种记录和定义特定防御行为的方法。
我们记录了在切叶蚂蚁中有助于防御的行为, 更重要的是, 系统地识别、描述和捕获了胶片上的防御行为。我们的代表结果加强了这一领域的其他研究, 说明为什么病原体很难成功地感染真菌养殖蚁群, 当面对广泛的防御行为和相关的抗菌药物应用化合物。我们的主要目标是为今后在这一领域的工作提供一个新的工具, 我们希望行为目录将证明是有价值的, 以确保共识和简化的定义, 观察和行为的解释, 作为一个重要的资源未来的研究。

叶切蚂蚁是先进的社会昆虫, 形成了地球上一些最复杂的殖民地。它们是真菌生长的蚂蚁 (部落 Attini) 的派生分支, 由两个属Acromyrmex和1。他们培育的真菌作物物种Leucoagaricus gongylophorus (担子菌门: 背景), 他们依赖作为其主要食物来源2,3。蚂蚁供应这种真菌与新鲜的叶子材料的生长, 和真菌的回报产生营养丰富的肿胀菌丝提示 (gongylidia), 被蚂蚁和他们的育雏消耗。殖民地建在地下, 真菌作物在室外花园4,5, 蚂蚁农民保护他们的作物单一的潜在病原体6,7,8 ,9,10,11,12。殖民地划分不同大小 (种姓) 和年龄13、14、15的工人之间的劳动, 这延伸到蚂蚁的防御和病原体的作物。
我们可能会期望叶子切割蚁群容易受到疾病的影响。由于频繁的相互作用, 群体生活有望促进相关工作者之间的疾病传播, 从而更容易传播16。蚂蚁易受昆虫病原真菌寄生虫的侵袭, 如绿僵种和白僵菌6。这些寄生虫是通才, 通常存在于靠近巢7,8的土壤中。种植真菌作物作为一种单一的4,5使它可能也容易受到疾病17,18。它可能感染由通才真菌寄生虫 (包括黑曲霉和木霉菌物种3);然而, 最重要的威胁是Escovopsis属的专科 necrotrophic 真菌 (Ascomycota: Hypocreales)11。通过分泌 mycolytic 酶和其他化合物, Escovopsis杀死并获得真菌作物12的养分, 对蚁群11,19有潜在的致命后果。
为了抗击疾病威胁, 蚂蚁在个体和菌落水平上都有显著的防御能力, 结合生物控制、行为和化学防御措施预防行为, 必要时对感染进行反应。总的来说, 这些防御措施防止或减少来自通才病原体和专家 (如Escovopsis) 感染的影响。从广义上讲, 它们包括避免寄生虫在环境中的收缩20, 防止寄生虫进入巢, 限制感染在巢内蔓延。第一条防线包括来自腺分泌物的化学物质3、21、22、23、24、25、26、 27消毒植物基质, 通过工人舔他们之前加入真菌花园, 蚂蚁进行自我和 allogrooming。当梳理自己, 特别是在进入巢, 工人也可能应用酸性粪便分泌物到他们的身体27。这些预防性防御措施显然是重要的, 以避免感染致病威胁6,7,8,9,10,11, 12。
如果最初的防御失败和病原体如Escovopsis成功进入巢和真菌花园, 并且如果在早期检测到感染, 蚂蚁使用真菌梳理去除孢子25,28.蚂蚁可以应用 metapleural 腺体分泌物或将孢子转移到 infrabuccal 口袋 (口腔), 在那里它们与含有 metapleural 和阴唇腺分泌物的化学鸡尾酒混合26。这些腺体中有超过20种已知化合物, 包括γ酮、羧酸和 indoleactic 酸3。这些均积极应用于25, 具有抗菌、抑真菌和杀菌性能29, 可抑制Escovopsis孢子萌发30。储存在 infrabuccal 口袋中的孢子后来被驱逐出31、32的殖民地外。大多数这种真菌梳理后早期检测是由小工人28,33执行。然而, 如果病原体设法避免检测和在真菌花园内蔓延, 小和主要工人杂草感染的部分真菌28, 和此删除的材料存放在巢31外。此外, 叶切割属Acromyrmex中的物种使用生物控制的形式的抗生素产生的共生放线菌34,35,36-维持在蚂蚁角质层37的主要年轻工人34,38,39,40-生产化合物, 防止Escovopsis菌丝生长34,38,41. 在感染19期间, 这种抗生素生产可能反过来受到Escovopsis产生的化合物的损害。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58420/58420fig1.jpg"> 图 1: 蚂蚁形态学特征.显示协议中所述形态学结构的蚂蚁的图解图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58420/58420fig1large.jpg" target="_blank">请点击这里查看这个数字的更大版本.</a>
叶切割蚂蚁防御因此构成了一种行为和化学机制的综合组装, 它们共同为这些蚂蚁提供了从疾病42中非常有效的保护。了解这些防御是广泛的兴趣, 他们已经广泛研究16,20,42,43,44。然而, 根据我们的知识, 对防御行为的可视化汇编将有助于对它们进行明确的定义和描述, 以供研究人员系统地使用。虽然用于描述蚂蚁行为的术语相对标准化, 但在不同的研究中, 同样的行为被命名为一致并不确定。在这里, 我们的主要目标是通过提供清晰和标准化的个人预防和防御行为的视频记录, 伴随着相关的定义来弥补这一点。我们在行为实验中拍摄了这些片段, 在这个过程中, 我们观察到并量化了Acromyrmex echinatior亚群的实验性Escovopsis感染情况下的行为, 结果我们也在这里作为此编译如何用于行为研究的一个例证示例。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1058">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plastic boxes</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:549px;">Transparent. Length: 3.15 in (8 cm), width: 2.17 in (5.5 cm), depth: 1.77 in (4.5 cm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:175px;">Sarstedt</td>
