Name: assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells
Uploaded: 2018-11-21T13:00:00
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우리는 체코 소아 혈액학 센터 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 내가 nr 부여의 사역의 건강 (NV15-28848A), 보건 및 교육, 청소년 및 스포츠 NPU 대학 병원 Motol, 체코 공화국, 프라하, 체코 공화국 00064203에 의해에서 지원. LO1604입니다.

모든 샘플 어린이 부모 또는 보호자의 informed consent와 찰스 대학에서 프라하, 체코 공화국, 연구 윤리 위원회의 승인을 얻어 졌다 아니. NV15-28848A입니다.
1입니다. 시 약의 준비
<ol><li>137 mM NaCl, 2.7 m m KCl, 4.3 m m 나2HPO4, 1.47 m m KH2포4, ddH2HCl Sterilize와 O. 조절 pH 7.4에 압력가 마로 소독 하 여 용 해 하 여 PBS의 500 mL를 준비 합니다.</li>
	<li>100ml ...

<ol>
	<li>DeBerardinis, R. J., Lum, J. J., Hatzivassiliou, G., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biology+of+Cancer:+Metabolic+Reprogramming+Fuels+Cell+Growth+and+Proliferation.">The Biology of Cancer: Metabolic Reprogramming Fuels Cell Growth and Proliferation.</a> Cell Metabolism. 7, 11-20 (2008).</li><li>Ward, P. S., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Reprogramming:+A+Cancer+Hallmark+Even+Warburg+Did+Not+Anticipate.">Metabolic Reprogramming: A Cancer Hallmark Even Warburg Did Not Anticipate.</a> Cancer Cell. 21, 297-308 (2012).</li><li>Pavlova, N. N., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Emerging+Hallmarks+of+Cancer+Metabolism.">The Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism.</a> Cell Metabolism. 23, 27-47 (2016).</li><li>Wise, D. R., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+addiction:+a+new+therapeutic+target+in+cancer.">Glutamine addiction: a new therapeutic target in cancer.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35, 427-433 (2010).</li><li>Kroemer, G., Pouyssegur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Cell+Metabolism:+Cancer's+Achilles'+Heel.">Tumor Cell Metabolism: Cancer's Achilles' Heel.</a> Cancer Cell. 13, 472-482 (2008).</li><li>Liberti, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Predictive+Model+for+Selective+Targeting+of+the+Warburg+Effect+through+GAPDH+Inhibition+with+a+Natural+Product.">A Predictive Model for Selective Targeting of the Warburg Effect through GAPDH Inhibition with a Natural Product.</a> Cell Metabolism. 26, 648-659 (2017).</li><li>Lundgaard, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+neuronal+glucose+uptake+heralds+activity-dependent+increases+in+cerebral+metabolism.">Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism.</a> Nature Communications. 6, 6807 (2015).</li><li>Hermanova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+inhibition+of+fatty-acid+oxidation+synergistically+enhances+the+effect+of+l-asparaginase+in+childhood+ALL+cells.">Pharmacological inhibition of fatty-acid oxidation synergistically enhances the effect of l-asparaginase in childhood ALL cells.</a> Leukemia. 30, 209-218 (2016).</li><li>Malandrino, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+fatty+acid+oxidation+in+adipocytes+and+macrophages+reduces+lipid-induced+triglyceride+accumulation+and+inflammation.">Enhanced fatty acid oxidation in adipocytes and macrophages reduces lipid-induced triglyceride accumulation and inflammation.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308, E756-E769 (2015).</li><li>Patella, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics-based+metabolic+modeling+reveals+that+fatty+acid+oxidation+(FAO)+controls+endothelial+cell+(EC)+permeability.">Proteomics-based metabolic modeling reveals that fatty acid oxidation (FAO) controls endothelial cell (EC) permeability.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics: MCP. 14, 621-634 (2015).</li><li>Chowdhury, S. R., Djordjevic, J., Albensi, B. C., Fernyhough, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+evaluation+of+substrate-dependent+oxygen+consumption+rates+and+mitochondrial+membrane+potential+by+TMRM+and+safranin+in+cortical+mitochondria.">Simultaneous evaluation of substrate-dependent oxygen consumption rates and mitochondrial membrane potential by TMRM and safranin in cortical mitochondria.</a> Bioscience Reports. 36, e00286 (2015).</li><li>Simonnet, H., Vigneron, A., Pouyss&#233;gur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+Techniques+to+Monitor+Mitochondrial+Oxygen+Consumption.">Conventional Techniques to Monitor Mitochondrial Oxygen Consumption.</a> Methods in Enzymology. 542, 151-161 (2014).</li><li>Mart&#237;nez-Reyes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCA+Cycle+and+Mitochondrial+Membrane+Potential+Are+Necessary+for+Diverse+Biological+Functions.">TCA Cycle and Mitochondrial Membrane Potential Are Necessary for Diverse Biological Functions.