Name: assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells
Uploaded: 2018-11-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells at JoVE.com

Vi ønsker å takke den tsjekkiske Pediatric hematologi sentre. Dette arbeidet var støttet av Grant av Helsedepartementet (NV15-28848A), av Helsedepartementet av Tsjekkia, University Hospital Motol, Prague, Tsjekkia 00064203 og departementet for utdanning, ungdom og sport NPU jeg nr. LO1604.

Alle prøver ble oppnådd med informed consent av barnas foreldre eller foresatte og godkjenning av etiske Charles University i Praha, Tsjekkia, studien ingen. NV15-28848A.
1. forberedelse av reagenser
<ol><li>Klargjør 500 mL PBS ved oppløsning 137 mM NaCl 2.7 mM KCl 4.3 mM Na2HPO4, 1,47 mM KH2PO4, i ddH2O. justere pH 7,4 med HCl. Sterilize av autoklavering.</li>
	<li>Forberede 100 mL RPMI medium: RPMI-1640 medium med L-Alanyl-glutamin...

<ol>
	<li>DeBerardinis, R. J., Lum, J. J., Hatzivassiliou, G., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biology+of+Cancer:+Metabolic+Reprogramming+Fuels+Cell+Growth+and+Proliferation.">The Biology of Cancer: Metabolic Reprogramming Fuels Cell Growth and Proliferation.</a> Cell Metabolism. 7, 11-20 (2008).</li><li>Ward, P. S., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Reprogramming:+A+Cancer+Hallmark+Even+Warburg+Did+Not+Anticipate.">Metabolic Reprogramming: A Cancer Hallmark Even Warburg Did Not Anticipate.</a> Cancer Cell. 21, 297-308 (2012).</li><li>Pavlova, N. N., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Emerging+Hallmarks+of+Cancer+Metabolism.">The Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism.</a> Cell Metabolism. 23, 27-47 (2016).</li><li>Wise, D. R., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+addiction:+a+new+therapeutic+target+in+cancer.">Glutamine addiction: a new therapeutic target in cancer.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35, 427-433 (2010).</li><li>Kroemer, G., Pouyssegur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Cell+Metabolism:+Cancer's+Achilles'+Heel.">Tumor Cell Metabolism: Cancer's Achilles' Heel.</a> Cancer Cell. 13, 472-482 (2008).</li><li>Liberti, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Predictive+Model+for+Selective+Targeting+of+the+Warburg+Effect+through+GAPDH+Inhibition+with+a+Natural+Product.">A Predictive Model for Selective Targeting of the Warburg Effect through GAPDH Inhibition with a Natural Product.</a> Cell Metabolism. 26, 648-659 (2017).</li><li>Lundgaard, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+neuronal+glucose+uptake+heralds+activity-dependent+increases+in+cerebral+metabolism.">Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism.</a> Nature Communications. 6, 6807 (2015).</li><li>Hermanova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+inhibition+of+fatty-acid+oxidation+synergistically+enhances+the+effect+of+l-asparaginase+in+childhood+ALL+cells.">Pharmacological inhibition of fatty-acid oxidation synergistically enhances the effect of l-asparaginase in childhood ALL cells.</a> Leukemia. 30, 209-218 (2016).</li><li>Malandrino, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+fatty+acid+oxidation+in+adipocytes+and+macrophages+reduces+lipid-induced+triglyceride+accumulation+and+inflammation.">Enhanced fatty acid oxidation in adipocytes and macrophages reduces lipid-induced triglyceride accumulation and inflammation.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308, E756-E769 (2015).</li><li>Patella, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics-based+metabolic+modeling+reveals+that+fatty+acid+oxidation+(FAO)+controls+endothelial+cell+(EC)+permeability.">Proteomics-based metabolic modeling reveals that fatty acid oxidation (FAO) controls endothelial cell (EC) permeability.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics: MCP. 14, 621-634 (2015).</li><li>Chowdhury, S. R., Djordjevic, J., Albensi, B. C., Fernyhough, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+evaluation+of+substrate-dependent+oxygen+consumption+rates+and+mitochondrial+membrane+potential+by+TMRM+and+safranin+in+cortical+mitochondria.">Simultaneous evaluation of substrate-dependent oxygen consumption rates and mitochondrial membrane potential by TMRM and safranin in cortical mitochondria.</a> Bioscience Reports. 36, e00286 (2015).</li><li>Simonnet, H., Vigneron, A., Pouyss&#233;gur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+Techniques+to+Monitor+Mitochondrial+Oxygen+Consumption.">Conventional Techniques to Monitor Mitochondrial Oxygen Consumption.