			<td>82.1472</td>
			<td>3.62x0.63 in (9.2x1.6 cm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Inoculation loops</td>
			<td style="width:175px;">Labsolute</td>
			<td style="width:119px;">7696431</td>
			<td>Disposable 1uL. Length: 7.67 in (19.5 cm)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cameras</td>
			<td style="width:175px;">DBPower</td>
			<td style="width:119px;">NTC50HD_8.5mm</td>
			<td>USB Endoscope Camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Holders for the cameras</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Old beaker clamp stand.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Laptop</td>
			<td style="width:175px;">HP</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Generic laptop for saving recordings.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Program used on the laptop</td>
			<td style="width:175px;">Windows Movie maker</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:216px;">Forceps</td>
			<td style="width:175px;">Vermandel</td>
			<td style="width:119px;">50.054</td>
			<td>Soft</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Potato dextrose broth</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6685-1KG</td>
			<td>24 g/L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a visual guide for studying behavioral defenses to pathogen attacks in leaf-cutting ants

研究了复杂的生活方式、先进合作的进化史和叶切蚂蚁的病害防御。虽然许多研究都描述了与疾病防御有关的行为, 以及化学和抗菌剂的相关使用, 但没有共同的视觉参考。本研究的主要目的是记录在疾病防御中所涉及的行为的简短片段, 预防和直接针对感染后的菌落拮抗剂。为了做到这一点, 我们使用了一个感染实验, 与叶切割蚂蚁物种Acromyrmex echinatior的子殖民地, 以及对蚂蚁的真菌作物 (Leucoagaricus gongylophorus)最显著的已知致病威胁, 一个专门Escovopsis属病原真菌。我们拍摄和比较感染和未感染的殖民地, 在早期和更先进的阶段感染。我们量化治疗的关键防御行为, 并表明对病原体攻击的行为反应可能在不同种姓的工人蚂蚁之间, 以及早期和晚期发现威胁之间发生变化。根据这些记录, 我们制作了一个行为剪辑库, 并附有主要个人防御行为的定义。我们预计, 这样的指南可以为在这一领域工作的其他研究人员提供一个共同的参考框架, 以识别和研究这些行为, 并提供更大的范围来比较不同的研究, 最终有助于更好地理解角色这些行为在疾病防御中发挥作用。

这项研究的主要目的是创建简短的剪辑, 说明与叶切蚂蚁疾病防御相关的行为, 以生成一个目录, 供将来研究参考。此外, 该研究使用了一个实验设置的例子, 其中这些行为被量化, 以显示此目录如何可以用于行为研究, 我们在这里总结的代表性结果。
在早期 (0 h) 和晚期 (72 h) 感染中建立了子菌落。由于72小时后Escovopsis以外的真菌的严重感染, 两个子菌落 (菌落 Ae160b 的一个控制和菌落 Ae322 的一种处理) 被排除在外, 因此我们将结果的显示重点放在 0 h 时间点上, 而不重视72小时后观察到的行为。在拍摄了所有子殖民地并得分防守行为后, 我们发现了与感染和语境相关的行为模式的差异, 包括次要和主要工人使用的不同方式。相比之下, 在控制和受感染的子殖民地的任何时候都进行自我梳理。这也是常见的, 当蚂蚁寻求, 并试图去除, Escovopsis菌丝或孢子。因为这种行为在所有情况下都是普遍观察和频繁的, 我们没有量化它。