</a> Molecular Cell. 61, 199-209 (2016).</li><li>Sukumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Membrane+Potential+Identifies+Cells+with+Enhanced+Stemness+for+Cellular+Therapy.">Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy.</a> Cell Metabolism. 23, 63-76 (2016).</li><li>Wundenberg, T., Grabinski, N., Lin, H., Mayr, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+InsP6-kinases+as+InsP6-dephosphorylating+enzymes+provides+a+new+mechanism+of+cytosolic+InsP6+degradation+driven+by+the+cellular+ATP/ADP+ratio.">Discovery of InsP6-kinases as InsP6-dephosphorylating enzymes provides a new mechanism of cytosolic InsP6 degradation driven by the cellular ATP/ADP ratio.</a> The Biochemical Journal. 462, 173-184 (2014).</li><li>Morciano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+luciferase+probes+to+measure+ATP+in+living+cells+and+animals.">Use of luciferase probes to measure ATP in living cells and animals.</a> Nature Protocols. 12, 1542-1562 (2017).</li><li>Chau, M. D. L., Gao, J., Yang, Q., Wu, Z., Gromada, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+21+regulates+energy+metabolism+by+activating+the+AMPK-SIRT1-PGC-1alpha+pathway.">Fibroblast growth factor 21 regulates energy metabolism by activating the AMPK-SIRT1-PGC-1alpha pathway.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 12553-12558 (2010).</li><li>Lee, K. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+energy+metabolic+and+oncogenic+signaling+pathways+in+triple-negative+breast+cancer+by+a+novel+adenosine+monophosphate-activated+protein+kinase+(AMPK)+activator.">Targeting energy metabolic and oncogenic signaling pathways in triple-negative breast cancer by a novel adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) activator.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286, 39247-39258 (2011).</li><li>Godlewski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-451+Regulates+LKB1/AMPK+Signaling+and+Allows+Adaptation+to+Metabolic+Stress+in+Glioma+Cells.">MicroRNA-451 Regulates LKB1/AMPK Signaling and Allows Adaptation to Metabolic Stress in Glioma Cells.</a> Molecular Cell. 37, 620-632 (2010).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+energy+metabolism+in+cultured+cells,+including+human+pluripotent+stem+cells+and+differentiated+cells.">Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells.</a> Nature Protocols. 7, 1068-1085 (2012).</li><li>Kaplon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+role+for+mitochondrial+gatekeeper+pyruvate+dehydrogenase+in+oncogene-induced+senescence.">A key role for mitochondrial gatekeeper pyruvate dehydrogenase in oncogene-induced senescence.</a> Nature. 498, 109-112 (2013).</li><li>Pardee, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+study+of+the+first-in-class+antimitochondrial+metabolism+agent,+CPI-613,+in+patients+with+advanced+hematologic+malignancies.">A phase I study of the first-in-class antimitochondrial metabolism agent, CPI-613, in patients with advanced hematologic malignancies.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 20, 5255-5264 (2014).</li><li>Stein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defined+metabolic+state+in+pre+B+cells+governs+B-cell+development+and+is+counterbalanced+by+Swiprosin-2/EFhd1.">A defined metabolic state in pre B cells governs B-cell development and is counterbalanced by Swiprosin-2/EFhd1.</a> Cell Death and Differentiation. 24, 1239-1252 (2017).</li><li>Hru&#353;&#225;k, O., Porwit-MacDonald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+expression+patterns+reflecting+genotype+of+acute+leukemias.">Antigen expression patterns reflecting genotype of acute leukemias.</a> Leukemia. 16, 1233-1258 (2002).</li><li>Amin, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Having+a+higher+blast+percentage+in+circulation+than+bone+marrow:+clinical+implications+in+myelodysplastic+syndrome+and+acute+lymphoid+and+myeloid+leukemias.">Having a higher blast percentage in circulation than bone marrow: clinical implications in myelodysplastic syndrome and acute lymphoid and myeloid leukemias.</a> Leukemia. 19, 1567-1572 (2005).</li></ol>

(모두) 급성 림프 구성 백혈병 환자에서 파생 하는 기본 leukemic 돌풍에 OCR 및 ECAR 값으로 평가 하는 신진 대사 활동의 측정에 대 한 상기 설명 된 프로토콜 허용 또는 급성 골수성 백혈병 (AML). 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 측정의 장점은 실시간으로 살아있는 세포에서 대사 프로 파일의 검색 수 있습니다. 기본적으로 제공 된 프로토콜에서 모든 단계 하나 공부 계획 셀 유형에 따라 조정 될 수 ?...

