Name: a visual guide for studying behavioral defenses to pathogen attacks in leaf-cutting ants
Uploaded: 2018-10-12T15:00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Visual Guide for Studying Behavioral Defenses to Pathogen Attacks in Leaf-Cutting Ants at JoVE.com

Vi vill tacka linje Vej Ugelvig och Kirsten Sheehy för användbar diskussioner kring grooming mekanismer av antenn städare och filmning set-up. Michael Poulsen stöds av en Villum Kann Rasmussen Young Investigator Fellowship (VKR10101) och Tabitha Innocentius av en Marie Curie enskilda Europeiska gemenskap (IEF bevilja 627949). Vi vill också tacka the Smithsonian Tropical Research Institute för användning av faciliteter och logistiskt stöd i Panama och Autoridad Nacional del Ambienten om tillstånd att samla in och exportera myror till Danmark.

1. Escovopsis isolering
<ol><li>Isolera Escovopsis stammar från Acromyrmex echinatior laboratorium kolonier, genom att placera svampen trädgård fragment, med myror bort, på en petriskål med fuktig bomullstuss i flera dagar tills Escovopsis gror och sporulates. Överföra sporer till potatis dextros agarplattor (PDA, 39 g/L) och inkubera vid ca 23° C i ungefär två veckor. Obs: En stam användes i den aktuella studien.</li>
	<li>Använd en steril nål för att plocka ut mogna sporer från dessa första plåtar. Plocka tillräckligt sporer att täcka spetsen på nålen.</li>
	<li>Inokulera sporer på nya plattor under sterila förhållanden och inkubera vid ~ 23 ° C i cirka två veckor.</li>
	<li>När hyfer har täckt hela plattan och vuxit till mogna bruna sporer, upprepa steg 1.3 men denna gång med sporer från den nya PDA-plattan.</li>
	<li>Upprepa processen tills ett rena bestånd av Escovopsis för varje stam är förvärvade (inga synliga föroreningar som växer på eller under plattan ytan).</li>
</ol>2. experimental set-up
<ol><li>Använd tre A. echinatior kolonier. Obs: Här kolonierna Ae160b, Ae322 och Ae263 användes.</li>
	<li>Från varje koloni, göra 12 sub kolonier. Gör sex sub kolonier för observation efter 0 h och sex sub kolonier för observation efter 72 h. Detta ger totalt 36 sub kolonier. Markera hälften av sub kolonierna från varje ”förälder” koloni som kontroll, och den andra hälften som'Escovopsis behandling'. Obs: Medan i överordnade kolonier närvaron av en drottning påverkar arbetstagaren beteende, vi förväntar oss (även om detta inte kan garanteras), att drottning-mindre sub kolonier är benägna att bete sig som queenright kolonier under den korta tid som experimentet körs.</li>
	<li>För varje sub koloni, använda en fyrkantig låda med längd: ~ 3,15 tum (8 cm), bredd: ~ 2,17 på 5,5 cm och djup ~ 1.77 i (4,5 cm). Obs: Den viktiga punkten är att ge tillräckligt utrymme för myrorna utanför svampen fragmentet till foder och dumpa avfall, men samtidigt göra rutan tillräckligt liten för att det är möjligt att filma och beteende erkännande.</li>
	<li>För varje sub koloni, Lägg en te-sked storlek (ca 2,2 cm3 och 1,2 g) bit av den centrala delen av svampen trädgården (L. gongylophorus) från den ursprungliga kolonin, ett par bramble blad, och en bit av bomull indränkt i vatten. Obs: Råbomull ger fuktreglering. Det bör inte vara drypande av vatten, och bör inte röra svampen trädgården.</li>
	<li>För sub kolonier behandlas med Escovopsis, Använd en inympning loop och fyll öppningen så det bara omfattas av Escovopsis sporer. Inokulera sporer genom att försiktigt Knacka en liten, lokaliserad delen av svampen trädgården tio till tjugo gånger så att Sporerna inte alltför klustrade.</li>
	<li>För sub kolonier används som kontroller, härma tillämpningen av Escovopsis på svampen trädgården med en steril inympning loop. Obs: Även om detta inte skedde i det nuvarande experimentet, Inympning av ett sterilt pulver (som grafit eller Talk) kan göras i detta skede att skilja mellan en infektion med en patogen och en inert agent.</li>
	<li>För 72 h observationer, lämna hälften av sub kolonierna (både kontroller och infekterade) för 72 h efter införandet av Escovopsis innan du lägger till myrorna eller inleda video inspelningen. Obs: Väntar på 72 h i avsaknad av myror gör det troligt att Escovopsis sporer kommer att gro (opublicerade in vitro- data); även om detta ökar också risken för andra infektioner (t.ex. från en svamp som redan finns i svamp trädgården), är denna tidsperiod att föredra för denna behandling att representera i tidigt skede av en etablerad infektion.</li>
	<li>För 0 h observationer, direkt efter steg 2,6 och cirka 30 min innan inspelning lägga till två barnaskaran, fyra mindre och fyra stora arbetstagare samtidigt från den överordnade kolonin i varje ruta.<ol>
<li>Använd två stora arbetare från inom trädgården som är ung med ljust pigment, med Actinobacteria täcker de flesta av nagelbanden. Ta de andra två från utanför trädgården, med mörka pigment och Actinobacteria som endast täcker laterocervical plattorna.</li>
	</ol>
</li>
	<li>För 72 h observationer, upprepa 2.8 och 2.8.1 på 30 min innan inspelningen, dvs71,5 h efter inokulering med Escovopsis. Obs: Experimental sub kolonier är betydligt mindre än etablerade naturliga Acromyrmex kolonier. Detta är nödvändigt för att korrekt registrera beteende. Medan detta kan påverka frekvensen av vissa beteenden kvalitativt, var sammansättningen av sub kolonier valt att återspegla mix av arbetstagare i naturliga kolonier till mer sannolikt kvalitativt återspeglar de beteendemässiga interaktionerna.</li>
</ol>3. video inspelningen och scoring beteenden
<ol><li>Använd en USB endoskop bifogas en laptop (eller motsvarande) och tillhandahålla tillräckligt med ljus.</li>
	<li>För varje sub koloni, utföra videoinspelning i 4 h (börjar på antingen 0 h eller 72 h efter infektion).</li>
	<li>Efter inspelning 36 sub kolonierna, granska sammanlagt 144 h av film och poäng alla uppföranden av intresse för alla individer i varje sub koloni. Obs: I nuvarande experimentell exempel hade vi att utesluta två sub kolonierna (en kontroll från kolonin Ae160b) och en behandling sub koloni från kolonin Ae322 på grund av infektion med svampar än Escovopsis, minska det totala antalet timmar av observationer 136.</li>
	<li>Varje gång ett beteende observeras, spela in det som 1 händelse. Obs: Ett beteende kan vara kort eller lång tid, men endast Poäng det som > 1 om den avbryts av ett annat beteende, eller om myran är passiv under en tid.</li>