我们对协议中描述的所有其他行为进行了评分, 并对每个子群体的次要和主要工人的计算的总频率和平均数进行了分析 (表 1)。我们发现, 在控制中, 小工人们把花园的庄稼修剪得比主要工人多 (图 2a), 有趣观察到他们在真菌花园里花了更多的时间。在受Escovopsis感染的菌落中, 总相对于控制菌落的真菌整理有增加的趋势, 但这并不显著 (F123 = 2.80, p = 0.1077;表2;图 2a). 有感染的粪便梳理的非显著增加 (F123 = 0.60, p = 0.4455;表1) 但次要和主要工人没有区别 (图 2b)。当工人进入真菌时, 我们观察到粪便的梳理, 而不是在长时间内或完全远离真菌的时候。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58420/58420fig2v3.jpg"> 图 2: 梳理事件的频率.平均数 (±标准错误 (SE); n = 9) (a)真菌整理和(b)粪便液在接种后四小时内梳理活动, 对照小的和主要的工人在控制和Escovopsis治疗。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58420/58420fig2large.jpg" target="_blank">请点击这里查看这个数字的更大版本.</a>
一些行为非常少见。我们只观察 metapleural 腺体梳理四次, 所有的实例发生在72小时后;一次在对照组, 三次在殖民地与Escovopsis感染 (表 1)。几乎不常见的是, 我们发现蚂蚁会将液体滴反刍到真菌花园中, 并在真菌之外数次 (表 1)。在 0 h 组, 这发生一次在控制子殖民地和两次在受感染的殖民地-在所有三个实例中的行为是由一个主要的工作人员执行。有一次, 一个小工人在盒子的角落里反刍一个水滴, 一个大工人在荆棘叶上也做了同样的工作, 无论是在Escovopsis治疗中。在 72 h 菌落中, 真菌上的液滴反流从未在控制菌落中观察到, 但在受感染的菌落中发生了七次。其中六是由主要工人和三这些由一个单一的人, 增加了在真菌花园之外的水滴。
孢子除草 (图 3a) 和真菌除草 (图 3b) 均为低频率。虽然感染的菌落和对照组之间的真菌除草次数没有显著差异, 但由于感染 (F123= 2.91, p = 0.1014;表2). 我们的观察集中在Escovopsis孢子除草, 这与时间没有显著变化, 但在感染Escovopsis的菌落中有更高频率的趋势, 而非未感染的对照组 (F123= 3.27, P = 0.0838;表2). 较少的亚菌落感染Escovopsis有可见孢子残留在观察期后早期感染 (当蚂蚁在0小时的孢子孕育后引入), 蚂蚁清除所有孢子在几乎一半的亚殖民地 (4 出 9;图 3c). 在晚期感染 (在孢子接种72小时后引入蚂蚁), 蚂蚁在任何子菌落中都不能完全清除孢子。这些观测结果表明, 蚂蚁在感染过程中从孢子除草转变为真菌除草的趋势。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58420/58420fig3v2.jpg"> 图 3: 除草事件的频率.平均频率 (±标准误差 (SE); n = 9) (a)孢子除草 ( Escovopsis孢子) 和(b)真菌除草 (Escovopsis或其他真菌) 在4小时观察期内, 比较未成年人与治疗组的专业,和(c)观察期结束时, 治疗组中具有可见Escovopsis孢子的子菌落数目。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58420/58420fig3large.jpg" target="_blank">请点击这里查看这个数字的更大版本.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>次要工人-控制</td>
			<td>未成年工-处理</td>
			<td>主要工人-控制</td>
			<td>主要工人-处理</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5" fo:text-align="center" style="text-align: center;">0h</td>
		</tr>
<tr>
<td>真菌美容</td>
			<td>84 (9.333)</td>
			<td>131 (14.56)</td>
			<td>37 (4.111)</td>
			<td>66 (7.333)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Allogrooming</td>
			<td>6 (0.6667)</td>
			<td>14 (1.556)</td>
			<td>5 (0.5556)</td>
			<td>6 (0.6667)</td>
		</tr>
<tr>
<td>孢子除草</td>
			<td>0</td>
			<td>3</td>
			<td>0</td>
			<td>5 (0.5556)</td>
		</tr>
<tr>
<td>真菌除草</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>大便液梳理</td>
			<td>46 (5.111)</td>
			<td>69 (7.667)</td>
			<td>27 (3.000)</td>
			<td>48 (5.333)</td>
		</tr>
<tr>
<td>液滴应用</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>1 (0.1111)</td>
			<td>2 (0.2220)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Metapleural 腺体梳理</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5" fo:text-align="center" style="text-align: center;">72h</td>
		</tr>
<tr>
<td>真菌美容</td>
			<td>10 (1.429)</td>
			<td>45 (5.000)</td>
			<td>24 (3.429)</td>
			<td>38 (4.222)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Allogrooming</td>
			<td>2 (0.2857)</td>