신진 대사 프로필 셀의 주요 특징 중 하나 이며 변경 된 생체는 지금 암1,2,3의 특징 중 하나를 간주 됩니다. 또한, 신진 대사 설치에 변경 신호 변환 통로 또는 암 세포4,,56의 효소 기계 장치를 대상으로 암 치료에 사용 될 수 있습니다. 암 세포의 변화 경향을 알고 따라서 이점을 이며 현재 치료를 향상 시킬 수 있습니다.
문화에 있는 세포의 대사 활동을 평가할 수 있는 이미 설정 된 방법의 많음이 있다. 분해에 대하여 포도 당 통풍 관 측정 될 수 있다 방사성 라벨 2-NBDG를 사용 하 여 (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) 또는 extracellular 젖 산 수준 측정 효소7,8. 지방산 산화 속도 isotopically 레이블된 물9,10에 의해 측정 하는 또 다른 대사 매개 변수입니다. 산소 소비 속도 셀11,12, 미토 콘 드리 아 막 잠재적인 평가13,14, ATP/ADP (아데노신 함께 미토 콘 드리 아 활동을 결정 하는 데 널리 사용 되는 방법 5 '-3 인산 염/아데노신 5 '-diphosphate) 비율 측정15 또는 총 세포내 ATP 측정16. 알려진 대사 과정을 조절 하는 통로 신호 단백질 quantifications에 의해 결정 될 수 있었다 고 대사 측정17,,1819의 이해를 향상 시킬 수 있습니다.
그러나, 이러한 모든 방법을 하나만 측정 또는, 최고의 시나리오 하나에 몇 가지 변화 매개 변수는 동시에 샘플. 중요 한 것은, 산소 소비 속도 (OCR) 및 세포 외 산성화 속도 (ECAR)의 동시 측정, 예를 들어 해 마 XFp 분석기에 의해 세포 외 유출 분석에 의해 얻을 수 있습니다. OCR은 미토 콘 드리 아 호흡 ECAR 이며 주로 분해 (우리는 CO2 생산 가능성이 높은 산화 인 산화 활동 ECAR 셀의 높이 무시할 수 없는)의 결과20. 지금까지, 다양 한 세포 유형 사용이 분석기21,,2223공부 되었습니다.
여기 우리는 백혈병 환자에서 주요 폭발 (미 숙 조 혈 단계에서 파생 된 백혈병 세포)의 세포 외 유출 분석에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 지식 최선을 주 폭발에 대 한 특정 프로토콜 사용할 아직 아니에요.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biosera</td>
			<td>FB-1001/100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+) Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8375-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A from Streptomyces sp.</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Base Medium, 100 mL</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103193-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine solution, 200 mM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution, 1 M, pH 7.0-7.6</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE17-1440-02</td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp FluxPak</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103022-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#8482; Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>CB40240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Analyzer XFp</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>S7802A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp Cell Culture Miniplate</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103025-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells

암 세포의 대사 요구 부정적인 생존 및 치료 효능에 영향을 미칠 수 있습니다. 요즘, 변화 통로의 제약을 대상으로 다양 한 종양에서에서 테스트 됩니다. 따라서, 암 세포 대사 설치의 대상 환자의 전반적인 결과 개선 하기 위해 올바른 경로 위해 불가피 하다. 불행 하 게도, 암의 대다수에서 악성 세포가 더 높은 숫자를 매우 어려운 및 조직 생 검 필요 합니다. 백혈병은 예외, 어디 leukemic 세포의 충분 한 수 골에서 격리 될 수 있습니다. 여기, 우리는 leukemic 세포 백혈병 환자 골 수에서 분리 및 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 그들의 대사 상태의 이후 분석에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. Leukemic 세포는 그들의 생존에는 영향을 미치지 않습니다 밀도 그라데이션에 의해 격리 됩니다. 다음 재배 단계 재생성 하 그들을 도와, 따라서 대사 상태 측정은 최적의 조건에서 셀의 상태. 이 프로토콜은 개인된 치료에 사용 될 수 있는 일관 된, 잘 표준화 된 결과 달성 수 있습니다.

