Name: use of pre-assembled plastic microfluidic chips for compartmentalizing primary murine neurons
Uploaded: 2018-11-02T14:30:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons at JoVE.com

الكتاب تقر مساعدة فنية أو تحريرية من الذبول تايلور (شونا)، سميتا بارانجب (UNC-تشابل هيل)، جويس سيتشانووسكي (شونا) وبراد تايلور (شونا). الكتاب الاعتراف بدعم من ميكروفلويديكس شونا، شركة ذات مسؤولية محدودة والمعهد الوطني للصحة العقلية (R42 MH097377). تصوير أيده جزئيا كونفوكال ومولتيفوتون التصوير الأساسية مرفق من نيندس مركز منحة P30 NS045892 ومنحة مركز NICHD (U54 HD079124). المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية "المعاهد الوطنية للصحة".

<ol>
	<li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Microfluidic+Platforms:+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+Vitro+Tools+for+Neurobiological+Research.">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li><li>Virlogeux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+Corticostriatal+Network+on-a-Chip+Reveals+the+Contribution+of+the+Presynaptic+Compartment+to+Huntington's+Disease.">Reconstituting Corticostriatal Network on-a-Chip Reveals the Contribution of the Presynaptic Compartment to Huntington's Disease.</a> Cell Reports. 22 (1), 110-122 (2018).</li><li>Batista, A. F. R., Mart&#237;nez, J. C., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-axonal+Synthesis+of+SNAP25+Is+Required+for+the+Formation+of+Presynaptic+Terminals.">Intra-axonal Synthesis of SNAP25 Is Required for the Formation of Presynaptic Terminals.</a> Cell Reports. 20 (13), 3085-3098 (2017).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+regulation+of+astroglial+excitatory+neurotransmitter+transporter+GLT1.">Presynaptic regulation of astroglial excitatory neurotransmitter transporter GLT1.</a> Neuron. 61 (6), 880-894 (2009).</li><li>Sutton, M. A., Taylor, A. M., Ito, H. T., Pham, A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+decoding+of+neural+activity:+eEF2+as+a+biochemical+sensor+coupling+miniature+synaptic+transmission+to+local+protein+synthesis.">Postsynaptic decoding of neural activity: eEF2 as a biochemical sensor coupling miniature synaptic transmission to local protein synthesis.</a> Neuron. 55 (4), 648-661 (2007).</li><li>Hengst, U., Deglincerti, A., Kim, H. J., Jeon, N. L., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+elongation+triggered+by+stimulus-induced+local+translation+of+a+polarity+complex+protein.">Axonal elongation triggered by stimulus-induced local translation of a polarity complex protein.</a> Nature Cell Biology. 11 (8), 1024-1030 (2009).</li><li>Sharma, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-distance+control+of+synapse+assembly+by+target-derived+NGF.">Long-distance control of synapse assembly by target-derived NGF.</a> Neuron. 67 (3), 422-434 (2010).</li><li>Harrington, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+actin+modifiers+to+TrkA+endosomes+governs+retrograde+NGF+signaling+and+survival.">Recruitment of actin modifiers to TrkA endosomes governs retrograde NGF signaling and survival.</a> Cell. 146 (3), 421-434 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+maintenance+of+nodes+of+ranvier+rely+on+distinct+sources+of+proteins+and+targeting+mechanisms.">Assembly and maintenance of nodes of ranvier rely on distinct sources of proteins and targeting mechanisms.</a> Neuron. 73 (1), 92-107 (2012).</li><li>Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+translation+of+beta-catenin+regulates+synaptic+vesicle+dynamics.">Axonal translation of beta-catenin regulates synaptic vesicle dynamics.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).</li><li>Tran, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+immunotherapy+blocks+uptake+and+templated+propagation+of+misfolded+alpha-synuclein+and+neurodegeneration.">Alpha-synuclein immunotherapy blocks uptake and templated propagation of misfolded alpha-synuclein and neurodegeneration.</a> Cell Reports. 7 (6), 2054-2065 (2014).</li><li>Calafate, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+Contacts+Enhance+Cell-to-Cell+Tau+Pathology+Propagation.">Synaptic Contacts Enhance Cell-to-Cell Tau Pathology Propagation.</a> Cell Reports. 11 (8), 1176-1183 (2015).</li><li>Cosker, K. E., Fenstermacher, S. J., Pazyra-Murphy, M. F., Elliott, H. L., Segal, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+protein+SFPQ+orchestrates+an+RNA+regulon+to+promote+axon+viability.">The RNA-binding protein SFPQ orchestrates an RNA regulon to promote axon viability.</a> Nature Neuroscience. 19 (5), 690-696 (2016).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+mRNA+in+uninjured+and+regenerating+cortical+mammalian+axons.">Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).</li><li>Pinto, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteasome+controls+presynaptic+differentiation+through+modulation+of+an+on-site+pool+of+polyubiquitinated+conjugates.">The proteasome controls presynaptic differentiation through modulation of an on-site pool of polyubiquitinated conjugates.</a> The Journal of Cell Biology. 212 (7), 789-801 (2016).</li><li>Bigler, R. L., Kamande, J. W., Dumitru, R., Niedringhaus, M., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Messenger+RNAs+localized+to+distal+projections+of+human+stem+cell+derived+neurons.">Messenger RNAs localized to distal projections of human stem cell derived neurons.</a> Scientific Reports. 7 (1), 611 (2017).</li><li>Nagendran, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distal+axotomy+enhances+retrograde+presynaptic+excitability+onto+injured+pyramidal+neurons+via+trans-synaptic+signaling.">Distal axotomy enhances retrograde presynaptic excitability onto injured pyramidal neurons via trans-synaptic signaling.</a> Nature Communications. 8 (1), 625 (2017).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury,+regeneration+and+transport.">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).</li><li>Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+local+perfusion+chambers+for+the+visualization+and+manipulation+of+synapses.">Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses.</a> Neuron. 66 (1), 57-68 (2010).</li><li>Mukhopadhyay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+PDMS+isn't+the+best.+What+are+its+weaknesses,+and+which+other+polymers+can+researchers+add+to+their+toolboxes?.">When PDMS isn't the best. What are its weaknesses, and which other polymers can researchers add to their toolboxes?.</a> Analytical Chemistry. 79 (9), 3248-3253 (2007).</li><li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain research. 126 (3), 397-425 (1977).</li><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cells. , (1998).</li></ol>