			<td>10 (1.111)</td>
			<td>1 (0.1110)</td>
			<td>4 (0.4440)</td>
		</tr>
<tr>
<td>孢子除草</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>1 (0.1110)</td>
		</tr>
<tr>
<td>真菌除草</td>
			<td>0</td>
			<td>1 (0.1110)</td>
			<td>0</td>
			<td>2 (0.2220)</td>
		</tr>
<tr>
<td>大便液梳理</td>
			<td>19 (2.714)</td>
			<td>38 (4.222)</td>
			<td>30 (4.286)</td>
			<td>30 (3.333)</td>
		</tr>
<tr>
<td>液滴应用</td>
			<td>0</td>
			<td>1 (0.1110)</td>
			<td>0</td>
			<td>6 (0.6667)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Metapleural 腺体梳理</td>
			<td>0</td>
			<td>2 (0.2220)</td>
			<td>1 (0.1429)</td>
			<td>1 (0.1110)</td>
		</tr>
</tbody></table>表1: 四小时观察的行为数量0以及72h 后Escovopsis接种.平均观察次数 (每位括号内每个个体的平均频率), 分别比较小的和主要的工人从控制和Escovopsis感染子菌落 (n = 9)。
<table border="1" fo:font-size="6" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="22" fo:text-align="center" style="text-align: center;">3型固定效果测试</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
			<td colspan="4">真菌美容</td>
			<td colspan="4">Allogrooming</td>
			<td colspan="4">粪便梳理</td>
			<td colspan="4">孢子除草</td>
			<td colspan="4">真菌除草</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">影响</td>
			<td>Num DF</td>
			<td>巢穴 DF</td>
			<td>F 值</td>
			<td>公关 > F</td>
			<td>Num DF</td>
			<td>巢穴 DF</td>
			<td>F 值</td>
			<td>公关 > F</td>
			<td>Num DF</td>
			<td>巢穴 DF</td>
			<td>F 值</td>
			<td>公关 > F</td>
			<td>Num DF</td>
			<td>巢穴 DF</td>
			<td>F 值</td>
			<td>公关 > F</td>
			<td>Num DF</td>
			<td>巢穴 DF</td>
			<td>F 值</td>
			<td>公关 > F</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">群</td>
			<td>2</td>
			<td>23</td>
			<td>0.77</td>
			<td>0.4733</td>
			<td>2</td>
			<td>23</td>
			<td>0.52</td>
			<td>0.5989</td>
			<td>2</td>
			<td>23</td>
			<td>0.54</td>
			<td>0.5903</td>
			<td>2</td>
			<td>23</td>
			<td>0.51</td>
			<td>0.6052</td>
			<td>2</td>
			<td>23</td>
			<td>1.17</td>
			<td>0.3272</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">分殖民地 (殖民地)</td>
			<td>6</td>
			<td>23</td>
			<td>0.93</td>
			<td>0.4892</td>
			<td>6</td>
			<td>23</td>
			<td>0.51</td>
			<td>0.7978</td>
			<td>6</td>
			<td>23</td>
			<td>0.63</td>
			<td>0.7067</td>
			<td>6</td>
			<td>23</td>
			<td>1.67</td>
			<td>0.1742</td>
			<td>6</td>
			<td>23</td>
			<td>1.53</td>
			<td>0.2127</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">治疗</td>
			<td>1</td>
			<td>23</td>
			<td>2。8</td>
			<td>0.1077</td>
			<td>1</td>
			<td>23</td>
			<td>1.85</td>
			<td>0.1875</td>
			<td>1</td>
			<td>23</td>
			<td>0。6</td>
			<td>0.4455</td>
			<td>1</td>
			<td>23</td>
			<td>3.27</td>
