Name: assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells
Uploaded: 2018-11-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells at JoVE.com

ברצוננו להודות המרכזים המטולוגיה לילדים הצ'כית. עבודה זו היה נתמך על ידי מענק של משרד הבריאות (NV15-28848A), על ידי משרד הבריאות של הרפובליקה הצ'כית, אוניברסיטת בית החולים במוטול, פראג, הרפובליקה הצ'כית 00064203 ועל ידי משרד החינוך, נוער, ספורט NPU אני נ. LO1604.

כל הדגימות התקבלו עם informed consent של הילדים ההורים או האפוטרופסים ואישור הוועדה האתית של אוניברסיטת קארל ב פראג, צ'כיה, המחקר אין. NV15-28848A.
1. הכנת נוגדנים
<ol><li>להכין 500 מ ל- PBS על ידי המסת 137 מ מ NaCl 2.7 מ"מ אשלגן כלורי, מ מ 4.3 נה2HPO4, מ מ 1.47 אינץ ח'2PO4, ב- ddH2O. התאם...

<ol>
	<li>DeBerardinis, R. J., Lum, J. J., Hatzivassiliou, G., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biology+of+Cancer:+Metabolic+Reprogramming+Fuels+Cell+Growth+and+Proliferation.">The Biology of Cancer: Metabolic Reprogramming Fuels Cell Growth and Proliferation.</a> Cell Metabolism. 7, 11-20 (2008).</li><li>Ward, P. S., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Reprogramming:+A+Cancer+Hallmark+Even+Warburg+Did+Not+Anticipate.">Metabolic Reprogramming: A Cancer Hallmark Even Warburg Did Not Anticipate.</a> Cancer Cell. 21, 297-308 (2012).</li><li>Pavlova, N. N., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Emerging+Hallmarks+of+Cancer+Metabolism.">The Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism.</a> Cell Metabolism. 23, 27-47 (2016).</li><li>Wise, D. R., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+addiction:+a+new+therapeutic+target+in+cancer.">Glutamine addiction: a new therapeutic target in cancer.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35, 427-433 (2010).</li><li>Kroemer, G., Pouyssegur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Cell+Metabolism:+Cancer's+Achilles'+Heel.">Tumor Cell Metabolism: Cancer's Achilles' Heel.</a> Cancer Cell. 13, 472-482 (2008).</li><li>Liberti, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Predictive+Model+for+Selective+Targeting+of+the+Warburg+Effect+through+GAPDH+Inhibition+with+a+Natural+Product.">A Predictive Model for Selective Targeting of the Warburg Effect through GAPDH Inhibition with a Natural Product.</a> Cell Metabolism. 26, 648-659 (2017).</li><li>Lundgaard, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+neuronal+glucose+uptake+heralds+activity-dependent+increases+in+cerebral+metabolism.">Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism.</a> Nature Communications. 6, 6807 (2015).</li><li>Hermanova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+inhibition+of+fatty-acid+oxidation+synergistically+enhances+the+effect+of+l-asparaginase+in+childhood+ALL+cells.">Pharmacological inhibition of fatty-acid oxidation synergistically enhances the effect of l-asparaginase in childhood ALL cells.</a> Leukemia. 30, 209-218 (2016).</li><li>Malandrino, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+fatty+acid+oxidation+in+adipocytes+and+macrophages+reduces+lipid-induced+triglyceride+accumulation+and+inflammation.">Enhanced fatty acid oxidation in adipocytes and macrophages reduces lipid-induced triglyceride accumulation and inflammation.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308, E756-E769 (2015).</li><li>Patella, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics-based+metabolic+modeling+reveals+that+fatty+acid+oxidation+(FAO)+controls+endothelial+cell+(EC)+permeability.">Proteomics-based metabolic modeling reveals that fatty acid oxidation (FAO) controls endothelial cell (EC) permeability.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics: MCP. 14, 621-634 (2015).</li><li>Chowdhury, S. R., Djordjevic, J., Albensi, B. C., Fernyhough, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+evaluation+of+substrate-dependent+oxygen+consumption+rates+and+mitochondrial+membrane+potential+by+TMRM+and+safranin+in+cortical+mitochondria.">Simultaneous evaluation of substrate-dependent oxygen consumption rates and mitochondrial membrane potential by TMRM and safranin in cortical mitochondria.</a> Bioscience Reports. 36, e00286 (2015).</li><li>Simonnet, H., Vigneron, A., Pouyss&#233;gur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+Techniques+to+Monitor+Mitochondrial+Oxygen+Consumption.">Conventional Techniques to Monitor Mitochondrial Oxygen Consumption.</a> Methods in Enzymology. 542, 151-161 (2014).</li><li>Mart&#237;nez-Reyes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCA+Cycle+and+Mitochondrial+Membrane+Potential+Are+Necessary+for+Diverse+Biological+Functions.">TCA Cycle and Mitochondrial Membrane Potential Are Necessary for Diverse Biological Functions.