A.M.T. مخترع موائع جزيئية الدائرة/الرقاقة (B2 7419822 لنا) وهو عضو في إكسونا ميكروفلويديكس، شركة ذات مسؤولية محدودة. ف موظف شونا ميكروفلويديكس، شركة ذات مسؤولية محدودة. J.H. عضو شونا ميكروفلويديكس، شركة ذات مسؤولية محدودة. T.N. تعلن لا تضارب المصالح المالية. وترعى ميكروفلويديكس شونا الوصول المفتوح المنشور من هذه المقالة.

رقائق مولتيكومبارتمينت البلاستيك توفر خياراً سهل الاستخدام لتجزئة الخلايا العصبية، تقديم الثقافات العصبية طويلة الأمد (> 3 أسابيع). هذا البروتوكول تفاصيل كيفية الثقافة القشرية وهيبوكامبال مورين من الخلايا العصبية داخل هذه الرقائق. ونوقشت أيضا إنشاء ميكرونفيرونمينتس قابلة للذوبان وكيف للوراء تسمية الخلايا العصبية والقيام أكسوتومي، وأداء إيمونوسيتوتشيميستري. الأهم من ذلك، تكون هذه الرقائق متوافقة مع عالية الدقة، الأسفار، وتصوير حية.
توفر العديد من نفس وظائف الأجهزة المستندة إلى PDMS مجزأة رقائق البلاستيك مولتيكومبارتمينت، ولكن لها مزايا وعيوب، وبعض السمات المميزة. ويقدم الجدول 1 مقارنة ميزة للرقائق البلاستيكية والأجهزة المستندة إلى PDMS. أولاً وقبل كل شيء، الرقائق قبل تجميعها وتدلي ماء بشكل دائم، مما يسهل التبول، جعلها أسهل في الاستخدام. البلاستيك ليس الغاز نفاذية، على عكس PDMS، حتى لو بشكل غير متوقع تشكل فقاعات داخل القنوات، أنهم لن يهربوا سهولة ويجب إزالته. حل قبل طلاء تتضمن أساسا الإيثانول وبعض العوامل الأخرى الملكية يلغي تشكيل فقاعة.
يعيش تصوير إسقاطات التالية توصيل البروتينات الفلورية أنجز داخل الرقائق (الشكل 4) وهناك أوتوفلوريسسينسي لا يمكن كشفها من البلاستيك. تحذير أن غمر الزيوت المستخدمة مع الرقاقة لأهداف الفتحة العددية عالية يجب أن زيت السيليكون على أساس، ولا الزيوت المعدنية على أساس. الزيوت المعدنية يمكن أن يسبب حدوث رد فعل سلبي مع كوبوليمر اوليفينيه دوري. للتصوير برايتفيلد، ومن المهم أن نلاحظ أن يتم تقريب ميكروجروفيس في الرقاقة في النهايات وهناك مستدق تدريجيا من z-اتجاه القنوات الرئيسية نحو الحاجز ميكروجروفي تسبب بعض إنكسار الضوء على حد سواء ميكروجروفيس أثناء برايتفيلد التصوير (الشكل 3). لأن قبل تجميع الرقائق، اختراق جسم ميكروجروفيس ميكرون الحجم قد يكون متفاوتاً (كما هو الحال مع الأجهزة المستندة إلى PDMS المرتهن بشكل دائم)؛ وبالتالي، ينبغي إجراء تحليل كمي عقب إيمونوستينينج في القنوات/المقصورات. يمكن تحسين Immunostaining الإسقاطات الخلايا العصبية داخل ميكروجروفيس بإنشاء فرق حجم بين المقصورات لمساعدة تدفق الأجسام المضادة و fluorophores إلى ميكروجروفيس.