</ol>4. beteenden
Obs: Behavioral definitioner gjordes med hjälp av en kombination av beskrivningar från tidigare studier23,27,28,31,45 och personliga iakttagelser. För en detaljerad illustration skylta viktiga morfologiska strukturer används i protokollet för erkännande av beteenden, se figur 1.
<ol><li>Själv grooming och antenn rengöring (Video 1)<ol>
<li>Märka om myran slutar benrörelsefrihet att inleda själv grooming. Kontrollera att antennerna är draget igenom antenn städare på frambenen (figur 1), en clamp-liknande struktur ligger på tibia-tarsus gemensamma bestående av ett snäpp inför en sporre med olika storlek borst och kammar45, 46.</li>
		<li>Efter rengöring antennen, Observera att myran kommer att rensa benen och antenn städare, genom att dra benen genom de mouthparts, tar bort partiklar och potentiella patogener med glossa (figur 1). Obs: Själv grooming kan bestå av städning antennen och därefter antennen städare (figur 1), men också använda mouthparts för att rengöra benen. När en myra rengöring dess ben, rengör det oftast alla sex sträckor i följd.</li>
	</ol></li>
	<li>Svampen grooming (Video 2)
	<ol>
<li>Tillkännagivande om myran stannar benrörelser på en fast punkt på svampen trädgården. Observera att antennerna är orörlig och parallella pekade mot svampen så att vinkeln mellan skaftet och funiculus (figur 1) är cirka 45 °, och spetsen på antennerna nästan vidrör varandra, nära tips av Underkäkar ( (Se figur 1).</li>
		<li>Observera att den övre (maxillae) och lägre (labium) mouthparts är öppna, med den glossa (figur 1) framväxande slicka svampen.</li>
	</ol></li>
	<li>Allogrooming (Video 3)
	<ol>
<li>Observera detta beteende när en eller flera myror har närmat sig en annan (mottagaren) ant eller vice versa. Under uppförandet, myrorna stoppa rörelsen och stå tätt tillsammans med fysisk kontakt. Den grooming ant(s) kan flytta något att täcka ett större område av mottagarens Myrans kropp.</li>
		<li>Observera att av riskkällornas antenner kan vara orörlig och pekade mot en viss punkt av mottagande ant eller flytta och trycka lätt på mottagaren. Vinkeln mellan scape och funiculus (figur 1) är cirka 45 ° beroende på om de är fast på en viss punkt eller avlyssning. Tips på skådespelarens antenner är oftast nära varandra och tips av Underkäkar (figur 1).</li>
		<li>Observera att den övre (maxillae) och lägre (labium) mouthparts är öppna, med den glossa (figur 1) framväxande slicka mottagare myran.</li>
	</ol></li>
	<li>Metapleural körteln grooming (Video 4)<ol>
<li>Observera när myran stannar rörelsen att inleda metapleural körtel (figur 1) grooming. Observera att myran lutar åt sidan för att nå en av dess främre ben tillbaka till rub öppningen (meatus) i metapleural körtel (till exempel höger främre benet). Obs: Den andra framben är samtidigt (i detta exempel den vänstra främre benet) slickade av glossa (figur 1).</li>
		<li>Kontrollera att myran lutar till motsatt sida och byter ben och upprepar samma rörelse med motsatt ben. Myran fortsätter att röra frambenen till metapleural körtlar och därefter till den glossa som ständigt växlar mellan benen (figur 1). Obs: I det här exemplet myran nu förmedla den vänstra främre benet metapleural körteln och högra främre benet till glossa (figur 1). Efter metapleural körtel (figur 1) grooming, initierar myran ofta själv grooming (steg 4.1).</li>
	</ol></li>
	<li>Spore ogräsrensning (Video 5)
	<ol>
<li>Observera detta beteende när myran stannar benrörelser på en fast punkt på svampen trädgården. Observera att antennerna är orörlig och parallella, pekade mot svampen så att vinkeln mellan skaftet och funiculus är cirka 45°, och tips på antennerna nästan vidrör varandra och tips av Underkäkar (figur 1).</li>
		<li>Kontrollera att myran öppnar sin mandibles (figur 1) för att ta synliga Escovopsis sporer och lossa dem från svamp odling genom att dra dem bort. Myran bär kluster av sporer ur boet, medan antennerna försiktigt sig för orientering. Antennerna kan rengöras genom antenn städare (figur 1, se Video 1) medan du håller kluster av sporer. Myran sjunker sporer i en avfallet högen. Obs: Inspelning av aktiviteten runt avfallet högen gjordes inte i det nuvarande experimentet men skulle vara en lämplig förlängning av det nuvarande protokollet.</li>
	</ol></li>
	<li>Svampen ogräsrensning (Video 6)
	<ol>
<li>Observera detta beteende när myran stannar benrörelser på en fast punkt av svampen. Antennerna är löst pekade mot delen av svampen myran försöker ta bort, medan något trycka svamp bit.</li>
		<li>Observera att myran använder sin mandibles till antingen skär genom svamp grödan att lösgöra ett angivet område, eller att ta en del av svampen lappa med sin mandibles (figur 1). Myran kommer samtidigt rock från sida till sida på versen, medan det drar bort svampen lappa. Obs: Ogräsrensning kan göras av flera arbetare och både minderåriga och majors. Om så, några myror gör svampen styckning, utför andra den gungande och dra rörelse. Den fristående delen av svampen bärs utanför boet och avsläppt i avfallet högen. Inspelning av avfall insättningen gjordes inte i det nuvarande experimentet men skulle vara en lämplig förlängning av det nuvarande protokollet.</li>
	</ol></li>
	<li>Fekal vätska grooming (Video 7)
	<ol>
<li>Observera detta beteende när myran stannar benrörelser på en fast punkt på svampen trädgården. Myran böjer sina gaster (figur 1) och huvudet mot varandra för att tillämpa en droppe av fekal vätska på mouthparts.</li>
		<li>Observera att myran drar främre benen genom Underkäkar (figur 1), en i taget. Därefter flyttar myran antenner via antenn städare (figur 1) ligger på tibia-tarsus leden mellan frambenen.</li>
	</ol></li>
	<li>Droplet uppstötningar (Video 8)
	<ol>
<li>Observera detta beteende när myran stannar benrörelser på en fast punkt av svampen. Antennerna är orörlig och parallella, pekade mot svampen så att vinkeln mellan skaftet och funiculus är cirka 45°, och tips på antennerna berör nästan varandra och tips av Underkäkar (figur 1).</li>
		<li>Observera att myran kräks en droppe vätska på svampen, varierande från att vara transparent för ljus gul eller ens brun, från sin mouthparts.</li>
	</ol></li>
</ol>

Författarna har något att avslöja.