			<td>0.0838</td>
			<td>1</td>
			<td>23</td>
			<td>1</td>
			<td>0.3275</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">时间</td>
			<td>1</td>
			<td>23</td>
			<td>6.53</td>
			<td>0.0177</td>
			<td>1</td>
			<td>23</td>
			<td>0.88</td>
			<td>0.3574</td>
			<td>1</td>
			<td>23</td>
			<td>0.97</td>
			<td>0.3361</td>
			<td>1</td>
			<td>23</td>
			<td>0.53</td>
			<td>0.4742</td>
			<td>1</td>
			<td>23</td>
			<td>2.91</td>
			<td>0.1014</td>
		</tr>
</tbody></table>表2: 对可进行统计分析的不同行为的混合方差检验的统计结果。固定效果为菌落、亚群 (嵌套在菌落内)、治疗和时间。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58420/Nilsson-Moller_Table1.xlsx">请点击这里下载此表格.</a>
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/58420/58420video1.jpg"> 视频 1: 自我梳理和天线清洗.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58420/Video1.mp4" target="_blank">请点击这里查看此视频。右键单击可下载.</a>
<img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/58420/58420video2.jpg"> 视频 2: 真菌梳理.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58420/Video2.mp4" target="_blank">请点击这里查看此视频。右键单击可下载.</a>
<img alt="Video 3" src="/files/ftp_upload/58420/58420video3.jpg"> 视频 3: Allogrooming.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58420/Video3.mp4" target="_blank">请点击这里查看此视频。右键单击可下载.</a>
<img alt="Video 4" src="/files/ftp_upload/58420/58420video4.jpg"> 视频 4: Metapleural 腺体梳理.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58420/Video4.mp4" target="_blank">请点击这里查看此视频。右键单击可下载.</a>
<img alt="Video 5" src="/files/ftp_upload/58420/58420video5.jpg"> 视频 5: 孢子除草.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58420/Video5.mp4" target="_blank">请点击这里查看此视频。右键单击可下载.</a>
<img alt="Video 6" src="/files/ftp_upload/58420/58420video6.jpg"> 视频 6: 真菌除草.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58420/Video6.mp4" target="_blank">请点击这里查看此视频。右键单击可下载.</a>
<img alt="Video 7" src="/files/ftp_upload/58420/58420video7.jpg"> 视频 7: 大便液梳理.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58420/Video7.mp4" target="_blank">请点击这里查看此视频。右键单击可下载.</a>
<img alt="Video 8" src="/files/ftp_upload/58420/58420video8.jpg"> 视频 8: 水滴返流.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58420/Video8.mp4" target="_blank">请点击这里查看此视频。右键单击可下载.</a>

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A Visual Guide for Studying Behavioral Defenses to Pathogen Attacks in Leaf-Cutting Ants

我们在一个实验性感染场景中演示了叶片切割蚂蚁中的疾病防御行为的视觉指南, 其中包含单独的剪辑和伴随的定义。我们的主要目标是帮助其他研究人员认识到关键的防御行为, 并为今后在这一领域的研究提供共同的理解。

叶切蚁病原体攻击行为防御研究的可视化指南

The complex lifestyle, evolutionary history of advanced cooperation, and disease defenses of leaf-cutting ants are well studied. Although numerous studies ...