그림 3 BCP-모든 (B 세포 선구자 급성 림프 구성 백혈병)과 급성 골수성 백혈병 (급성 골수성 백혈병) 환자에서 분해 스트레스 테스트 및 leukemic 돌풍의 셀 미토 스트레스 테스트 측정 후 곡선을 보여준다. 이 측정에서 대사 매개 변수 계산도 표시 됩니다. 잘 당 500000 셀 시드 했다 그리고 모든 측정 hexaplicates에서 수행 했다.
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Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

여기 선물이 leukemic 세포 백혈병 환자 골 수에서 격리 및 그들의 대사 상태 분석을 위한 프로토콜. 기본 백혈병 세포의 신진 대사 프로필의 평가 1 차 셀의 수요 특성을 더 나은 하는 데 도움이 수 그리고 더 맞춤된 의학까지 이어질 수 있습니다.

기본 백혈병 세포의 신진 대사 프로필의 평가

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

이 방법은 백혈병 세포에 있는 신진 대사 통로 설치에 관하여 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 살아있는 세포에서 실시간으로 1 차 백혈병 세포의 물질 대사를 측정할 수 있다는 것입니다. PBS에 있는 백혈병 환자에게서 얻은 골수 견본을 1 대 1 비율로 희석하는 것으로 시작합니다.신중하게, 15 밀리리터 원추형 튜브에서 갓 준비된 밀도 그라데이션 배지의 6밀리리터 위에 희석된 골수 샘플의 6밀리리터를 층으로 적층하고 밀도 그라데이션 원심분리에 의해 세포를 분리한다. 파스퇴르 파이펫을 사용하여 단일 핵 세포의 인터페이스 층을 원심 분리 세척을 위해 PBS 5 밀리리터를 포함하는 새로운 50 밀리리터 원전 튜브로 조심스럽게 전송합니다. 이어서, 단일핵 세포 펠릿을 계산용 멸균 PBS의 2밀리리터로 재중단한다.밀리리터 농도당 7개의 세포에 세포를 3배 10으로 희석시. 그리고 37섭씨 37도및 5%CO2에서 16~24시간 배양에 대해 RPMI 배지 20밀리리터를 함유한 2개의 T75 플라스크 각각에 1밀리리터의 세포를 추가합니다. 한편 세포 외 플럭스 분석을 위해 플레이트를 준비하기 위해 세포 접착제 용액 12.5 마이크로리터를 각각 2개, 8개의 잘 세포외 플럭스 분석기 플레이트에 추가합니다.20 분 후, 세포 접착제를 흡착하고 세척 당 멸균 물 200 마이크로 리터로 각각 두 번 잘 씻습니다. 두 번째 세척 후, 우물이 건조 할 때까지 후드에 접시를 둡니다. 그리고 센서 카트리지를 실험실 벤치에 거꾸로 놓습니다.플럭스 분석기의 유틸리티 플레이트와 센서 카트리지를 분리합니다. 그리고 200 마이크로리터의 교정제와 각 해자 400 마이크로리터의 교정판으로 유틸리티 플레이트의 각 우물을 채웁니다. 센서 카트리지를 교정판이 들어 있는 유틸리티 플레이트로 되돌리고 밤새 CO2 없이 가습된 섭씨 37도 인큐베이터에 카트리지 어셈블리를 배치합니다.그런 다음 세포 외 플럭스 분석기를 켜고 밤새 섭씨 37도까지 따뜻하게 하십시오. 다음 날 아침, 원심 분리를 위해 플라스크에서 50 밀리리터 원추형 튜브로 세포를 옮긴다. 그리고 계산에 적합한 실험 매체의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단한다.실험적인 중간 농도의 400 마이크로리터에서 6개의 세포에 4회 10에서 세포를 재중단합니다. 그리고 플럭스 분석기 플레이트의 G를 통해 50 마이크로리터의 셀 B에 첨가한다. 그리고 180 마이크로리터의 실험 매체를 우물 A와 H로 배경 제어 우물로 한다.원심분리 후 천천히 조심스럽게 G.를 통해 B에 실험 배지의 130 마이크로리터를 첨가하고 현미경하에서 각각의 바닥에 세포의 안정적인 준수를 시각적으로 확인한다. 그런 다음 30 분 동안 CO2없이 가습 섭씨 37도 인큐베이터에 플럭스 분석 플레이트를 반환합니다. 인큐베이션이 끝나기 20분 전에, 테이블에 표시된 실험 프로토콜에 따라 카트리지의 적절한 인젝터 포트에 화합물을 적재한다.그런 다음 적절한 세포 외 형플럭스 분석 프로그램을 설정합니다. 프롬프트시 프로그램을 시작하고 교정판을 분석판으로 교체합니다. 글리코리시스 스트레스 테스트에서는 세포가 영양소를 박탈당할 수 있도록 기저 배지만 사용됩니다.얻어진 첫번째 파라미터는 세포에 저장된 포도당의 양을 반영해야 하는 기저산성화이다. 첫 번째 주사 후, 세포가 포도당을 이용함에 따라 세포 외산성화율이 증가하고 젖산에 포도당을 발효시킬 수 있다. 제2 주사에서 올리고마이신 A는 ATP 시차스를 억제하고 따라서 세포 외 산성화 속도의 추가 상승을 일으키는 글리코리시스에 의해 주로 ATP를 생산하도록 세포를 지시한다.2-Deoxy-D-포도당의 주입은 완전히 글리코분해및 세포외 산성화 속도 저하를 억제하는 동안. 세포 미토 스트레스 테스트에서 글루타민과 포도당으로 보충된 배지가 사용되어 세포가 모든 영양소를 박탈당하지 않도록 합니다. 기저 호흡 매개 변수는 기저 대사 상태를 반영합니다.올리고마이신 A를 가진 첫번째 주입 후에, 세포는 미토콘드리아 호흡을 억제하고 산소 소비속도의 감소로 표현되는 글리코리솔로 전환합니다. 그러나 FCCP의 두 번째 및 세 번째 주사는 ATP 생산을 호흡으로부터 분리하여 세포가 이제 최대 속도로 산소를 소비합니다. 그리고 산소 소비율은 가장 높은 값으로 상승합니다.로테네와 항마이신 A 혼합물의 마지막 주사는 미토콘드리아 호흡을 완전히 억제하여 산소 소비속도를 거의 0으로 감소시킵니다. 이 절차를 시도하는 동안, 백혈병 폭발의 대사 매개 변수만 측정되도록 샘플에서 폭발의 비율을 평가하는 것이 중요합니다. 이 방법을 구현할 때 재배 조건 및 데이터 정규화에 신중한 최적화를 적용해야 합니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