Huvudsyftet med denna studie var att observera och registrera karakteristiska leaf-skärning ant defensiva beteenden i närvaro av svamp-garden infektion med Escovopsis, skapa referens clips för använda av bredare forskarsamhället. Det bör noteras att dessa beteenden inte är uteslutande till försvar av kolonier från Escovopsis, men kan också spela en roll i försvaret mot andra föroreningar och infektioner6,7,8,9 ,10,11,12, och i försvaret av myrorna själva42. Våra protokoll ger en bakgrund för bredare forskning om försvar i svamp växande myror. Detta är sannolikt att vara särskilt användbart: (i) för unga forskare som inte är bekant med dessa beteenden; (ii) att säkerställa konsekvent definitioner för och observationer av beteenden; (iii) för att underlätta jämförelser mellan olika studier och ant arter. (iv) eftersom ett antal av dessa beteenden kan inträffa så sällan att även erfarna kan forskare aldrig observerat dem; (iv) eftersom förstå och känna igen beteenden under kontrollerade förhållanden i laboratoriet hjälp studier i situ där förhållandena är svårare att styra.
Resultaten från vår beteendemässiga studie överensstämmer med tidigare arbete som visade att mindre arbetstagare svampen brudgummen — avgörande om en infektion upptäcks tidigt — mer än stora arbetstagare25,28,32. Här, ökat stora arbetare mängden svamp grooming efter Escovopsis infektion (figur 2en). Detta tyder på att mindre arbetstagare är de dominerande svampen groomers, men att större arbetstagare kan hjälpa att förebygga spridningen av mer etablerade infektioner. Större större arbetarna ta bort sporer snabbare, medan mindre arbetare kunde vara mer lämpad för att ta bort mindre tillgängliga sporer. Vi fann också att arbetstagarna framgångsrikt bort sporer i omkring hälften av de smitta sub kolonierna (fyra av nio) när de infördes vid tidpunkten för infektion, och således kunde upptäcka den patogen tidigt (figur 3c). Sammantaget denna pekar på en serie av beteendemässiga Svaren där myrorna först försöka stoppa Escovopsis infektion genom att ta bort sporer (och gör så innan en infektion sprider), snarare än att ta bort delar av svampen trädgården (figur 3a, b. ). Detta förändras över tid om infektionen fortskrider, när myrorna är mer benägna att ta bort delar av den svamp trädgård28. Även våra urvalsstorlekar var för liten för att vara avgörande, och vi kan inte utesluta att samtidiga infektioner inducerad ogräsrensning beteenden, stöder våra data denna trend, med svampen ogräsrensning huvudsakligen att vara närvarande vid senare stadier av infektionen (figur 3 en). De allmänt låga nivåerna av svampen ogräsrensning antyder att myrorna andra försvar (t.ex.kemikalier) brukade ytterligare hämmar tillväxten av Escovopsiseller att ingen av våra experimentella sub kolonier smittades alltför hårt (att göra mer destruktiva försvar onödigt).
Våra fynd tyder på att själv grooming med fekal vätska är kännetecken av myror in svampen trädgården, och används som en profylaktisk åtgärd, i stället för att associeras med en infektion. Liknande observationer har setts i foundress honor som groom sig och överföra fekal droppar med sin mun till deras ben, när du anger boet eller hanterar grödan27. En infektion skulle i teorin öka aktiviteten av arbetstagare vid kanten av svampen trädgården, om det borttagna infekterat materialet utförs samt tappade i avfall högar. Därav, fekal vätska grooming kan också indirekt öka under infektion att minimera sjukdom som sprids. Vi förväntar oss det motsatta mönstret för allvarliga infektioner, med nedsatt rörlighet vid kanten av svampen trädgården, eftersom arbetstagare antingen överge svampen eller anta mer extrema åtgärder såsom kemiska försvar.
Medan fekal vätskor skulle kunna tjäna som ett viktigt profylaktiskt kemiska för individ, används allogrooming av boet-kompisar på andra arbetstagare om de upptäcker främmande partiklar eller mikrober. Den verkliga skillnaden vi observerade mellan frekvensen (tabell 1) av fekal vätska grooming (n = 304) och allogrooming (n = 48) kan tyda på en skillnad i upptäckt av patogen. Myror är inte kunna lätt upptäcka patogener på sig själva med sina antenner; allogrooming görs å andra sidan genom boet-mates, som kan inspektera hela kroppen av en myra och bara välja att brudgummen vid behov. Eftersom Escovopsis är en parasit svamp trädgården i stället för myrorna, kan detta också förklara den låga mängden allogrooming.
Vi observerade sällan metapleural körteln grooming, och endast i senare skeden av infektion. Arter av svamp växande myror med riklig Pseudonocardia bakteriell täcka brudgummen metapleural körtlar mindre än arter med mindre eller ingen täcka25,47. Som A. echinatior har ett överflöd av den symbiont47, kan detta förklara den låga körteln grooming frekvens. Metapleural körtel secretionen är också dyrt att producera30, och kan lagras inom infrabuccal fickan för längre tid, vilket innebär att behovet av grooming metapleural körtel kan vara ovanliga. Under metapleural körteln grooming, myrorna samtidigt växla ben och slicka benet som hade bara tränas körteln; sporer överförs därmed till infrabuccal fickan, där körtel sekret är avgörande för att hämma Escovopsis' potential för efterföljande groning25. Mindre arbetstagare är mer rikligt inuti boet och har större metapleural körtlar per enhet kropp massa30, tyder på att de är ansvariga för huvuddelen av metapleural körtel sekret. Detta skulle också förklara varför, i vår studie, den högsta frekvensen av svampen grooming var bland mindre arbetare.
Vi förväntas iaktta behavior(s) indikerar aktiv användning av antibiotika från den bakteriella symbiont Pseudonocardia, vanligen observerats på nagelbanden Acromyrmex arbetstagare och känd för att spela en roll i försvar mot Escovopsis 36 , 39 , 40. den mest sannolika förklaringen för att inte observera sådant beteende, är att tillämpningen av dessa antibiotika kan införlivas i andra beteenden, som själv grooming följt av svampen grooming eller ogräsrensning, som kan göra det svårt att följa som en distinkta beteende.
Vi observerade ovanliga beteende regurgitating flytande droppar vidare till svampen trädgården. Uppstötningar av mat för nestmates har tidigare beskrivits i blad-skärning myror22. I vårt experiment, droppar skilde sig i färg från transparent till mörkbrun, föreslår de får en näringskälla för andra myror eller ge vatten. Vi observerade endast två tillfällen där andra myror drack från droppar, så att vi inte kan avgöra om droppar gynna andra myror eller servera att rehydrera svampen När luftfuktigheten är låg. De flesta observationer av detta beteende var under Escovopsis infektioner, vilket kan innebära en defensiv roll, såsom immun priming av uppstötningar av antimikrobiella peptider16,48. Vi kan inte dra några säkra slutsatser om detta eftersom problemet var sällsynt, men det skulle vara en intressant linje att undersöka vidare, till exempel genom att fastställa huruvida droppar har antimikrobiella egenskaper.
Med tanke på att observationsstudier av komplexa defensiva beteenden av leaf-skärare myror, inklusive någon jämförelse med och utan trädgård infektion, skulle vara extremt svårt att göra i fältet, experimentella data kan ge värdefulla insikter i dessa beteenden under mer kontrollerade förhållanden. Medan de iakttagelser som gjorts under laboratorieförhållanden kan skilja sig från de beteenden som finns under naturliga förhållanden, verktyg såsom vår katalog av viktiga defensiva beteenden behöver utvecklas, för att förbättra både experimentell och fältet studier i framtiden. Den experimentella metoden kan dock delvis förklara varför vissa beteenden var extremt sällsynta (t.ex. allogrooming, metapleural körteln grooming) i vår demonstration av att använda dessa beteendemässiga definitioner. Framtida studier kan därför överväga begränsningar i detta experiment, att hitta sätt att göra mer naturlig observationer. Ytterligare faktorer kan också integreras i det nuvarande protokollet, till exempel skilja mellan Actinobacteria-bär (yngre) och äldre arbetstagare med mindre riklig lock, som kan svara annorlunda på hotet om en Escovopsis infektion. Det finns kompromisser mellan att göra observationer mer korrekt (till exempel genom poängsättning fokal individer), eller som har större sub kolonin storlek (större antal arbetstagare) och mängden tid eller antal sub kolonier eller individer som kan filmas på en given peka i tid. Dock fokuserade set-up skulle kunna utvidgas för större beteendevetenskapliga studier med fokus på att åtgärda en beteendevetenskaplig mål, i detta fall vi på framgångsrikt skylta en metod för registrering och definiera specifika defensiva beteenden.
Vi dokumenterade beteenden som bidrar till försvar i blad-skärning myror och mer påtagligt, har systematiskt identifieras, beskrivs och fångas defensiva beteenden på film. Våra representativa resultat förstärka annan forskning inom detta område tyder på varför det är svårt för en patogen att framgångsrikt angripa svamp-jordbruk Myra kolonier, när inför en omfattande uppsättning defensiva beteenden och associerade tillämpningen av antimikrobiella föreningar. Vårt huvudsakliga mål var att ge ett nytt verktyg för framtida arbete på detta område, och vi hoppas att beteendemässiga katalogen kommer att vara värdefulla för att säkra samstämmighet och strömlinjeformad definitioner, observationer och tolkningar av beteenden, att fungera som en viktig resurs för framtida forskning.