</a> Molecular Cell. 61, 199-209 (2016).</li><li>Sukumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Membrane+Potential+Identifies+Cells+with+Enhanced+Stemness+for+Cellular+Therapy.">Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy.</a> Cell Metabolism. 23, 63-76 (2016).</li><li>Wundenberg, T., Grabinski, N., Lin, H., Mayr, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+InsP6-kinases+as+InsP6-dephosphorylating+enzymes+provides+a+new+mechanism+of+cytosolic+InsP6+degradation+driven+by+the+cellular+ATP/ADP+ratio.">Discovery of InsP6-kinases as InsP6-dephosphorylating enzymes provides a new mechanism of cytosolic InsP6 degradation driven by the cellular ATP/ADP ratio.</a> The Biochemical Journal. 462, 173-184 (2014).</li><li>Morciano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+luciferase+probes+to+measure+ATP+in+living+cells+and+animals.">Use of luciferase probes to measure ATP in living cells and animals.</a> Nature Protocols. 12, 1542-1562 (2017).</li><li>Chau, M. D. L., Gao, J., Yang, Q., Wu, Z., Gromada, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+21+regulates+energy+metabolism+by+activating+the+AMPK-SIRT1-PGC-1alpha+pathway.">Fibroblast growth factor 21 regulates energy metabolism by activating the AMPK-SIRT1-PGC-1alpha pathway.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 12553-12558 (2010).</li><li>Lee, K. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+energy+metabolic+and+oncogenic+signaling+pathways+in+triple-negative+breast+cancer+by+a+novel+adenosine+monophosphate-activated+protein+kinase+(AMPK)+activator.">Targeting energy metabolic and oncogenic signaling pathways in triple-negative breast cancer by a novel adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) activator.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286, 39247-39258 (2011).</li><li>Godlewski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-451+Regulates+LKB1/AMPK+Signaling+and+Allows+Adaptation+to+Metabolic+Stress+in+Glioma+Cells.">MicroRNA-451 Regulates LKB1/AMPK Signaling and Allows Adaptation to Metabolic Stress in Glioma Cells.</a> Molecular Cell. 37, 620-632 (2010).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+energy+metabolism+in+cultured+cells,+including+human+pluripotent+stem+cells+and+differentiated+cells.">Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells.</a> Nature Protocols. 7, 1068-1085 (2012).</li><li>Kaplon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+role+for+mitochondrial+gatekeeper+pyruvate+dehydrogenase+in+oncogene-induced+senescence.">A key role for mitochondrial gatekeeper pyruvate dehydrogenase in oncogene-induced senescence.</a> Nature. 498, 109-112 (2013).</li><li>Pardee, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+study+of+the+first-in-class+antimitochondrial+metabolism+agent,+CPI-613,+in+patients+with+advanced+hematologic+malignancies.">A phase I study of the first-in-class antimitochondrial metabolism agent, CPI-613, in patients with advanced hematologic malignancies.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 20, 5255-5264 (2014).</li><li>Stein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defined+metabolic+state+in+pre+B+cells+governs+B-cell+development+and+is+counterbalanced+by+Swiprosin-2/EFhd1.">A defined metabolic state in pre B cells governs B-cell development and is counterbalanced by Swiprosin-2/EFhd1.</a> Cell Death and Differentiation. 24, 1239-1252 (2017).</li><li>Hru&#353;&#225;k, O., Porwit-MacDonald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+expression+patterns+reflecting+genotype+of+acute+leukemias.">Antigen expression patterns reflecting genotype of acute leukemias.</a> Leukemia. 16, 1233-1258 (2002).</li><li>Amin, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Having+a+higher+blast+percentage+in+circulation+than+bone+marrow:+clinical+implications+in+myelodysplastic+syndrome+and+acute+lymphoid+and+myeloid+leukemias.">Having a higher blast percentage in circulation than bone marrow: clinical implications in myelodysplastic syndrome and acute lymphoid and myeloid leukemias.</a> Leukemia. 19, 1567-1572 (2005).</li></ol>

הפרוטוקול המתואר לעיל מאפשר מדידת פעילות חילוף החומרים מוערך על ידי ערכים OCR, ECAR העיקרית בפיצוצים לוקמיה נגזר חולים עם לוקמיה לימפובלסטית חריפה (ALL) או לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML). היתרון של מדידה באמצעות מנתח השטף חוץ-תאית הוא שהם מאפשרים זיהוי פרופיל מטבולי בזמן אמת בתאים חיים. בעיקרו של ?...