ثقافة العصبية التقليدية باتباع نهج يؤدي ثمرة عشوائية من محاور عصبية و dendrites، التي تحول دون دراسة الخلايا العصبية في مورفولوجيا الاستقطاب بهم فريدة من نوعها. أجهزة مولتيكومبارتمينت ميكروفابريكاتيد قد أصبحت أدوات بحثية راسخة واستخداما جيدا لعلماء الأعصاب في السنوات 10-15 الماضية (منشورات رفيعة مختارة هي المشار إليها1،،من23 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17). هذه الأجهزة تقسيم الخلايا العصبية وتوفر أسلوباً جسديا وكيميائيا التلاعب بالمناطق سوبسيلولار من الخلايا العصبية، بما في ذلك سوماتى، dendrites، ومحاور عصبية، ونهايات18،19. كما أنها توفر النماذج التجريبية المتعددة التي لا يمكن استخدام عشوائي الثقافات، بما في ذلك دراسات النقل محواري محواري البروتين، إكسون الإصابة/التجديد، وإشارات إكسون-إلى-سوما. 2-حجرة التكوين الأساسي يتكون من قناتين موائع جزيئية متوازية مفصولة بواسطة سلسلة من أصغر ميكروجروفيس عمودي. يتم مطلي الخلايا العصبية الأولية أو المستمدة من الخلايا الجذعية في إحدى القنوات موائع جزيئية وتسوية ونعلق على السطح السفلي للجهاز، وتمديد نيوريتيس على مدى الأيام. العديد من النمو الأقماع تجد طريقها إلى ميكروجروفيس، وصغيرة بما يكفي أنها تمنع الهيئات الخلية من الدخول. نظراً للنمو والأقماع وتقتصر ماديا وغير قادر على تشغيل جميع أنحاء داخل ميكروجروفيس، أنها تنمو مباشرة إلى حجرة مجاورة (حجرة محواري) حيث أنهم معزولون.
تاريخيا، هذه الأجهزة قد تم مصبوب باستخدام poly(dimethylsiloxane) (PDMS) من العفن رئيسي فوتوليثوجرافيكالي منقوشة وأدلى داخلية في مختبرات المحققين أو شراؤها تجارياً. أحد العوائق الرئيسية لاستخدام PDMS هو ما هيدروفوبيسيتي20. PDMS يمكن إجراء ماء مؤقتاً، ولكن ثم سرعان ما تصبح مسعور في غضون ساعات في بيئة غير مائية20. وبسبب هذا، يجب أن تكون الأجهزة متصلة ساترة من زجاج أو غيرها الركازة مناسبة في وقت الاستخدام. قبل تجميع رقائق البلاستيك مولتيكومبارتمينت الآن متوفرة تجارياً (مثلاً، إكسوناتشيبس) بحقن مصبوب البلاستيك. وتصنع هذه الرقائق ماء بشكل دائم، تبسيط ترطيب الجهاز والسماح للجمعية قبل رقاقة مع طبقة رقيقة من دوري اوليفينيه كوبوليمر (COC) أرفق القنوات موائع جزيئية في الجزء السفلي. هذه الرقائق مصطنعة في بلاستيك شفاف بصريا مناسبة لتصوير الفلورية ذات الدقة العالية.
والغرض من هذا البروتوكول للتدليل على استخدام رقائق موائع جزيئية البلاستيك قبل تجميع لنماذج تجريبية متعددة إجراء باستخدام الخلايا العصبية هيبوكامبال أو القشرية مورين. هذا البروتوكول، توضح هذه المقالة كيفية الوراء تسمية الخلايا العصبية باستخدام فيروس السعار معدلة داخل الرقاقة. كما يتم وصف أكسوتومي للدراسات الإصابة إكسون والتجدد. وأخيراً، هذا البروتوكول يوضح كيفية تنفيذ immunostaining الأسفار مع الجهاز.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:652px;" width="651">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">XonaChip</td>
			<td style="width:175px;">Xona Microfluidics, LLC</td>
			<td style="width:109px;">XC150</td>
			<td style="width:165px;">150 &#181;m length microgroove barrier</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;"></td>
			<td style="width:175px;">Xona Microfluidics, LLC</td>
			<td style="width:109px;">XC450</td>
			<td style="width:165px;">450 &#181;m length microgroove barrier</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;"></td>
			<td style="width:175px;">Xona Microfluidics, LLC</td>
			<td style="width:109px;">XC900</td>
			<td style="width:165px;">900 &#181;m length microgroove barrier</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">XC pre-coat&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Xona Microfluidics, LLC</td>
			<td style="width:109px;">XC Pre-Coat</td>
			<td style="width:165px;">included with XonaChips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">XonaPDL&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Xona Microfluidics, LLC</td>
			<td style="width:109px;">XonaPDL</td>
			<td style="width:165px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">E17/E18 timed pregnant Sprague Dawley rats</td>
			<td style="width:175px;">Charles River</td>
			<td style="width:109px;">24100564</td>
			<td style="width:165px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">neuronal culture media:</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:165px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">- Neurobasal medium</td>
			<td style="width:175px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:109px;">21103049</td>
			<td style="width:165px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">-B-27 Plus Supplement (50x)</td>
			<td style="width:175px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:109px;">A3582801</td>
			<td style="width:165px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">-GlutaMAX Supplement</td>