Leaf-skärning myror är avancerade sociala insekter, utgör några av de mest komplexa kolonierna på jorden. De är en härledd gren av svamp växande myrorna (stammen Attini) bestående av de två släkten Acromyrmex och Atta1. De odlar svamp gröda arten Leucoagaricus gongylophorus (basidiesvampar: Agaricales), som de lita på som sin huvudsakliga mat källa2,3. Myrorna leverera denna svamp med färska blad material för sin tillväxt och svampen i gengäld producerar näringsrika svullna hyphal tips (gongylidia) som konsumeras av myrorna och deras barnaskaran. Kolonierna är byggda under jord, svamp grödan bibehålls i externa gardens4,5och ant bönderna skydda sina grödor monokultur från potentiella patogener6,7,8 ,9,10,11,12. Kolonierna dela arbetet mellan arbetstagare av olika storlek (kast) och ålder13,14,15, som sträcker sig till försvar av myror och gröda från patogener.
Vi kan förvänta att blad-skärning Myra kolonier bör vara sårbara för sjukdomen. Grupp levande förväntas underlätta spridningen av sjukdomar mellan omsorgspersonal på grund av täta interaktioner och därmed lättare transmission16. Myrorna är mottagliga för entomopathogenic svamp parasiter, såsom Metarhizium arter och Beauveria bassiana6. Dessa parasiter är generalister och förekommer ofta i marken nära den Bon7,8. Odling av svamp grödan som en monokultur4,gör5 det sannolikt att också vara mottagliga för sjukdomen17,18. Det kan vara infekterade av generalist svamp parasiter (inklusive Aspergillus niger och Trichoderma arter3); dock det mest betydande hotet är en specialist necrotrophic svamp i släktet Escovopsis (Ascomycota: Hypocreales)11. Genom utsöndring av mycolytic enzymer och andra föreningar, Escovopsis dödar och erhåller näringsämnen från svampen gröda12, med potentiellt dödliga konsekvenser för Myra kolonier11,19.
För att bekämpa sjukdomen hot, har myrorna anmärkningsvärda försvar på både individ och kolonin nivå, att kombinera biologisk bekämpning, beteendemässiga och kemiska försvar att agera profylaktiskt och, när nödvändigt, som svar på infektion. Sammantaget dessa försvar förebygga eller minska effekterna av infektioner från både generalist patogener och specialister såsom Escovopsis. De innebär i huvudsak att undvika sammandragning av parasiter i miljö20, hindra parasiter från att ange boet, och begränsa smittspridning inom Bon. De första raderna i försvar inkluderar kemikalier från körtel sekret3,21,22,23,24,25,26, 27 att desinficera växt substrat, genom arbetstagare slicka dem före inkorporeringen i svampen trädgård och myror som utför både själv- och allogrooming. När grooming själva, särskilt vid inträdet boet, kan arbetstagare också gälla sura fekal sekret deras kropp27. Dessa profylaktiska försvar är bevisligen viktig till undvika infektion av patogena hot6,7,8,9,10,11, 12.
Om inledande försvar misslyckas och en patogen som Escovopsis lyckas komma in boet och svampen trädgården, och om infektionen upptäcks tidigt, använder myrorna svampen grooming att ta bort sporer25,28. Myrorna kan tillämpa sekret från metapleural körtlar eller överföra sporer till infrabuccal fickan (en munhålan), där de blandas med en kemisk cocktail som innehåller metapleural och labial körtel sekret26. Det finns mer än 20 kända föreningar i dessa körtlar, inklusive γ - keto-, karboxyl- och indoleactic syror3. Dessa är aktivt tillämpad25, har antibiotika, fungistatisk och svampdödande egenskaper29, och kan hämma Escovopsis spore grobarhet30. Sporer som lagras i infrabuccal ficka utvisas senare utanför den koloni31,32. De flesta av denna svamp grooming efter tidig detektering utförs av mindre arbetstagare28,33. Men om en patogen lyckas undvika upptäckt och sprider inom svampen trädgården, både mindre och större arbetstagare ogräs infekterade delarna svampen28och denna borttagna materialet deponeras utanför boet31. Dessutom art i släktet leaf-skärning Acromyrmex använda biologisk bekämpning i form av antibiotika som produceras av symbiotiska Actinobacteria34,35,36— underhålls på de ant nagelband37huvudsakligen unga stora arbetare34,38,39,40— att producera föreningar som förhindrar mycelial tillväxt av Escovopsis 34 , 38 , 41. denna antibiotika produktion kan i sin tur försämras av Escovopsis-producerade föreningar under en infektion19.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58420/58420fig1.jpg"> Figur 1: Ant morfologiska egenskaper. En schematisk skiss av en Myra som visar de morfologiska strukturer som nämns i protokollet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58420/58420fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Leaf-skärning ant försvar utgör således en integrerad montering av beteendemässiga och kemiska mekanismer som tillsammans ger dessa myror med mycket effektivt skydd mot sjukdom42. Förstå dessa försvar är av stort intresse, och de har varit omfattande forskat16,20,42,43,44. En visuell sammanställning av defensiva beteenden som skulle hjälpa entydig definition och beskrivning av dem för systematisk användning av forskare är dock, att vår kunskap, inte tillgängliga. Även om den terminologi som används för att beskriva ant beteende är relativt standardiserade, är det därför inte säkert att samma beteende gärningar heter konsekvent i olika studier. Här är vårt främsta mål att åtgärda detta genom att ge tydlighet och standardisering genom en sammanställning av videoinspelningar av enskilda profylaktisk och defensiva beteenden tillsammans med tillhörande definitioner. Vi filmade dessa klipp under ett beteende experiment, där vi observerade och kvantifieras beteenden i samband med experimentella Escovopsis infektioner av Acromyrmex echinatior sub kolonierna, vars resultat vi presenterar också här som ett belysande exempel på hur denna sammanställning kan användas för beteendevetenskapliga studier.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1058">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plastic boxes</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:549px;">Transparent. Length: 3.15 in (8 cm), width: 2.17 in (5.5 cm), depth: 1.77 in (4.5 cm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:175px;">Sarstedt</td>
			<td>82.1472</td>
			<td>3.62x0.63 in (9.2x1.6 cm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Inoculation loops</td>
			<td style="width:175px;">Labsolute</td>
			<td style="width:119px;">7696431</td>
			<td>Disposable 1uL. Length: 7.67 in (19.5 cm)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cameras</td>
			<td style="width:175px;">DBPower</td>
			<td style="width:119px;">NTC50HD_8.5mm</td>
			<td>USB Endoscope Camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Holders for the cameras</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Old beaker clamp stand.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Laptop</td>
			<td style="width:175px;">HP</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Generic laptop for saving recordings.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Program used on the laptop</td>
			<td style="width:175px;">Windows Movie maker</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:216px;">Forceps</td>
			<td style="width:175px;">Vermandel</td>
			<td style="width:119px;">50.054</td>
			<td>Soft</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Potato dextrose broth</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6685-1KG</td>
			<td>24 g/L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a visual guide for studying behavioral defenses to pathogen attacks in leaf-cutting ants