פרופיל מטבולי הוא אחד המאפיינים העיקריים של תאים, ביואנרגיה שינו עכשיו נחשבים לאחד גולת הכותרת של סרטן1,2,3. יתר על כן, שינויים בהגדרת מטבולית יכול לשמש לטיפול בסרטן על ידי מיקוד האות התמרה חושית מסלולים או מכונות אנזימטי של סרטן תאים4,5,6. בידיעה חילוף לנטייה של תאים סרטניים ולכן יש יתרון והוא יכול לעזור לשפר את הטיפול הנוכחי.
ישנן הרבה שיטות שכבר פועלת אשר יכול להעריך את הפעילות המטבולית של תאים בתרבות. לגבי גליקוליזה, ספיגת הגלוקוז נמדד על ידי תיוג רדיואקטיבי, באמצעות 2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) או רמת חומצת החלב חוץ-תאית נמדד enzymatically7,8. קצב חמצון חומצות שומן הינו פרמטר נוסף מטבולית נמדדת פלמיתד שכותרתו isotopically9,10. קצב צריכת החמצן היא שיטה נפוץ לקביעת פעילות מיטוכונדריאלי בתאים11,12, יחד עם ממברנה מיטוכונדריאלי פוטנציאליים הערכה13,14, ATP/ADP (אדנוזין יונקות-טריפוספט/אדנוזין יונקות-diphosphate) יחס מידה15 או סך תאיים ATP מידה16. איתות המסלולים הידועים כדי לווסת את תהליכי חילוף החומרים יכול להיקבע על ידי חלבון quantifications, יכול לשפר את ההבנה של מדידות מטבולית17,18,19.
אולם, כל השיטות האלה למדוד רק אחת או, בתרחיש הטוב ביותר, מספר פרמטרים מטבולית אחד לטעום בו זמנית. חשוב, בו זמנית מדידה של קצב צריכת החמצן (OCR) וקצב חוץ-תאית acidification (ECAR) יכולה להיות מושגת על ידי הניתוח השטף חוץ-תאית על ידי, לדוגמה, סוסון ים XFp מנתח. OCR הוא מחוון של הנשימה מיטוכונדריאלי, ECAR היא בעיקר התוצאה של גליקוליזה (אי אפשר להתעלם CO2 הפקה ואולי היא מרוממת ECAR של תאים עם פעילות גבוהה זרחון חמצוני)20. עד כה, סוגי תאים שונים נחקרו באמצעות אלה מנתחי21,22,23.
כאן נתאר הפרוטוקול עבור ניתוח חוץ-תאית השטף של תקיעות הראשי (תאים לוקמיה נגזר מן השלב hematopoietic ילדותי) של חולי לוקמיה. לפי מיטב ידיעתנו, פרוטוקול ספציפי עבור תקיעות הראשי אינו זמין עדיין.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biosera</td>
			<td>FB-1001/100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+) Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8375-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A from Streptomyces sp.</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Base Medium, 100 mL</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103193-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine solution, 200 mM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution, 1 M, pH 7.0-7.6</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE17-1440-02</td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp FluxPak</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103022-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#8482; Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>CB40240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Analyzer XFp</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>S7802A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp Cell Culture Miniplate</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103025-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells

הדרישה המטבולית של תאים סרטניים יכולים להשפיע באופן שלילי על הישרדות, יעילות הטיפול. כיום, פילוח התרופות של מסלולים מטבוליים נבחנה סוגים רבים של גידולים. לפיכך, אפיון של סרטן תאים ההתקנה מטבולית בלתי נמנע כדי למקד את השביל הנכון כדי לשפר את התוצאה הכוללת של חולים. למרבה הצער, ברוב סוגי סרטן, שהתאים הממאירים הם די קשה להשיג במספרים גבוהים יותר, נדרשת ביופסיה רקמות. לוקמיה היא יוצאת דופן, שבו מספר מספיק של תאים לוקמיה ניתן לבודד ממח העצם. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט בידודו של תאים לוקמיה במח העצם חולי לוקמיה וניתוח הבאים של מצב מטבולי שלהם באמצעות מנתח השטף חוץ-תאית. תאים לוקמיה מבודדות על-ידי מעבר הצבע צפיפות, אשר אינה משפיעה על יכולת הקיום שלהם. השלב הבא בטיפוח מסייעת להם להתחדש, ובכך המדינה מטבולית נמדד מצבו של תאים בתנאים אופטימליים. פרוטוקול זה מאפשר בהשגת תוצאות עקביות, מתוקננת היטב, אשר יכול לשמש עבור הטיפול אישית.