			<td style="width:175px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:109px;">35050061</td>
			<td style="width:165px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">-Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td style="width:175px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:109px;">15240112</td>
			<td style="width:165px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">fluorinated ethylene propylene film</td>
			<td style="width:175px;">American Durafilm</td>
			<td style="width:109px;">50A</td>
			<td style="width:165px;">0.5 mil thickness</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">modified rabies virus</td>
			<td style="width:175px;">Salk Institute for Biological Studies</td>
			<td style="width:109px;">G-deleted Rabies-eGFP</td>
			<td style="width:165px;">Material Transfer Agreement required</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:203px;"></td>
			<td style="width:175px;">Salk Institute for Biological Studies</td>
			<td style="width:109px;">G-deleted Rabies-mCherry</td>
			<td style="width:165px;">Material Transfer Agreement required</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Alexa Fluor hydrazide 488</td>
			<td style="width:175px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:109px;">A10436</td>
			<td style="width:165px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Fluoromount G</td>
			<td style="width:175px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:109px;">00-4958-02</td>
			<td style="width:165px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Glass Pasteur pipettes</td>
			<td style="width:175px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:109px;">CLS7095D5X SIGMA</td>
			<td style="width:165px;">5.75 in length</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">hibernate-E Medium</td>
			<td style="width:175px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:109px;">A1247601</td>
			<td style="width:165px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Pierce 16% formaldehyde</td>
			<td style="width:175px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:109px;">28906</td>
			<td style="width:165px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">PBS (10x)</td>
			<td style="width:175px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:109px;">QVC0508</td>
			<td style="width:165px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">normal goat serum</td>
			<td style="width:175px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:109px;">16210064</td>
			<td style="width:165px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">triton X-100</td>
			<td style="width:175px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:109px;">28314</td>
			<td style="width:165px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">anti-vGlut1 antibody</td>
			<td style="width:175px;">NeuroMab</td>
			<td style="width:109px;">75-066</td>
			<td style="width:165px;">clone N28/9, 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">anti-vGAT antibody</td>
			<td style="width:175px;">Synaptic Systems</td>
			<td style="width:109px;">131 003</td>
			<td style="width:165px;">1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">anti_beta-tubulin III</td>
			<td style="width:175px;">Aves</td>
			<td style="width:109px;">TUJ</td>
			<td style="width:165px;">1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Alexa Fluor secondary antibodies</td>
			<td style="width:175px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:165px;">1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:203px;">Incubator, 5% CO2 37 &#176;C</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:165px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Epifluorescence imaging system</td>
			<td style="width:175px;">EVOS Fluorescence imaging system</td>
			<td style="width:109px;">AMF4300</td>
			<td style="width:165px;">10x objective</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Spinning disk confocal imaging system</td>
			<td style="width:175px;">Andor Technology</td>
			<td style="width:109px;">CSU-X1, iXon X3 EMCCD</td>
			<td style="width:165px;">60x silicone oil &#38; 20x objectives</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Laser scanning confocal imaging system</td>
			<td style="width:175px;">Olympus</td>
			<td style="width:109px;">FV3000RS</td>
			<td style="width:165px;">30x silicone oil objective</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of pre-assembled plastic microfluidic chips for compartmentalizing primary murine neurons