Den komplexa livsstilen, evolutionära historia Avancerat samarbete och sjukdom försvar av leaf-skärning myror är väl studerat. Även om många studier har beskrivit de beteenden i samband med sjukdom försvar och associerade användning av kemikalier och antimikrobiella medel, har ingen gemensam visuell referens gjorts. Huvudsyftet med denna studie var att spela in korta klipp av beteenden som är involverade i sjukdomen försvar, både profylaktiskt och direkt riktade mot en antagonist av kolonin efter infektion. Att göra så vi använde en infektion experiment, med sub kolonier av leaf-skärning ant arten Acromyrmex echinatior, och den mest betydande kända patogena hotet myrorna svamp gröda (Leucoagaricus gongylophorus), en specialiserad patogena svampar i släktet Escovopsis. Vi filmade och jämförde infekterade och icke-infekterade kolonier, i både tidiga och mer avancerade stadier av infektionen. Vi kvantifieras viktiga defensiva beteenden över behandlingar och visar att de beteendemässiga Svaren till patogen attack sannolikt varierar mellan olika kaster av arbetstagaren myror och mellan tidiga och sena detektion av ett hot. Baserat på dessa inspelningar som vi har gjort ett bibliotek av beteendemässiga klipp, tillsammans med definitioner av de viktigaste enskilda defensiva beteenden. Vi räknar med att sådan vägledning kan utgöra en gemensam referensram för andra forskare som arbetar inom detta område, att erkänna och studera dessa beteenden, och också ge större utrymme för att jämföra olika studier för att i slutändan hjälpa bättre förstå rollen dessa beteenden spela i sjukdom försvar.