可视化协议为更广泛的防御和真菌生长蚂蚁的研究提供了参考框架。这种方法的主要优点是，它可以帮助研究人员识别关键的防御行为，以确保对未来工作的共同理解。对于不熟悉这些行为的年轻研究人员来说，研究真菌生长蚂蚁的参考可能特别有用。其中一些行为并不常见，因此有经验的研究人员可能从未观察到这些行为。本指南将说明关键防御行为以及一致定义，从而促进研究和蚂蚁物种之间的比较。此外，了解受控条件下的行为将有助于研究自然栖息地，那里的条件很难控制。首先，将埃斯科沃普西斯菌株从Acromyrmex紫锥菊菌菌群中分离，将真菌花园碎片与蚂蚁去除，在用湿润棉布的培养皿上放置数天，直到埃斯科莫普西斯发芽和孢子。将孢子转移到马铃薯葡萄糖糖板中，在大约23摄氏度的温度下孵育两周。使用无菌针头，从板中去除成熟的孢子。然后，在无菌条件下接种新盘上的孢子，并在约23摄氏度下孵育两周。当催眠诗已经生长到覆盖整个板并进入成熟的棕色孢子时，在无菌条件下将孢子接种到新板上。使用三个原始的A.Echinatior殖民地，从每个父殖民地获得总共36个分殖民地，每个父殖民地有12个子殖民地。在蚂蚁介绍前四小时，在原殖民地的真菌园中加入一茶匙大小的一块，一些荆棘叶，以及一块水浸的棉布。对于要感染的亚菌落，用埃斯科莫普西斯孢子填充接种循环。然后，通过轻轻敲击真菌花园的一小部分10至20次来接种孢子。对于控制亚菌落，通过利用无菌接种循环10至20次敲击真菌园，模拟Escovopsis孢子的应用。对于感染后72小时的观察，在引入Escovopsis后72小时内，让一半的亚菌群不受干扰。对于感染后零小时的观察，在记录前 30 分钟，立即将两名育雏、四名未成年工人和来自父殖民地的四名主要工人添加到每个包装盒中。然后，在记录前 30 分钟将相同的工作人员混合物添加到感染后 72 小时的观察中。对每个子殖民地执行四小时的视频录制。在记录了所有 36 个子殖民地后，查看录像并评分每个子殖民地中每个人感兴趣的行为。以下剪辑描述了观察期间要观察到的关键不同行为。在查看视频时，请注意蚂蚁是否停止腿部运动以启动自我梳理。检查以确保天线通过前腿上的天线清洁器。然后，蚂蚁应该用嘴部清洁腿部和天线清洁剂。此外，请注意，如果蚂蚁停止任何腿运动在真菌花园的固定点。观察天线是否静止且平行，指向真菌，并几乎靠近下形的尖端相互接触。然后，光泽应该出现舔真菌。一个或多个蚂蚁也可能互相梳理。在这种行为期间，蚂蚁停止所有运动，并密切站在一起，保持身体接触。然后，梳理蚂蚁应指向接收蚂蚁的天线，轻轻点击接收器。请注意，梳妆个体的上部和下口部分打开，光泽出现舔接收器蚂蚁。观察蚂蚁何时停止运动以启动元体腺梳理。蚂蚁应该靠在一边，并达到其前腿之一背部擦腺体的开口，同时舔另一个前腿与光泽。然后，蚂蚁将重复与相反的腿的行为。当蚂蚁在真菌花园的固定点上停止腿部运动时，请注意天线是一动不动的平行的，指向真菌花园的固定点。然后，蚂蚁将抓住可见的埃斯科沃普斯孢子，并把它们从巢中抬出来。蚂蚁也可以在真菌的固定点上停止腿部运动，将天线松散地指向一块真菌，然后用天线敲击真菌片。在此之后，蚂蚁会从真菌作物的其余部分分离出一块真菌。当蚂蚁在真菌花园的固定点停止腿部运动时，可能会观察到另一种潜在的行为。蚂蚁将弯曲其气管和头对对方，以应用一滴粪便液到其嘴部。蚂蚁会一次一个，它会拉它的前腿通过门面，天线通过天线清洁器。本研究的主要目的是创建一个短剪辑目录，说明切叶蚂蚁的疾病防御行为。协议中描述的行为在实验感染场景中得到评分。在控制殖民地，小工人比主要工人更培养花园作物。在受感染的菌落中，与控制菌落相比，真菌培养增加的趋势不显著。粪便梳理的显著增加与感染有关，但没有发现未成年人和主要工人的区别。孢子杂草和真菌杂草的频率都很低，在受感染的菌落和控制者之间没有显著差异。自从观察到感染以来，真菌杂草的杂草呈上升趋势。在4小时的观察期之后，很少有早期感染的感染菌落有明显的孢子。有趣的是，在后期感染条件下，蚂蚁不能完全去除任何菌落中的孢子。因此，这个实验的结果是一个说明性的例子，说明如何使用剪辑的汇编用于行为研究，以计算次要和主要工作行为的平均频率。我们记录了有助于真菌生长蚂蚁防御的行为，并在胶片上系统地识别、描述和捕获了这些行为。我们的研究结果加强了该领域的研究，表明为什么病原体在面对大量行为和相关抗微生物化合物时很难感染菌落。我们为该领域的未来工作提供了一个新的工具，并希望行为目录在获得共识和简化行为定义、观察和解释方面将证明是有价值的。

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