أساليب ميكروفابريكاتيد لتقسيم الخلايا العصبية أصبحت أدوات أساسية للعديد من علماء الأعصاب. ويصف هذا البروتوكول استخدام شريحة بلاستيكية قبل تجميع متوفرة تجارياً لتجزئة الفئران الابتدائي مثقف هيبوكامبال الخلايا العصبية. هذه الرقائق البلاستيكية، الواردة ضمن البصمة من شريحة مجهر القياسية، تتوافق مع عالية الاستبانة، ويعيش، وتصوير الأسفار. هذا البروتوكول يوضح كيفية إلى الوراء تسمية الخلايا العصبية عبر محاور عصبية معزولة باستخدام فيروس السعار تعديل ترميز بروتين فلوري وإنشاء ميكرونفيرونمينتس معزولة داخل حجرة واحدة، وأداء أكسوتومي وإيمونوسيتوتشيميستري على شريحة. يتم استزراع الخلايا العصبية > 3 أسابيع داخل رقائق البلاستيك، مما يوضح مدى توافق هذه الرقائق للثقافات العصبية طويلة الأمد.

بعد حوالي 5-7 أيام لنمو الخلايا العصبية داخل الرقاقة، يتجلى النمو محواري. الرقائق المتوافقة مع تصوير المرحلة-على النقيض كما يتبين في الشكل 3، مما يدل على نمو الخلايا العصبية في 24 يوما. رقائق البطاطس أيضا متوافقة مع الأسفار التصوير (الشكل 4و الشكل 5، الرقم 6و الرقم 7). ثلاثة أيام بعد العدوى بفيروس داء الكلب عن طريق حجرة محواري، تم تصويرها مشري-إيجابية الخلايا العصبية مع محاور عصبية تمتد في حجرة محواري في الرقاقة (الشكل 4). لإثبات قدرته على عزل فلويديكالي المقصورات، تمت إضافة صبغة فلورسنت وزن الجزيئي منخفض (488 فلور أليكسا المالئيك) إلى حجرة محواري. هذه النتائج قابلة للمقارنة على أساس PDMS الدائرة17 وتثبت مدى ملاءمة لرقائق البلاستيك لمرحلة التباين وتصوير الأسفار.
لتوضيح نمو الخلايا العصبية برقائق البلاستيك وأجهزة PDMS، نحن استزراع الخلايا العصبية في كل المنابر ورصد نمو الخلايا العصبية على مر الزمن. ويبين الشكل 5 نمو الخلايا العصبية من 3 إلى 22 يوما في الثقافة؛ هذه النتائج تمثل 3 تجارب مستقلة. نمو الخلايا العصبية قابل للمقارنة داخل البلدين منصات تصل إلى 15 يوما في الثقافة، ولكن في الثقافة أطول الإعمار (> 21 يوما) محاور عصبية معزولة داخل رقاقة البلاستيك يبدو أكثر صحة مع الديكور أقل (الشكل 5A). كذلك تصور محاور عصبية داخل المقصورات محواري، نحن إيمونوستينيد β-tubulin الثالث مما يدل على نمو محواري صحية داخل البلاستيك للرقائق في 22 يوما في الثقافة (الشكل 5 (ب)).
دراسات الإصابة والتجدد إكسون شائعة من استخدام أجهزة موائع جزيئية مجزأة. لإظهار مدى ملاءمة هذه الدراسات استخدام الرقائق، رجعية المسماة الخلايا العصبية تم تصويرها قبل و 24 ساعة بعد أكسوتومي (الشكل 6). لمبة سحب وتجديد إكسون كلا أكسوتومي التالية واضحة. هذه النتائج مكافئة للبيانات المنشورة باستخدام الأجهزة المستندة إلى PDMS14،17.
إيمونوسيتوتشيميستري تقنية شائعة داخل حجرة متعددة من الأجهزة لتصور التعريب البروتين. بعد 24 يوما في الثقافة، الخلايا العصبية داخل الرقائق كانت ثابتة والملون لكل علامات متشابك ضادات والمثبطة و vGlut1 وفجات، على التوالي (الشكل 7). وكانت الخلايا العصبية إلى الوراء مشري المسمى أيضا المصورة (الشكل 7). تم إجراء التصوير باستخدام القرص الغزل [كنفوكل] مع هدف غمر زيت سيليكون 60 ×، مما يدل على القدرة على القيام بتصوير عالي الدقة. الأهم من ذلك، كانت الأشواك الجذعية واضحة داخل منطقة مكبرة، مما يدل على أن الخلايا العصبية المزروعة داخل الرقائق تم تشكيل نهايات ناضجة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58421/58421fig1.jpg"> الشكل 1 : رقاقة موائع جزيئية المقصورة اثنين قبل تجميع، والبلاستيك لتجزئة الخلايا العصبية. (أ) التمثيل التخطيطي للرقاقة مولتيكومبارتمينت تبين مواقع الآبار العلوي والسفلي. (ب) تخطيطي موسع من شرائح عرض القنوات الرئيسية (أو الأقسام) وميكروجروفيس التي تربط المقصورات. القنوات الرئيسية حوالي 1.5 مم × 7 × 0.060 مم (م × × ل ح). العرض والارتفاع ميكروجروفيس حوالي 0.01 مم × 0.005 مم، على التوالي. طول ميكروجروفيس يختلف اعتماداً على التكوين، 0.15 ملم إلى 0.9 مم. (ج) بصورة فوتوغرافية لشريحة مولتيكومبارتمينت التمثيلية التي تحتوي على الأغذية تلوين صبغ في كل قناة رئيسية أو حجرة إثبات القدرة على فلويديكالي عزل كل قناة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58421/58421fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58421/58421fig2.jpg"> الشكل 2 : بيبيتينج التقنيات اللازمة عند استخدام رقائق البلاستيك مولتيكومبارتمينت. (أ) عند إضافة يسفط وسائل الإعلام ليغسل، ينبغي أن الزاوية نصيحة بيبيت بعيداً عن مدخل القناة الرئيسية كما هو موضح. (ب) عند تحميل الخلايا العصبية أو أداء أكسوتومي، تلميح بيبيت ينبغي أن تكون الزاوية نحو مدخل القناة الرئيسية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58421/58421fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58421/58421fig3.jpg"> الشكل 3 : صورة مجهرية تباين مرحلة عرض نموذجي نمو الخلايا العصبية داخل الرقاقة في 24 يوما في الثقافة- كان المصنف الخلايا العصبية هيبوكامبال الجنينية في حجرة حق جسدية. النمو إكسون مرئياً في البداية حجرة محواري في 5-7 أيام. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58421/58421fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58421/58421fig4.jpg"> الشكل 4 : إلى الوراء من الخلايا العصبية المسماة التعبير عن البروتين الفلورسنت مشري وتمتد محاور عصبية في حجرة محواري فلويديكالي معزولة. (أ) صورة مجهرية فلورية مدمجة إظهار الخلايا العصبية المسماة إلى الوراء يعيش بالعدوى عن طريق فيروس السعار مشري تعديل تطبيقها بإيجاز إلى حجرة محواري. وكانت الخلايا العصبية المصورة 3 أيام ما بعد الإصابة في 21 يوما في الثقافة. إنشاء المكروية معزولة داخل المقصورة محواري يتجلى تطبيق صبغة منخفضة الوزن الجزيئي، المالئيك 488 فلور أليكسا. (ب) صورة مدمجة من (أ) بما في ذلك صورة تباين (DIC) تدخل تفاضلية لتصور منطقة ميكروجروفيس للرقاقة. الصور التي تم الحصول عليها مع ليزر المسح مجهر [كنفوكل] استخدام زيت سيليكون × 30/1.05 N.A. (ني = 1.406) عدسة الهدف. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58421/58421fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58421/58421fig5.jpg"> الشكل 5 : مقارنة جنبا بجنب لنمو الخلايا العصبية داخل الأجهزة PDMS مولتيكومبارتمينت ورقائق البلاستيك. (أ) المرحلة ميكروجرافس على النقيض من كل المنابر التي اتخذت في 3 و 7، 15 و 22 يوما في الثقافة. في الجزء السفلي، منطقة تكبير أعلى مأخوذة من الصور في 22 يوما يتم تضمين لتوضيح محواري النمو في هذا العمر داخل كل المنابر. محاور عصبية داخل الرقاقة أكثر استمرارية وتظهر أكثر صحة من الجهاز PDMS في هذا العصر. (ب) الملون صورة مجهرية الفلورة عكس الثالث β-tubulin محاور عصبية داخل المقصورة محواري لكل جهاز PDMS ورقائق البلاستيك في 22 يوما في الثقافة. الصور التي تم الحصول عليها بنظام غزل تصوير [كنفوكل] قرص باستخدام 20 س/0.45 N.A. الهدف العدسة. هي كافة أشرطة مقياس 100 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58421/58421fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58421/58421fig6.jpg"> الرقم 6 : أكسوتومي والتجديد للخلايا العصبية هيبوكامبال داخل رقاقة مولتيكومبارتمينت البلاستيك. (أعلى) وكانت الخلايا العصبية إلى الوراء المسمى باستخدام فيروس السعار مشري معدلة وثم تصويرها قبل أكسوتومي في 24 يوما في الثقافة. وكانت الصور بسيودوكولوريد باستخدام جدول البحث عن الألوان 'النار'. (أسفل) وكان العصبية نفس تصويرها في أعلى اللوحة المصورة ح 24 وظيفة-أكسوتومي. خطوط متقطعة بيضاء تظهر حواف الحاجز ميكروجروفي. أكسوتومي وقع في موقع الخط المتقطع الأيسر. يظهر رأس السهم الأبيض لمبة تراجع. السهم الأبيض يدل تجديد إكسون. الصور تم الحصول عليها مع غزل قرص [كنفوكل] نظام تصوير باستخدام عدسة هدف N.A. ×/0.45 20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58421/58421fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58421/58421fig7.jpg"> الشكل 7 : سينابسيس النموذج بين الخلايا العصبية هيبوكامبال مثقف داخل رقائق البلاستيك مولتيكومبارتمينت. إيمونوستينينج كان يؤديها في 24 يوما في الثقافة وتصويرها داخل المقصورة الجسدية باستخدام عدسة غمر زيت سيليكون 60 ×. الخلايا العصبية إكسبريس (A) علامة المشبك ضادات، vGlut1 (الأخضر) و (ب) علامة المشبك المثبطة، فجأت (أزرق). (ج) المسمى Retrograde مشري الخلايا العصبية (أحمر) أصيبوا عن طريق فيروس السعار المعدل المطبق لحجرة محواري. (د) فلورية مدمجة صورة مجهرية vGlut1، فجأت ومشري. (ه) المنطقة المكبرة في (د) أشارت إلى مع مربع أبيض يظهر العمود الفقري الجذعية، المواقع التي تتلقى مدخلات متشابك من الخلايا العصبية الأخرى. الصور التي تم الحصول عليها بنظام غزل تصوير [كنفوكل] قرص باستخدام زيت سيليكون × 60/1.3 N.A. (ني = 1.406) عدسة الهدف. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58421/58421fig7large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>رقائق البلاستيك مولتيكومبارتمينت</td>
			<td>أجهزة PDMS مولتيكومبارتمينت</td>
		</tr>
<tr>
<td>عزل محاور عصبية</td>
			<td>عزل محاور عصبية</td>
		</tr>
<tr>
<td>إنشاء ميكرونفيرونمينتس</td>
			<td>إنشاء ميكرونفيرونمينتس</td>
		</tr>
<tr>
<td>أكسوتوميزي الخلايا العصبية</td>
			<td>أكسوتوميزي الخلايا العصبية</td>
		</tr>
<tr>
<td>شفافة بصريا</td>
			<td>شفافة بصريا</td>
		</tr>
<tr>
<td>متوافق مع التصوير عالية الدقة</td>
			<td>متوافق مع التصوير عالية الدقة</td>
		</tr>
<tr>
<td>متوافق مع الفحص المجهري الأسفار</td>
			<td>متوافق مع الفحص المجهري الأسفار</td>
		</tr>
<tr>
<td>تجميع كامل</td>
			<td>الجمعية إلى الركيزة اللازمة</td>
		</tr>
<tr>
<td>محاور عصبية صحية > 21 يوما</td>
			<td>محاور عصبية صحية > 14 يوما</td>
		</tr>
<tr>
<td>ماء السطح تثقيف</td>
			<td>مسعور</td>
		</tr>
<tr>
<td>الغاز كتيمة</td>
			<td>الغاز نفاذية</td>
		</tr>
<tr>
<td>ميكروجروفيس مستدير والقنوات</td>
			<td>ميكروجروفيس مستقيم</td>
		</tr>
<tr>
<td>خطوات إعداد أقل</td>
			<td>أعلى قابل للإزالة لتلطيخ داخل ميكروجروفيس</td>
		</tr>
<tr>
<td>غير متوافق مع التذرية الليزر</td>
			<td>امتصاص الجزيئات الصغيرة والمذيبات العضوية</td>
		</tr>
<tr>
<td>غير متوافق مع زيوت الغمر المستندة إلى الزيوت المعدنية (زيوت السيليكون المستندة على ما يرام)</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: مقارنة بين البلاستيك ومنصات PDMS مولتيكومبارتمينت لاستزراع الخلايا العصبية.