Huvudsyftet med denna studie var skapandet av korta videoklipp som illustrerar beteenden associerade med sjukdom försvar i blad-skärning myror, att generera en katalog som ska användas som referens för framtida studier. Studien använder dessutom ett exempel på ett experiment inom vilken kvantifierades dessa beteenden för att visa hur denna katalog får användas i behavioral studies, vars representativa resultat sammanfattar vi här.
Sub-Colonies sattes upp för observation i tidigt skede (0 h) och sent skede (72 h) infektion. På grund av kraftiga infektioner med svampar än Escovopsis efter 72 h exkluderades två sub kolonierna (en kontroll för kolonin Ae160b) och en behandling för kolonin Ae322, så vi fokuserar presentationen av resultaten på 0 h tidpunkten och lägger mindre vikt beteenden som observerats efter 72 h. Efter filma alla sub kolonier och scoring defensiva beteenden, hittade vi skillnader i beteendemönster i samband med tid efter infektion och sammanhang, inklusive de olika sätt som de användes av mindre och större arbetstagare. Däremot utfördes själv grooming på alla gånger i både kontroll och infekterade sub kolonier. Det var också vanligt när myrorna var söker och försöker ta bort, Escovopsis hyfer eller sporer. Eftersom problemet var så allmänt observerade och frekvent i alla situationer, vi inte kvantifiera det.
Vi gjorde alla andra beteenden som beskrivs i protokollet och nuvarande beräknade totala och genomsnittliga frekvenser för mindre och större arbetare per sub koloni (tabell 1). Vi hittade kontroller, mindre arbetstagare tränas den trädgård gröda mer än stora arbetare (figur 2a), som anekdotiskt observerade att de tillbringade mer tid i svampen trädgården. I kolonierna infekterade med Escovopsis fanns det en tendens till ökad svampen grooming övergripande i förhållande till kontroll kolonier, men detta var inte signifikant (F1,23 = 2,80, p = 0.1077; Tabell 2. Figur 2 en). det var en icke-signifikant ökning i fekal grooming med infektion (F1,23 = 0,60, p = 0.4455; Tabell 1) men ingen skillnad mellan små och stora arbetstagare (figur 2b). Vi observerade fekal grooming när arbetstagare in svampen, snarare än när de var på eller helt bort från svampen för längre tidsperioder.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58420/58420fig2v3.jpg"> Figur 2: frekvens av grooming händelser. Det genomsnittliga antalet (± standardfel (SE), n = 9) av (a) svampen grooming och (b) fekal vätska grooming händelser inom fyra timmar efter inympningen, jämföra mindre och större arbetare i kontroller och Escovopsis behandlingar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58420/58420fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Flera beteenden var extremt sällsynt. Vi observerade endast metapleural körteln grooming fyra gånger, och alla instanser inträffat efter 72 h. en gång i kontrollgruppen, och tre gånger i kolonier med Escovopsis infektion (tabell 1). Vi hittade nästan som sällan, att myrorna skulle regurgitate en flytande droplet mot svampen trädgården och ett par gånger utanför svampen (tabell 1). I grupperna 0 h hände detta när en kontroll sub koloni och två gånger i infekterade kolonier - beteendet i alla tre instanser utfördes av en större arbetare. Vid ett tillfälle regurgitated en mindre arbetare en droppe i hörnet av rutan och en gång en större arbetare gjorde samma på en bramble blad, båda vid Escovopsis behandling. I 72 h kolonierna, var droplet uppstötningar på svampen aldrig observerats i kontroll kolonierna men hänt sju gånger i infekterade kolonier. Sex av dessa var av större arbetare och tre av dessa av en enda individ som lagt droppar utanför svampen trädgården.
Spore ogräsrensning (figur 3en) och svampen ogräsrensning (figur 3b) var båda låg frekvens. Fanns ingen signifikant skillnad i frekvens av svampen ogräsrensning mellan infekterade kolonier och kontroller, fanns det en tendens för ogräsrensning för att öka med tiden eftersom infektion (F1,23= 2,91, p = 0.1014; Tabell 2). våra observationer fokuserade på Escovopsis spore ogräsrensning, som inte förändrades betydligt med tiden, men det fanns en tendens till en högre frekvens i kolonier som angripits av Escovopsis än i icke-infekterade kontroller (F1,23 = 3,27, P = 0.0838; Tabell 2). färre sub kolonier infekterade med Escovopsis hade synliga sporer kvar efter observationsperioden med en tidig infektion (när myror infördes efter 0 h av spore inympningen), med myror att ta bort alla sporer i nästan hälften av sub kolonierna (4 av 9. Figur 3 c). I senare skede infektioner (där myror infördes efter 72 h av spore inympningen), myrorna inte var ägnat att undanröja sporer helt i någon av de underordnade kolonierna. Sammantaget tyder dessa observationer på en tendens för myrorna att flytta från spore ogräsrensning till svampen ogräsrensning under loppet av en infektion.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58420/58420fig3v2.jpg"> Figur 3: frekvensen av ogräsrensning händelser. Menar frekvens (± standardfel (SE), n = 9) (a) spor ogräsrensning (av Escovopsis sporer) och (b) svampen ogräsrensning (Escovopsis eller andra svampar) under en observationsperiod 4 h jämföra minderåriga och majors från behandlingsgrupperna, och (c) antalet sub kolonier med synliga Escovopsis sporer i behandlingsgrupperna vid slutet av observationsperioden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58420/58420fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Mindre arbetstagare - kontroll</td>
			<td>Mindre arbetstagare - behandling</td>
			<td>Stora arbetstagare - kontroll</td>
			<td>Stora arbetstagare - behandling</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5" fo:text-align="center" style="text-align: center;">0h</td>
		</tr>
<tr>
<td>Svampen grooming</td>
			<td>84 (9.333)</td>
			<td>131 (14,56)</td>
			<td>37 (4.111)</td>
			<td>66 (7.333)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Allogrooming</td>
			<td>6 (0.6667)</td>
			<td>14 (1.556)</td>
			<td>5 (0.5556)</td>
			<td>6 (0.6667)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spore ogräsrensning</td>
			<td>0</td>
			<td>3</td>
			<td>0</td>
			<td>5 (0.5556)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Svampen ogräsrensning</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fekal vätska grooming</td>
			<td>46 (5.111)</td>
			<td>69 (7.667)</td>
			<td>27 (3.000)</td>
			<td>48 (5.333)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Droplet-programmet</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>1 (0.1111)</td>