쥐 C1498 세포주와 관련 백혈병 마우스 모델을 특성화에 대한 자세한 프로토콜

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

연구

암 연구학

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

준비 및 췌장암 세포 및 섬유 아 세포의 3 차원 회전 타원 체 공동 문화의 변화 분석 결과

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

원심 Elutriation에 의해 다른 세포 주기 단계에서 기본 급성 림프 구성 백혈병 세포의 준비

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flow Cytometry 최대 백혈병 줄기 세포 주 급성 골수성 백혈병 및 환자-파생-xenografts, 진단에 따라 추정 하

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Rapid Generation of Primary Murine Melanocyte and Fibroblast Cultures

1 차적인 뮤린 멜라닌세포 및 섬유아세포 배양물의 급속한 생성

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

뮤린 조혈 줄기 및 선조 세포 및 MLL-AF9 구동 백혈병에서 미토콘드리아 반응성 산소 종의 유동 세포 분석

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

핵/세포질 단백질 인신 매매를 모니터링하기 위한 1차 만성 림프구성 백혈병 세포의 세포 분열

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

급성 골수성 백혈병의 대량 하위 집단으로부터 줄기 세포를 구별하기 위해 NKG2D 리간드 표면 검출의 두 개의 흐름 세포 측정 접근법

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

생쥐에서 급성 골수성 백혈병을 발생시키기 위한 복강내 이식

There is an unmet need for novel therapies to treat acute myeloid leukemia (AML) and the associated relapse that involves persistent leukemia stem cells ...

Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model

급성 림프구성 백혈병 환자 유래 이종이식식 마우스 모델을 이용한 키메라 항원 수용체 T 세포 관련 독성 평가

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy has emerged as a powerful tool for the treatment of multiple types of CD19+ malignancies, which has led to ...