</a> Methods in Enzymology. 542, 151-161 (2014).</li><li>Mart&#237;nez-Reyes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCA+Cycle+and+Mitochondrial+Membrane+Potential+Are+Necessary+for+Diverse+Biological+Functions.">TCA Cycle and Mitochondrial Membrane Potential Are Necessary for Diverse Biological Functions.</a> Molecular Cell. 61, 199-209 (2016).</li><li>Sukumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Membrane+Potential+Identifies+Cells+with+Enhanced+Stemness+for+Cellular+Therapy.">Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy.</a> Cell Metabolism. 23, 63-76 (2016).</li><li>Wundenberg, T., Grabinski, N., Lin, H., Mayr, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+InsP6-kinases+as+InsP6-dephosphorylating+enzymes+provides+a+new+mechanism+of+cytosolic+InsP6+degradation+driven+by+the+cellular+ATP/ADP+ratio.">Discovery of InsP6-kinases as InsP6-dephosphorylating enzymes provides a new mechanism of cytosolic InsP6 degradation driven by the cellular ATP/ADP ratio.</a> The Biochemical Journal. 462, 173-184 (2014).</li><li>Morciano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+luciferase+probes+to+measure+ATP+in+living+cells+and+animals.">Use of luciferase probes to measure ATP in living cells and animals.</a> Nature Protocols. 12, 1542-1562 (2017).</li><li>Chau, M. D. L., Gao, J., Yang, Q., Wu, Z., Gromada, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+21+regulates+energy+metabolism+by+activating+the+AMPK-SIRT1-PGC-1alpha+pathway.">Fibroblast growth factor 21 regulates energy metabolism by activating the AMPK-SIRT1-PGC-1alpha pathway.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 12553-12558 (2010).</li><li>Lee, K. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+energy+metabolic+and+oncogenic+signaling+pathways+in+triple-negative+breast+cancer+by+a+novel+adenosine+monophosphate-activated+protein+kinase+(AMPK)+activator.">Targeting energy metabolic and oncogenic signaling pathways in triple-negative breast cancer by a novel adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) activator.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286, 39247-39258 (2011).</li><li>Godlewski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-451+Regulates+LKB1/AMPK+Signaling+and+Allows+Adaptation+to+Metabolic+Stress+in+Glioma+Cells.">MicroRNA-451 Regulates LKB1/AMPK Signaling and Allows Adaptation to Metabolic Stress in Glioma Cells.</a> Molecular Cell. 37, 620-632 (2010).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+energy+metabolism+in+cultured+cells,+including+human+pluripotent+stem+cells+and+differentiated+cells.">Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells.</a> Nature Protocols. 7, 1068-1085 (2012).</li><li>Kaplon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+role+for+mitochondrial+gatekeeper+pyruvate+dehydrogenase+in+oncogene-induced+senescence.">A key role for mitochondrial gatekeeper pyruvate dehydrogenase in oncogene-induced senescence.</a> Nature. 498, 109-112 (2013).</li><li>Pardee, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+study+of+the+first-in-class+antimitochondrial+metabolism+agent,+CPI-613,+in+patients+with+advanced+hematologic+malignancies.">A phase I study of the first-in-class antimitochondrial metabolism agent, CPI-613, in patients with advanced hematologic malignancies.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 20, 5255-5264 (2014).</li><li>Stein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defined+metabolic+state+in+pre+B+cells+governs+B-cell+development+and+is+counterbalanced+by+Swiprosin-2/EFhd1.">A defined metabolic state in pre B cells governs B-cell development and is counterbalanced by Swiprosin-2/EFhd1.</a> Cell Death and Differentiation. 24, 1239-1252 (2017).</li><li>Hru&#353;&#225;k, O., Porwit-MacDonald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+expression+patterns+reflecting+genotype+of+acute+leukemias.">Antigen expression patterns reflecting genotype of acute leukemias.</a> Leukemia. 16, 1233-1258 (2002).</li><li>Amin, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Having+a+higher+blast+percentage+in+circulation+than+bone+marrow:+clinical+implications+in+myelodysplastic+syndrome+and+acute+lymphoid+and+myeloid+leukemias.">Having a higher blast percentage in circulation than bone marrow: clinical implications in myelodysplastic syndrome and acute lymphoid and myeloid leukemias.</a> Leukemia. 19, 1567-1572 (2005).</li></ol>