			<td>2 (0.2220)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Metapleural körteln grooming</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5" fo:text-align="center" style="text-align: center;">72h</td>
		</tr>
<tr>
<td>Svampen grooming</td>
			<td>10 (1.429)</td>
			<td>45 (5.000)</td>
			<td>24 (3.429)</td>
			<td>38 (4.222)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Allogrooming</td>
			<td>2 (0.2857)</td>
			<td>10 (1.111)</td>
			<td>1 (0.1110)</td>
			<td>4 (0.4440)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spore ogräsrensning</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>1 (0.1110)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Svampen ogräsrensning</td>
			<td>0</td>
			<td>1 (0.1110)</td>
			<td>0</td>
			<td>2 (0.2220)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fekal vätska grooming</td>
			<td>19 (2.714)</td>
			<td>38 (4.222)</td>
			<td>30 (4.286)</td>
			<td>30 (3.333)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Droplet-programmet</td>
			<td>0</td>
			<td>1 (0.1110)</td>
			<td>0</td>
			<td>6 (0.6667)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Metapleural körteln grooming</td>
			<td>0</td>
			<td>2 (0.2220)</td>
			<td>1 (0.1429)</td>
			<td>1 (0.1110)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1 : Antalet beteenden i fyra timmar för observation på 0 och 72 h efter Escovopsis inympning. Det genomsnittliga totala antalet observationer (med genomsnittlig frekvenser per individ inom parentes), jämföra mindre och större arbetstagare från kontroll och Escovopsis infektion sub kolonier, respektive (n = 9).
<table border="1" fo:font-size="6" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="22" fo:text-align="center" style="text-align: center;">Typ 3 tester av fasta effekter</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
			<td colspan="4">Svampen grooming</td>
			<td colspan="4">Allogrooming</td>
			<td colspan="4">Fekal grooming</td>
			<td colspan="4">Spore ogräsrensning</td>
			<td colspan="4">Svampen ogräsrensning</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Effekter</td>
			<td>NUM DF</td>
			<td>Den DF</td>
			<td>F-värde</td>
			<td>PR > F</td>
			<td>NUM DF</td>
			<td>Den DF</td>
			<td>F-värde</td>
			<td>PR > F</td>
			<td>NUM DF</td>
			<td>Den DF</td>
			<td>F-värde</td>
			<td>PR > F</td>
			<td>NUM DF</td>
			<td>Den DF</td>
			<td>F-värde</td>
			<td>PR > F</td>
			<td>NUM DF</td>
			<td>Den DF</td>
			<td>F-värde</td>
			<td>PR > F</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Koloni</td>
			<td>2</td>
			<td>23</td>
			<td>0,77</td>
			<td>0.4733</td>
			<td>2</td>
			<td>23</td>
			<td>0,52</td>
			<td>0.5989</td>
			<td>2</td>
			<td>23</td>
			<td>0,54</td>
			<td>0.5903</td>
			<td>2</td>
			<td>23</td>
			<td>0,51</td>
			<td>0.6052</td>
			<td>2</td>
			<td>23</td>
			<td>1.17</td>
			<td>0,3272</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Sub koloni (koloni)</td>
			<td>6</td>
			<td>23</td>
			<td>0,93</td>
			<td>0.4892</td>
			<td>6</td>
			<td>23</td>
			<td>0,51</td>
			<td>0.7978</td>
			<td>6</td>
			<td>23</td>
			<td>0,63</td>
			<td>0.7067</td>
			<td>6</td>
			<td>23</td>
			<td>1,67</td>
			<td>0.1742</td>
			<td>6</td>
			<td>23</td>
			<td>1,53</td>
			<td>0.2127</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Behandling</td>
			<td>1</td>
			<td>23</td>
			<td>2.8</td>
			<td>0.1077</td>
			<td>1</td>
			<td>23</td>
			<td>1,85</td>
			<td>0.1875</td>
			<td>1</td>
			<td>23</td>
			<td>0,6</td>
			<td>0.4455</td>
			<td>1</td>
			<td>23</td>
			<td>3.27</td>
			<td>0.0838</td>
			<td>1</td>
			<td>23</td>
			<td>1</td>
			<td>0.3275</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tid</td>
			<td>1</td>
			<td>23</td>
			<td>6,53</td>
			<td>0.0177</td>
			<td>1</td>
			<td>23</td>
			<td>0,88</td>
			<td>0.3574</td>
			<td>1</td>
			<td>23</td>
			<td>0,97</td>
			<td>0.3361</td>
			<td>1</td>
			<td>23</td>
			<td>0,53</td>
			<td>0.4742</td>
			<td>1</td>
			<td>23</td>
			<td>2,91</td>
			<td>0.1014</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2 : Statistiska resultat av blandade ANOVA testar på separata beteenden som statistiska analyser kan utföras. Fasta effekter var koloni, sub koloni (kapslade koloni), behandling och tid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58420/Nilsson-Moller_Table1.xlsx">Vänligen klicka här för att hämta tabellen.</a>
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/58420/58420video1.jpg"> Video 1: själv grooming och antenn rengöring. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58420/Video1.mp4" target="_blank">Vänligen klicka här för att se denna video. Högerklicka för att ladda ner.</a>
<img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/58420/58420video2.jpg"> Video 2: svampen grooming. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58420/Video2.mp4" target="_blank">Vänligen klicka här för att se denna video. Högerklicka för att ladda ner.</a>
<img alt="Video 3" src="/files/ftp_upload/58420/58420video3.jpg"> Video 3: Allogrooming. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58420/Video3.mp4" target="_blank">Vänligen klicka här för att se denna video. Högerklicka för att ladda ner.</a>
<img alt="Video 4" src="/files/ftp_upload/58420/58420video4.jpg"> Video 4: Metapleural körteln grooming. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58420/Video4.mp4" target="_blank">Vänligen klicka här för att se denna video. Högerklicka för att ladda ner.</a>
<img alt="Video 5" src="/files/ftp_upload/58420/58420video5.jpg"> Video 5: Spore ogräsrensning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58420/Video5.mp4" target="_blank">Vänligen klicka här för att se denna video. Högerklicka för att ladda ner.</a>
<img alt="Video 6" src="/files/ftp_upload/58420/58420video6.jpg"> Video 6: svampen ogräsrensning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58420/Video6.mp4" target="_blank">Vänligen klicka här för att se denna video. Högerklicka för att ladda ner.</a>
<img alt="Video 7" src="/files/ftp_upload/58420/58420video7.jpg"> Video 7: fekal vätska grooming. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58420/Video7.mp4" target="_blank">Vänligen klicka här för att se denna video. Högerklicka för att ladda ner.</a>
<img alt="Video 8" src="/files/ftp_upload/58420/58420video8.jpg"> Video 8: Droplet uppstötningar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58420/Video8.mp4" target="_blank">Vänligen klicka här för att se denna video. Högerklicka för att ladda ner.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Visual Guide for Studying Behavioral Defenses to Pathogen Attacks in Leaf-Cutting Ants at JoVE.com