איור 3 מראה את העקומות לאחר בדיקת המאמץ גליקוליזה ומדידות בדיקת המאמץ תא Mito ותקיעה לוקמיה BCP-כל (B-cell קודמן לוקמיה לימפובלסטית חריפה), חולים AML (לוקמיה מיאלואידית חריפה). חישוב פרמטרים מטבולית של מדידות אלה גם מצוינת. תאים 500,000 לכל טוב היו נזרע, כל המדידות נעש?...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells at JoVE.com

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

כאן אנו מציגים פרוטוקול בידודו של תאים לוקמיה במח העצם חולי לוקמיה וניתוח של מדינתם מטבולית. הערכה של פרופיל מטבולי של תאי סרטן ראשוני יכול לעזור כדי לאפיין טוב יותר את הביקוש של ראשי תאים, עלול להוביל רפואה אישית יותר.

הערכה של פרופיל מטבולי של תאי סרטן ראשוני

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי הגדרת מסלול מטבולי בתאי לוקמיה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת מדידה של חילוף החומרים של תאי לוקמיה ראשוניים בזמן אמת בתאים חיים. התחל בדילול דגימת מח עצם המתקבלת מחולה לוקמיה ב- PBS ביחס של אחד לאחד.בזהירות, שכבה שישה מיליליטר של דגימת מח עצם מדוללת מעל שישה מיליליטר של מדיום שיפוע צפיפות מוכן טרי בצינור חרוט 15 מיליליטר ולהפריד את התאים על ידי צנטריפוגה הדרגתית צפיפות. השתמש צינור פסטר להעביר בזהירות את שכבת הממשק של תאים mononuclear לצינור חרוט חדש 50 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של PBS עבור לשטוף צנטריפוגה. לאחר מכן, תן שימוש חוזר את גלולת התא המונונוקלארי בשני מיליליטר של PBS סטרילי לספירה.לדלל את התאים לשלוש פעמים 10 לשבעה תאים לריכוז מיליליטר. ולהוסיף מיליליטר אחד של תאים לכל אחד משני flasks T75 המכיל 20 מיליליטר של מדיום RPMI עבור דגירה 16 עד 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2. בינתיים כדי להכין את הצלחות לניתוח שטף חוץ תאי, להוסיף 12.5 microliters של פתרון דבק התא לתוך כל באר של שניים, שמונה גם צלחות מנתח שטף חוץ תאיים.לאחר 20 דקות, שאפו את דבק התא ושטפו כל באר פעמיים עם 200 מיקרוליטרים של מים סטריליים לכל שטיפה. לאחר הכביסה השנייה, משאירים את הצלחות במכסה המנוע עד שה בארות יבשות. ות מניחים את מחסנית החיישנים הפוכה על ספסל המעבדה.הפרד את לוחית השירות ואת מחסנית החיישן של מנתח השטף. ולמלא כל באר של צלחת השירות עם 200 microliters של כיול וכל חייט סביב החלק החיצוני של בארות עם 400 microliters של כיול. החזירו את מחסנית החיישן לצלחת השירות המכילה כעת את הכיול והצבו את מכלול המחסנית באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס ללא CO2 למשך הלילה.ואז להפעיל את מנתח שטף חוץ תאי ולתת לו חם ל 37 מעלות צלזיוס לילה. למחרת בבוקר, להעביר את התאים מהבקבוק ל50 צינורות חרוט מיליליטר לצנטריפוגה. ולתלות מחדש את כדורי במיליליטר אחד של המדיום הניסיוני המתאים לספירה.תן שימוש חוזר בתאים במהירות של פי 4 מ-10 לששת התאים ב-400 מיקרוליטרים של ריכוז בינוני ניסיוני. ולהוסיף 50 microliters של תאים לתוך בארות B דרך G של צלחת מנתח שטף. ו-180 מיקרוליטרים של המדיום הניסיוני לתוך בארות A ו-H כ בארות בקרת הרקע.לאחר צנטריפוגה לאט ובזהירות להוסיף 130 microliters של המדיום הניסיוני בארות B דרך G.ו חזותית לאשר דבקות יציבה של התאים לתחתית של כל באר מתחת למיקרוסקופ. ואז להחזיר את צלחת ניתוח שטף לח 37 מעלות צלזיוס אינקובטור ללא CO2 במשך 30 דקות. 20 דקות לפני סוף הדגירה, לטעון את התרכובות לתוך יציאות מזרק המתאים של המחסנית על פי פרוטוקול הניסוי כפי שצוין בטבלה.לאחר מכן הגדר את תוכנית ניתוח השטף החוץ-תאית המתאימה. הפעל את התוכנית והחלף את לוח הכיול בצלחת ההתבקש כאשר תתבקש לעשות זאת. במבחן מאמץ גליקוליזה, רק מדיום בסיסי משמש כך התאים נמנעים חומרים מזינים.הפרמטר הראשון המתקבל הוא חומציות בזלית אשר אמור לשקף את כמות הגלוקוז המאוחסנת בתאים. לאחר הזריקה הראשונה, קצב החומציות החוץ תאית גדל ככל שהתאים מנצלים את הגלוקוז יכולים לתסיס את הגלוקוז ללקטאט. האוליגומיצין A בזריקה השנייה מעכב סינתאז ATP ובכך מנחה את התאים לייצר ATP בעיקר על ידי גליקוליזה הגורמת לעלייה נוספת של קצב החומציות החוץ תאית.בעוד הזרקת 2-Deoxy-D-גלוקוז מעכב לחלוטין גליקוליזה ואת שיעור חומציות חוץ תאית יורד. במבחן הלחץ של מיטו התא, מדיום בתוספת גלוטמין וגלוקוז משמש כך התאים אינם משוללים את כל החומרים המזינים. פרמטר הנשימה הבסיסית משקף את מצב חילוף החומרים הבסיסי שלהם.לאחר הזריקה הראשונה עם אוליגומיצין A, התאים מעכבים נשימה מיטוכונדרית ועוקבים לגליקוליזה המיוצגת כירידה בקצב צריכת החמצן. הזריקות השניה והשלישית של FCCP עם זאת, uncouple ייצור ATP מן הנשימה, כך התאים צורכים כעת חמצן בקצב מקסימלי. וקצב צריכת החמצן עולה לערך הגבוה ביותר שלו.הזריקה האחרונה של רוטנון ואנטימיצין תערובת מעכבת לחלוטין את הנשימה המיטוכונדרית ומפחיתה את קצב צריכת החמצן לכמעט אפס. בעת ניסיון הליך זה, חשוב להעריך את אחוז הפיצוצים המדגם כדי להבטיח כי הפרמטרים המטבוליים של לוקמיה רק נמדדים. בעת יישום שיטה זו, יש להחיל מיטוב זהיר על תנאי טיפוח ונורמליזציה של נתונים.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