Watch this Scientific Journal Video about Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons at JoVE.com

Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons

ويصف هذا البروتوكول استخدام رقائق البلاستيك للثقافة، وتقسيم الخلايا العصبية مورين الأولية. هذه الرقائق ستنشئ وسهلة الاستخدام ومتوافق مع عالية الاستبانة، ويعيش، وتصوير الأسفار. هذا البروتوكول وصف كيفية لوحة الفئران الخلايا العصبية هيبوكامبال داخل هذه الرقائق وأداء عزل فلويديك وأكسوتومي وإيمونوستينينج.

استخدام رقائق موائع جزيئية البلاستيك قبل تجميع لتجزئة الخلايا العصبية مورين الأولية

Microfabricated methods to compartmentalize neurons have become essential tools for many neuroscientists. This protocol describes the use of a ...

أصبحت الأجهزة microfluidic المستخدمة لتقسيم الخلايا العصبية أداة قياسية في علم الأعصاب، مما مكن الباحثين من التلاعب جسدياً وكيميائياً بالمناطق دون الخلية من الخلايا العصبية بما في ذلك سوماتا، ومحور عصبي، والتشعبات، والتشابك العصبي. يمكن أن تساعد هذه الأجهزة الثقافة المجزأة في الإجابة على العديد من الأسئلة في مجال علم الأعصاب ، مثل ، كيف تمتد المحاور أثناء التطوير لتشكيل نقاط الاشتباك العصبي ، وكيف يمكن إعادة تشكيل نقاط الاشتباك العصبي وإصلاحها بعد تلف محور عصبي وكيف يمكن للظروف المرضية أن تنتشر عبر متشابك في أمراض مثل الزهايمر. يصف هذا البروتوكول استخدام رقاقة متعددة الأجزاء البلاستيكية المُكَدَسة مسبقًا لخلايا الفئران الأساسية الخاصة بالثقافة.الميزة الرئيسية لاستخدام هذه الرقائق هي أنها توفر طريقة سهلة الاستخدام وقابلة للاستنساخ للغاية لتقسيم الخلايا العصبية. ميزة أخرى هي أن هذه الرقائق تسفر عن نمو أكثر صحة وطويلة الأجل من الخلايا العصبية والمحا المحاور المعزولة من الأجهزة المجزأة القائمة على السيليكون السابقة ومتوافقة على قدم المساواة مع المجهر عالية الدقة. كما أن النظم النموذجية الأخرى بما في ذلك الخلايا الجذعية البشرية قادرة على أن تكون مُثقَلة داخل الرقاقة المجزأة المُكَسَمَة مسبقاً.للبدء، ضع شريحة معقمة متعددة الأجزاء في طبق بيتري. إضافة 100 ميكرولترات من محلول ما قبل التكويد إلى بئر أعلى اليسار من رقاقة والسماح لها بالتدفق من خلال القناة الرئيسية في البئر المجاورة. بعد ذلك، قم بتعبئة البئر السفلية اليسرى من الشريحة بـ 100 ميكرولترات من محلول التكويد المسبق.هذه المرة، انتظر خمس دقائق للسماح للحل بالتدفق عبر الأخادق الصغيرة. الآن، إضافة 100 ميكرولترات من حل precoding إلى أعلى اليمين جيدا والسماح لها بالتدفق من خلال القناة الرئيسية في البئر المجاورة. بعد 90 ثانية، املأ البئر السفلي الأيمن بـ 100 ميكرولترات من محلول التكويد المسبق واحتضان الشريحة لمدة 10 دقائق.بعناية زاوية تلميح ماصة، بعيدا عن القناة الرئيسية وpirate الحل من كل بئر. ثم، على الفور إضافة 150 ميكرولترers من برنامج تلفزيوني إلى أعلى اليسار جيدا وانتظر دقيقة ونصف. بعد ذلك، أضف 150 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني إلى البئر السفلي الأيسر وانتظر خمس دقائق للسماح للسائل بالتدفق عبر الأخادق الصغيرة.ثم، إضافة 150 ميكرولترس من برنامج تلفزيوني إلى الآبار العلوية اليمنى والسفلى اليمنى، في هذا الترتيب. بعد 10 دقائق، مرة أخرى التعرق برنامج تلفزيوني وتكرار خطوات الغسيل للمرة الثانية. بعد الغسيل الثاني ، يُفطّن برنامج تلفزيوني من الآبار كما كان من قبل عن طريق صيد طرف الماصات ، بعيدًا عن افتتاح القناة.ثم، إضافة 100 ميكرولترات من 0.5 مزيج لكل ميل بولي-D-ليسين الحل، إلى بئر أعلى اليسار من رقاقة. انتظر دقيقة ونصف ثم املأ البئر السفلي الأيسر بـ 100 ميكرولترات من حل Poly-D-Lysine. كرر هذه العملية على النصف الأيمن من الشريحة.أغلق طبق بيتري. ثم ضع الرقاقة في حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد الحضانة ، شطف الشريحة مرتين مع برنامج تلفزيوني كما هو موضح سابقًا.المقبل، الطامح في برنامج تلفزيوني من الجهاز. على الفور، إضافة 100 microliters من وسائل الإعلام ثقافة الخلية إلى بئر أعلى اليسار من رقاقة. بعد دقيقة ونصف، أضف الوسائط إلى البئر السفلي الأيسر.انتظر خمس دقائق للسماح لوسائل الإعلام بالتدفق عبر الأخاقيقات الصغيرة ثم تكرار عملية التعبئة على الجانب الأيمن من الشريحة. إعداد تعليق خلية من الخلايا العصبية فرس النهر الفئران منفصلة وفقا للبروتوكولات المعمول بها. إزالة غالبية وسائل الإعلام في كل بئر من رقاقة ولكن ترك القنوات شغلها.المقبل، على الفور تحميل خمسة microliters من تعليق الخلية في أعلى اليمين جيدا وآخر خمسة microliters من تعليق الخلية في بئر أسفل اليمين. عند تحميل الخلايا، أشر إلى طرف الماصات نحو القناة الرئيسية. بعد تحميل الخلايا، نقل رقاقة إلى مرحلة المجهر والتأكد من أن الخلايا العصبية في القناة الرئيسية.بعد انتظار خمس دقائق لخلايا إرفاق، إضافة تقريبا، 150 ميكرولترات من وسائل الإعلام ثقافة الخلايا العصبية إلى كل من الآبار العلوية والسفلى اليمنى. ثم أضف 150 ميكرولترات من الوسائط إلى كل بئر من الآبار العلوية والسفلى اليسرى. غطي طبق بيتري وضع الرقاقة في صينية مرطبة في ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪، حاضنة 37 درجة مئوية.أولاً، قم بإزالة 20 ميكرولترات من البئر السفلي الأيسر من المقصورة المحورية وضعه في البئر العلوي الأيمن من حجرة الجسم. انتظر دقيقتين للتدفق داخل كل قناة لتككيل. بعد ذلك، قم بإزالة 50 ميكرولترات من الوسائط من مقصورة محور عصبي، وأضف 0.3 ميكرولترات من ملليمتر واحد من الفلور أليكسا 488 إلى هذه الوسائط.الماصات صعودا وهبوطا لخلط الحل ومن ثم العودة وسائل الإعلام التي تحتوي على صبغة الفلورسنت مرة أخرى إلى مقصورة محور عصبي. عند هذه النقطة، ضع الرقاقة على المجهر والصورة حسب الرغبة. لإجراء axotomy داخل الشريحة، أولا، إزالة الوسائط من مقصورة محور عصبي، والحفاظ على تلميح ماصة بعيدا عن مدخل القناة الرئيسية.