A Visual Guide for Studying Behavioral Defenses to Pathogen Attacks in Leaf-Cutting Ants

Vi presenterar en visuell guide till sjukdom försvar beteenden i blad-skärning myror, med enskilda klipp och tillhörande definitioner, illustreras i en experimentell infektion scenario. Vårt huvudmål är att hjälpa andra forskare identifiera viktiga defensiva beteenden och att tillhandahålla en gemensam förståelse för framtida forskning på detta område.

En visuell Guide för att studera beteendemässiga försvar att patogenen attacker i blad-skärning myror

The complex lifestyle, evolutionary history of advanced cooperation, and disease defenses of leaf-cutting ants are well studied. Although numerous studies ...

Ett visualiserat protokoll ger en referensram för bredare forskning om försvar och svampväxande myror. Den största fördelen med detta tillvägagångssätt är att det kommer att hjälpa forskare att känna igen viktiga defensiva beteenden för att säkerställa en gemensam förståelse för framtida arbete. En referens för forskning i svampväxande myror är sannolikt särskilt användbar för unga forskare som inte är bekanta med dessa beteenden.Ett antal av dessa beteenden är sällsynta, så erfarna forskare kan aldrig ha observerat dem. Denna guide kommer att underlätta jämförelser mellan studier och ant arter genom att illustrera viktiga defensiva beteenden tillsammans med konsekventa definitioner. Dessutom kommer förståelse beteenden under kontrollerade förhållanden hjälpa studier i naturliga livsmiljöer, där förhållandena är svåra att kontrollera.Till att börja isolera Escovopsis stammar från Acromyrmex echinatior laboratorium kolonier, genom att placera svampen trädgårdsfragment, med myror bort, på en Petri-rätt med fuktig bomullsull i flera dagar, tills Escovopsis gror och sporulates. Överför sporer till potatisdextrosagarplattor och inkubera vid cirka 23 grader Celsius i två veckor. Med hjälp av en steril nål, ta bort mogna sporer från plattorna.Sedan, inokulera sporerna på nya plattor under sterila förhållanden, och inkubera dem på cirka 23 grader Celsius i två veckor. När hyfer har vuxit för att täcka hela plattan och i mogna bruna sporer, inokulera sporerna på nya plattor under sterila förhållanden. Med hjälp av tre ursprungliga A.Echinatior kolonier, erhålla totalt 36 subkolonier med 12 subkolonier från varje förälder koloni.Fyra timmar före ant introduktion, tillsätt en tesked storlek bit av den ursprungliga kolonins svamp trädgård, några bramble blad, och en bit vatten-indränkt bomull till lådan. För de subkolonier som ska smittas, fyll en inokuleringsslinga med Escovopsis sporer. Sedan, inokulera sporerna genom att försiktigt knacka en liten del av svampen trädgården 10 till 20 gånger.För kontroll subkolonierna, härma tillämpningen av Escovopsis sporer genom att knacka svampen trädgården med en steril inokulering slinga 10 till 20 gånger. För de 72 timmar långa observationerna efter infektionen, lämna hälften av subkolonierna ostörda i 72 timmar efter införandet av Escovopsis. För noll timme efter infektion observationer, omedelbart lägga till två kull, fyra mindre arbetstagare, och fyra stora arbetstagare från moderkolonin till varje låda 30 minuter före inspelningen.Lägg sedan till samma blandning av arbetstagare till 72 timmars observationer efter infektion 30 minuter före inspelningen. Utför videoinspelning i fyra timmar för varje subkoloni. Efter att ha spelat in alla de 36 subkolonierna, granska filmen och betyget beteenden av intresse för varje individ i varje subkoloni.Följande klipp ger en beskrivning av de viktiga distinkta beteenden som ska observeras under observationerna. Medan du granskar videon, märker om en ant stoppar ben rörelse för att inleda själv-grooming. Kontrollera att antennerna passerar antennerna på frambenen.Sedan bör myren rengöra sina ben och antennrengöringsmedel med sina mundelar. Också, märker om en ant stoppar några benrörelser vid en fast punkt i svampen trädgården. Observera om antennerna är stillastående och parallella, pekade mot svampen och nästan rör vid varandra nära fällbar spets.Sedan bör glossa dyka upp för att slicka svampen. En eller flera myror kan också vårda varandra. Under detta beteende, myrorna stoppa alla rörelse och stå tätt tillsammans, upprätthålla fysisk kontakt.Sedan bör grooming ant rikta sina antenner mot den mottagande ant och lätt peka på mottagaren. Observera att de övre och nedre delen av munnen delar av grooming individer är öppna med glossa framväxande att slicka mottagaren myra. Observera när anten stoppar rörelsen för att initiera metapleural körtelgrooming.Den ant ska luta sig till ena sidan och nå en av sina frambenen tillbaka för att gnugga öppningen av körteln, medan slicka den andra frambenet med glossa. Sedan kommer ant upprepa beteendet med de motsatta benen. När en ant stoppar benrörelser vid en fast punkt på svampen trädgården, observera att antennerna är orörliga och parallella, pekar mot en fast punkt av svampen trädgården.Sedan kommer anten att ta synliga Escovopsis sporer och bära dem ut ur boet. En ant kan också stoppa benrörelser på en fast punkt på svampen, rikta sina antenner löst mot en bit svamp och knacka svampen pjäs med sina antenner. Efter detta kommer anten att lossa bit svamp från resten av svamp grödan.En annan potentiella beteende kan observeras när en ant stoppar benrörelser på en fast punkt på svampen trädgården. Myren kommer att böja sin gaster och huvudet mot varandra för att tillämpa en droppe fekal vätska till dess mundelar. En i taget, kommer att anten dra sina framben genom underdibles, och antennen genom antennen rengöringsmedel.Huvudsyftet med denna studie var att skapa en katalog med korta klipp som illustrerar sjukdoms-försvar beteenden i bladskärande myror. De beteenden som beskrivs i protokollet var poängsed i en experimentell infektion scenario. I kontrollkolonierna, smederarbetare trädgården grödan mer än stora arbetstagare.I de infekterade kolonierna fanns en icke signifikant tendens till ökad svampvård i förhållande till kontrollkolonierna. En icke-signifikant ökning av fekal grooming var associerad med infektion, men ingen skillnad mellan mindre och stora arbetstagare upptäcktes. Spore weeding och svampens weeding var båda låg i frekvens, med ingen signifikant skillnad som observerats mellan infekterade kolonier och kontroller.En tendens för svampens weeding att öka med tiden sedan infektion observeras. Få av de infekterade kolonierna med infektioner i tidigt stadium hade synliga sporer kvar efter observationsperioden på fyra timmar. Intressant, i senare skede infektion villkor, myrorna inte kunde helt ta bort sporer i någon av kolonierna.Resultaten av detta experiment är alltså ett belysande exempel på hur sammanställningen av klipp kan användas för beteendestudier, för att beräkna genomsnittliga frekvenser för mindre och större arbetarbeteenden. Vi dokumenterade beteenden som bidrar till försvar i svampväxande myror, och har systematiskt identifierat, beskrivit och fångat dessa beteenden på film. Våra resultat förstärker forskning inom området som tyder på varför det är svårt för en patogen att infektera kolonier när de står inför en omfattande uppsättning beteenden och tillhörande anti-mikrobiella föreningar.Vi tillhandahåller ett nytt verktyg för framtida arbete inom området, och hoppas att beteendekatalogen kommer att visa sig värdefull för att säkra konsensus och strömlinjeformade definitioner, observation och tolkning av beteenden.

Research

JoVE Journal

Behavior

The Crossmodal Congruency Task as a Means to Obtain an Objective Behavioral Measure in the Rubber Hand Illusion Paradigm

Den Crossmodal kongruens Task som ett sätt att få en objektiv Behavioral Mät i gummihand Illusion Paradigm

The rubber hand illusion (RHI) is a popular experimental paradigm. Participants view touch on an artificial rubber hand while the participants' own hidden ...

Methods to Explore the Influence of Top-down Visual Processes on Motor Behavior

Metoder för att Utforska Inverkan av Top-down Visual processer på Motor Beteende

Kinesthetic awareness is important to successfully navigate the environment. When we interact with our daily surroundings, some aspects of movement are ...

A Procedure to Observe Context-induced Renewal of Pavlovian-conditioned Alcohol-seeking Behavior in Rats

Ett förfarande för att observera Context-inducerad Förnyelse av Pavlovian konditione Alkohol sökande beteende hos råttor

Environmental contexts in which drugs of abuse are consumed can trigger craving, a subjective Pavlovian-conditioned response that can facilitate ...

Performing Behavioral Tasks in Subjects with Intracranial Electrodes

Utföra Behavioral Uppgifter i ämnen med Intrakraniella Elektroder

Patients having stereo-electroencephalography (SEEG) electrode, subdural grid or depth electrode implants have a multitude of electrodes implanted in ...

Asymmetric Walkway: A Novel Behavioral Assay for Studying Asymmetric Locomotion

Asymmetric Gångväg: A Novel Behavioral analys för att studera Asymmetric Locomotion

Behavioral assays are commonly used for the assessment of sensorimotor impairment in the central nervous system (CNS). The most sophisticated methods for ...

Combined Shuttle-Box Training with Electrophysiological Cortex Recording and Stimulation as a Tool to Study Perception and Learning

Kombinerad Shuttle-Box Träning med Elektro Cortex inspelning och stimulering som ett verktyg för att studera Perception och lärande

Shuttle-box avoidance learning is a well-established method in behavioral neuroscience and experimental setups were traditionally custom-made; the ...

Vagus Nerve Stimulation as a Tool to Induce Plasticity in Pathways Relevant for Extinction Learning

Vagus nerve stimulation som ett verktyg för att inducera plasticitet i vägar som är relevanta för Extinction Lärande

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been ...

The Rodent Psychomotor Vigilance Test (rPVT): A Method for Assessing Neurobehavioral Performance in Rats and Mice

The Rodent Psychomotor Vigilance Test rPVT: A Method for Assessing Neurobehavioral Performance in Rats and Mice

Gnagare Psyko Vigilance Test (rPVT): En metod för bedömning neurobehavioral Performance i råttor och möss

The human Psychomotor Vigilance Test (PVT) is a widely used procedure for measuring changes in fatigue and sustained attention. The present article ...

Behavioral Disturbances: An Innovative Approach to Monitor the Modulatory Effects of a Nutraceutical Diet

Beteendestörningar: en innovativ strategi för att övervaka modulerande effekterna av en Nutraceutical Diet

In dogs, diets are often used to modulate behavioral disturbances related to chronic anxiety and stress caused by intense and restless activity. However, ...

Visual Classical Conditioning in Wood Ants

Visuella klassisk betingning i trä myror

Several species of insects have become model systems for studying learning and memory formation. Although many studies focus on freely moving animals, ...