פרוטוקול מפורט לאפיון לקו הסלולרי Murine C1498 דגם Associated לוקמיה העכבר שלה

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

הכנה ואת וזמינותו מטבולית של תרבויות המשנה ספרואיד תלת-ממדי של תאי סרטן הלבלב ו Fibroblasts

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

הכנה של תאים לוקמיה לימפובלסטית חריפה העיקרית בשלבים שונים של מחזור התא על ידי צנטריפוגלי Elutriation

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flow Cytometry להעריך לוקמיה תאי גזע ראשי לוקמיה מיאלואידית חריפה, החולה-נגזר-xenografts, אבחון, מעקב.

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Rapid Generation of Primary Murine Melanocyte and Fibroblast Cultures

הדור המהיר של משפחת מלנוציט הראשית והתרבויות בפיברובלסט

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

הזרמת כדוריות הדם של מיני חמצן מיטוכונדריאלי מורטין בגזע ובתאי מחולל ולוקמיה מונחה AF9

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

שבירה משנית של תאים לוקמיה לימפוציטית כרונית ראשונית לניטור גרעיני/Cytoplasmic סחר בחלבונים

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

שתי גישות ציטומטריות זרימה של גילוי משטח ליגנד NKG2D כדי להבחין בין תאי גזע לבין תת אוכלוסין בתפזורת בלוקמיה מיאלואידית חריפה

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

השתלה תוך צפקית ליצירת לוקמיה מיאלואידית חריפה בעכברים

There is an unmet need for novel therapies to treat acute myeloid leukemia (AML) and the associated relapse that involves persistent leukemia stem cells ...

Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model

הערכה של רעילות הקשורה לקולטן אנטיגן כימרי T באמצעות מודל עכבר קסנוגרפט שמקורו בלוקמיה לימפובלסטית חריפה

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy has emerged as a powerful tool for the treatment of multiple types of CD19+ malignancies, which has led to ...