تخزين الوسائط التي تمت إزالتها في أنبوب الطرد المركزي في الوقت الراهن. بعد ذلك، ضع ماصة الطموح بالقرب، إما مدخل القناة الرئيسية للمقصورة المحورية واتّر مقصورة محور عصبي تمامًا. استمر في pirate المنطقة لمدة دقيقة إلى دقيقتين.استبدل حجرة المحور المحوري بالوسائط المخزنة. تأكد من إزالة المحلّل من المقصورة بالكامل، كما أنّ المحاور تُقطع بالنظر إلى العينة تحت المجهر. ثم، تغطية رقاقة وإعادتها إلى الحاضنة.للبدء في الخضوع للمناعة المفلورة، قم بإزالة معظم الوسائط من الشريحة، مع الحفاظ على رطوبة المقصورات الداخلية. على الفور، إضافة 100 ميكرولترات من حل التثبيت إلى الآبار العليا من مقصورات محور عصبي و الجسم. بعد دقيقة واحدة، إضافة 100 ميكرولترات من حل التثبيت إلى الآبار السفلية وإصلاح الخلايا لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.إزالة معظم الحل من الآبار وعلى الفور، إضافة 150 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني إلى كل من الآبار العليا من مقصورات محور عصبي و الجسمية. انتظر دقيقتين لبرنامج تلفزيوني لتدفق في الآبار السفلية، ثم، وإزالة برنامج تلفزيوني وشطف الآبار مرتين أكثر باستخدام هذه العملية نفسها. بعد الشطف الأخير، وإزالة معظم برنامج تلفزيوني من آبار رقاقة وعلى الفور، إضافة 150 ميكرولترس من برنامج تلفزيوني مع 0.25٪ تريتون x-100 إلى كل من الآبار العليا من مقصورات محور عصبي و الجسمية.انتظر لمدة 15 دقيقة ثم، وإزالة معظم السائل من الآبار. على الفور، إضافة 150 ميكرولترات من حل حجب إلى كل من الآبار العليا من المقصورات محور عصبي و الجسمية. بعد 15 دقيقة، وإزالة معظم السائل من الآبار وعلى الفور، إضافة 100 ميكرولترات من الحل الأجسام المضادة الأولية، إلى كل من الآبار العليا من مقصورات محور عصبي و الجسمية.قم بتغطية الرقاقة لتقليل التبخر واحتضان الخلايا في الجسم المضاد الأساسي لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، شطف الشريحة عن طريق إزالة معظم الحل وإضافة 150 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني إلى كل بئر من الآبار العليا من المقصورات المحورية وsalmatic. بعد خمس دقائق، وإزالة برنامج تلفزيوني من كل من الآبار وتكرار شطف مرتين أكثر.الآن، إزالة معظم السائل من الآبار وعلى الفور، إضافة 100 ميكرولترات من الأجسام المضادة الثانوية في برنامج تلفزيوني، إلى كل من الآبار العليا من مقصورات محور عصبي وماماتيكة جدا. قم بتغطية الرقاقة لتقليل التبخر واحتضان الرقاقة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. كما هو مبين سابقا ، شطف رقاقة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني ثم ، جبل وصورة رقائق كما هو موضح في بروتوكول النص المرافق.يظهر هنا، هو مقارنة جنبا إلى جنب من الخلايا العصبية التي تزرع على رقائق بلاستيكية وأجهزة PDMS. نمو الخلايا العصبية قابلة للمقارنة داخل المنصتين تصل إلى 15 يوما في الثقافة، ولكن في العصور ثقافة أطول، محاور عصبية معزولة داخل رقاقة بلاستيكية، تبدو أكثر صحة مع أقل الضرب. وللمزيد من تصور محاور الحساسية داخل مقصورات محور عصبي، كانت هذه العينات مُلَهَسة أيضاً مناعية بالنسبة لبيتا توبولين الثالث، مما يُظهر نمواً صحياً في محور عصبي داخل الرقائق البلاستيكية في 22 يوماً في الثقافة.مزيد من تلطيخ مع عينات لمدة 24 يوما يظهر الخلايا العصبية التي تزرع في رقائق بلاستيكية للتعبير عن كل من علامات متشابك مثير ومثبطة، vGlut1 وvGat. وهنا اثنين من علامات متشابك جنبا إلى جنب مع الخلايا العصبية mCherry المسمى الرجعية. لإثبات ملاءمة هذه الشريحة لإصابات محور عصبي ودراسات التجديد ، تم تصوير الخلايا العصبية الرجعية المسماة قبل وبعد 24 ساعة من axotomy.لمبة التراجع ومحور عصبي تجديد كلاهما واضح بعد axotomy. هذه النتائج هي معادلة للبيانات المنشورة باستخدام أجهزة تستند PDMS. رقائق متعددة المكونات الكلاسيكية توفر خيارا سهل الاستخدام للخلايا العصبية المجزأة التي توفر ثقافات الخلايا العصبية على المدى الطويل، والتي لا تزال قابلة للحياة لفترة أطول من ثلاثة أسابيع.أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن البذور العدد المناسب من الخلايا العصبية والتأكد من حاضنة الخاص بك هو جيدا ترطيب أثناء الثقافة.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

زراعة والكهربية من الخلايا على رقائق التصحيح، المشبك NRCC

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

الكالسيوم فوسفات ترنسفكأيشن من الخلايا العصبية الحصين الابتدائية

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

التصوير شجيري العمود الفقري من الفئران الابتدائية الحصين الخلايا العصبية باستخدام منظم الإضاءة المجهر

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

الثقافة الابتدائية من الخلايا العصبية الدوبامين ماوس

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

عزل خلايا الدماغ الأولية الفئران الاوعية الدموية الدقيقة غشائي

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

وضع نماذج لموت الخلايا العصبية وضمور في الخلايا العصبية الأولية الحبيبية للدماغ الماوس

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

صور حية من GLUT4 البروتين الاتجار بالماوس الخلايا العصبية طائي الأولية باستخدام الفحص المجهري Deconvolution

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices

عالية الدقة حجم التصوير من الخلايا العصبية باستبعاد استخدام Fluorescence الأسلوب وكرست أجهزة موائع جزيئية

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

عزل خلايا بطانية Microvascular الابتدائي مورين الهيكل العظمى والعضلات

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...