Ovenfor beskrevet protokollen tillater for måling av metabolske aktiviteten vurdert av OCR og ECAR verdier i primære leukemic støt fra pasienter med akutt lymfatisk leukemi (alle) eller akutt myelogen leukemi (AML). Fordelen med måling ved hjelp av en ekstracellulære flux analyserer er at den lar påvisning av metabolske profil i sanntid i live cellene. Hovedsak kan alle trinn i angitte protokollen justeres avhengig celle man planlegger å studere. Her vil vi diskutere de viktigste parameterne som kan påvirke resul...

Metabolsk profilen er en av de viktigste egenskapene av celler og endret bioenergi er nå regnet som en av kjennetegnene kreft1,2,3. Videre kan endringer i metabolske oppsettet brukes i behandling av kreft ved å målrette signaltransduksjon trasé eller enzymatisk maskiner kreft celler4,5,6. Å vite den metabolske predisposisjon av kreftceller er således en fordel og kan forbedre gjeldende terapi.
Det er en masse allerede etablerte metoder som kan vurdere metabolske aktiviteten til cellene i kultur. Om Glykolysen, glukose opptak kan måles ved radioaktivt merkingen, med 2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) eller ekstracellulær laktat nivåer målt enzymatisk7,8. Fettsyrer er oksidasjon en annen metabolske parameter målt ved isotopically merket palmitate9,10. Oksygen forbruksraten er en metode mye brukt for å bestemme mitokondrie aktivitet i cellene11,12, sammen med de mitokondrie membran potensielle evaluering13,14, ATP/ADP (adenosin 5 '-trifosfat/5 '-adenosindifosfat) forholdet måling15 eller totalt intracellulær ATP måling16. Signalnettverk trasé kjent for å regulere metabolske prosesser kan bestemmes av protein quantifications og kan forbedre forståelsen av metabolske målinger17,18,19.
Men alle disse metodene mål bare ett, eller inne det best filmmanuskriptet, noen metabolske parametere i en prøve samtidig. Viktigere, kan samtidig måling av oksygen forbruksraten (OCR) og ekstracellulære forsuring rate (ECAR) oppnås ved ekstracellulære flux analysen av, for eksempel Seahorse XFp Analyzer. OCR er en indikator på mitokondrie åndedrett og ECAR skyldes hovedsakelig Glykolysen (vi ikke kan overse CO2 produksjon muligens heve ECAR celler med høy oxidative fosforylering aktivitet)20. Så langt, har ulike celletyper studert ved bruk av disse analyserer21,22,23.
Her beskriver vi protokollen for ekstracellulære flux analyse av primære eksplosjonene (leukemi celler avledet fra umodne blodkreft scenen) fra leukemi pasienter. Best av vår kunnskap er en bestemt protokoll for primære eksplosjonene ikke tilgjengelig ennå.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biosera</td>
			<td>FB-1001/100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+) Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8375-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A from Streptomyces sp.</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Base Medium, 100 mL</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103193-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine solution, 200 mM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution, 1 M, pH 7.0-7.6</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE17-1440-02</td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp FluxPak</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103022-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#8482; Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>CB40240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Analyzer XFp</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>S7802A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp Cell Culture Miniplate</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103025-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells

Metabolske behovet av kreftceller kan negativt påvirke overlevelse og behandling effekt. I dag, er farmasøytiske målretting av metabolske veier testet i mange typer av svulst. Dermed er karakteristikk av kreft cellen metabolske oppsett uunngåelig for å målrette den riktige veien for å øke det samlede resultatet av pasienter. Dessverre, i de fleste av kreft, ondartet cellene er ganske vanskelig å få tak i høyere tall og vev biopsi er nødvendig. Leukemi er et unntak, der et tilstrekkelig antall leukemic celler kan isoleres fra benmargen. Her gir vi en detaljert protokoll for isolering av leukemic celler fra leukemi pasienter benmargen og påfølgende analyse av sine metabolske staten ved hjelp av ekstracellulære flux analyzer. Leukemic celler er isolert av tetthet gradient, hvilke ikke påvirker sin levedyktighet. Neste dyrking trinn hjelper dem å regenerere, dermed metabolske staten målt er celler under optimale forhold. Denne protokollen tillater å oppnå konsistente, godt standardisert resultater, som kan brukes for personlig terapi.

Figur 3 viser kurvene etter Glykolysen stresstest og celle Mito stresstest målinger av leukemic støt fra BCP-alle (B-celle forløper akutt lymfatisk leukemi) og AML (akutt myelogen leukemi) pasienter. Beregningen av metabolske parameterne fra disse målingene er også indikert. 500.000 celler per brønn var frø og alle mål ble gjort i hexaplicates.
Bare basale mediet brukes i Glykolysen stress t...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells at JoVE.com

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Her presenterer vi en protokoll for isolering av leukemic celler fra leukemi pasienter benmargen og analyse av deres metabolske tilstand. Vurdering av metabolske profilen til primære leukemi celler kan bidra til å bedre karakterisere etterspørselen av primære celler og føre til mer personlig medisin.

Vurdering av metabolske profilen til primære leukemi celler

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål om metabolske veien oppsett i leukemi celler. Den største fordelen med denne teknikken er at den tillater måling av metabolismen av primære leukemiceller i sanntid i levende celler. Begynn med å fortynne en benmargsprøve hentet fra en leukemipasient i PBS med ett til ett forhold.Forsiktig, lag seks milliliter av fortynnet benmargsprøve over seks milliliter nylaget tetthet gradient medium i en 15 milliliter konisk rør og skille cellene ved tetthet gradient sentrifugering. Bruk en Pasteur pipet til å forsiktig overføre grensesnittlaget av mononukleære celler til et nytt 50 milliliter konisk rør som inneholder fem milliliter PBS for en sentrifugeringsvask. Deretter, resuspend mononukleær celle pellet i to milliliter steril PBS for telling.Fortynn cellene til en tre ganger 10 til de syv cellene per milliliter konsentrasjon. Og legg til en milliliter celler til hver av to T75 flasker som inneholder 20 milliliter RPMI medium for en 16 til 24 timers inkubasjon ved 37 grader Celsius og 5% CO2. I mellomtiden for å forberede platene for ekstracellulær fluksanalyse, legg til 12,5 mikroliter cellelimløsning i hver brønn på to, åtte godt ekstracellulære fluksadelysatorplater.Etter 20 minutter, aspirer cellelimet og vask hver brønn to ganger med 200 mikroliter sterilt vann per vask. Etter den andre vasken, la platene stå i panseret til brønnene er tørre. Og plasser sensorkassetten opp ned på laboratoriebenken.Skill nytteplaten og sensorkassetten på fluksanalysatoren. Og fyll hver brønn av nytteplaten med 200 mikroliter kalibrerende og hver vollgrav rundt utsiden av brønnene med 400 mikroliter kalifar. Sett sensorkassetten tilbake til nytteplaten som nå inneholder kalibranten, og plasser patronenheten i en fuktet 37 grader Celsius-inkubator uten CO2 over natten.Slå deretter på den ekstracellulære fluksalysatoren og la den varme til 37 grader Celsius over natten. Neste morgen, overføre cellene fra kolben til 50 milliliter koniske rør for sentrifugering. Og gjenbruk pellets i en milliliter av riktig eksperimentell medium for telling.Resuspend cellene på fire ganger 10 til de seks cellene i 400 mikroliter av eksperimentell middels konsentrasjon. Og tilsett 50 mikroliter celler i brønner B gjennom G av flux analysatorplaten. Og 180 mikroliter av det eksperimentelle mediet i brønner A og H som bakgrunnskontrollbrønner.Etter sentrifugering sakte og forsiktig legge til 130 mikroliter av eksperimentelle mediet til brønner B gjennom G.Og visuelt bekrefte stabil etterlevelse av cellene til bunnen av hver brønn under mikroskopet. Deretter returnerer fluksanalyseplaten til den fuktede 37 grader Celsius-inkubatoren uten CO2 i 30 minutter. 20 minutter før inkubasjonens slutt, legg forbindelsene inn i de aktuelle injektorportene på sylinderampullen i henhold til den eksperimentelle protokollen som angitt i tabellen.Sett deretter opp riktig ekstracellulært fluksanalyseprogram. Start programmet og sett på kalifarplaten med analyseplaten når du blir bedt om det. I en glykosestresstest brukes bare basalmediet slik at cellene blir fratatt næringsstoffer.Den første parameteren oppnådd er basalforsuring som skal gjenspeile mengden glukose som er lagret i celler. Etter den første injeksjonen økes den ekstracellulære forsuringshastigheten etter hvert som cellene bruker glukosen og kan gjære glukosen til laktat. Oligomycin A i den andre injeksjonen hemmer ATP-syntase og leder dermed cellene til å produsere ATP hovedsakelig ved en glykose som forårsaker ytterligere økning av den ekstracellulære forsuringshastigheten.Mens injeksjonen av 2-Deoxy-D-glukose helt hemmer glykose og den ekstracellulære forsuringsraten synker. I cellemitostresstesten brukes et medium supplert med glutamin og glukose slik at cellene ikke blir fratatt alle næringsstoffer. Basal respirasjonsparameteren gjenspeiler deres basale metabolske tilstand.Etter den første injeksjonen med oligomycin A hemmer cellene mitokondriegånding og bytter til glykose som er representert som en reduksjon i oksygenforbruket. Andre og tredje injeksjoner av FCCP derimot, koble ATP-produksjonen fra respirasjonen slik at cellene nå bruker oksygen med en maksimal hastighet. Og oksygenforbruket stiger til sin høyeste verdi.Den siste injeksjonen av rotenon og antimycin En blanding hemmer helt mitokondrie respirasjon redusere oksygenforbruket til nesten null. Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å vurdere prosentandelen av eksplosjoner i prøven for å sikre at de metabolske parametrene til leukemiblastene bare måles. Når du implementerer denne metoden, må en forsiktig optimalisering brukes på dyrkingsforhold og data normalisering.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

En detaljert protokoll for å karakterisere Murine C1498 Cell Line og dens Associated leukemi Mouse Model

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Forberedelse og metabolske analysen av 3-dimensjonale Spheroid co kulturer av kreft i bukspyttkjertelen celler og fibroblaster

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Forberedelse av primære akutt lymfatisk leukemi celler i forskjellige cellen syklus faser av sentrifugal Elutriation

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flow cytometri å anslå leukemi stamceller i primære akutt myelogen leukemi og pasient-avledet-xenografts, diagnose og følge opp

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Rapid Generation of Primary Murine Melanocyte and Fibroblast Cultures

Rapid Generation av primær murine melanocyte og Fibroblast kulturer

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Flow analytiske analyse av mitokondrie reaktive oksygen arter i murine blodkreft stem og stamceller og MLL-AF9 drevet leukemi

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

Subcellulære Fraksjonering av primær kronisk lymfatisk leukemi celler til å overvåke kjernefysisk/cytoplasmatiske protein smugling

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

To flowcytometriske tilnærminger til NKG2D Ligand overflatedeteksjon for å skille stamceller fra bulk subpopulations i akutt myeloid leukemi

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

Intraperitoneal transplantasjon for generering av akutt myelogen leukemi hos mus

There is an unmet need for novel therapies to treat acute myeloid leukemia (AML) and the associated relapse that involves persistent leukemia stem cells ...

Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model

Vurdering av kimær antigenreseptor T-celleassosiert toksisitet ved bruk av en akutt lymfoblastisk leukemi pasientavledet xenograftmusemodell

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy has emerged as a powerful tool for the treatment of multiple types of CD19+ malignancies, which has led to ...