Name: assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells
Uploaded: 2018-11-21T13:00:00
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Gostaríamos de agradecer a centros de Hematologia pediátrica Checa. Este trabalho foi apoiado por Grant do Ministério da saúde (NV15-28848A), pelo Ministério da saúde da República Checa, University Hospital Motol, Praga, República Checa 00064203 e pelo Ministério da educação, da juventude e desportos NPU eu nr. LO1604.

Todas as amostras foram obtidas com o informed consent dos pais ou responsáveis das crianças e a aprovação do Comité de ética da Universidade Charles em Praga, República Checa, o estudo não. NV15-28848A.
1. preparação dos reagentes
<ol><li>Prepare 500 mL de PBS pela dissolução de 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4, 1,47 milímetros KH2PO4, em ddH2O. ajustar o pH para 7,4 com HCl. esterilize em autoclave.</li>
	<li>Prepar...

<ol>
	<li>DeBerardinis, R. J., Lum, J. J., Hatzivassiliou, G., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biology+of+Cancer:+Metabolic+Reprogramming+Fuels+Cell+Growth+and+Proliferation.">The Biology of Cancer: Metabolic Reprogramming Fuels Cell Growth and Proliferation.</a> Cell Metabolism. 7, 11-20 (2008).</li><li>Ward, P. S., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Reprogramming:+A+Cancer+Hallmark+Even+Warburg+Did+Not+Anticipate.">Metabolic Reprogramming: A Cancer Hallmark Even Warburg Did Not Anticipate.</a> Cancer Cell. 21, 297-308 (2012).</li><li>Pavlova, N. N., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Emerging+Hallmarks+of+Cancer+Metabolism.">The Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism.</a> Cell Metabolism. 23, 27-47 (2016).</li><li>Wise, D. R., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+addiction:+a+new+therapeutic+target+in+cancer.">Glutamine addiction: a new therapeutic target in cancer.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35, 427-433 (2010).</li><li>Kroemer, G., Pouyssegur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Cell+Metabolism:+Cancer's+Achilles'+Heel.">Tumor Cell Metabolism: Cancer's Achilles' Heel.</a> Cancer Cell. 13, 472-482 (2008).</li><li>Liberti, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Predictive+Model+for+Selective+Targeting+of+the+Warburg+Effect+through+GAPDH+Inhibition+with+a+Natural+Product.">A Predictive Model for Selective Targeting of the Warburg Effect through GAPDH Inhibition with a Natural Product.</a> Cell Metabolism. 26, 648-659 (2017).</li><li>Lundgaard, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+neuronal+glucose+uptake+heralds+activity-dependent+increases+in+cerebral+metabolism.">Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism.</a> Nature Communications. 6, 6807 (2015).</li><li>Hermanova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+inhibition+of+fatty-acid+oxidation+synergistically+enhances+the+effect+of+l-asparaginase+in+childhood+ALL+cells.">Pharmacological inhibition of fatty-acid oxidation synergistically enhances the effect of l-asparaginase in childhood ALL cells.</a> Leukemia. 30, 209-218 (2016).</li><li>Malandrino, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+fatty+acid+oxidation+in+adipocytes+and+macrophages+reduces+lipid-induced+triglyceride+accumulation+and+inflammation.">Enhanced fatty acid oxidation in adipocytes and macrophages reduces lipid-induced triglyceride accumulation and inflammation.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308, E756-E769 (2015).</li><li>Patella, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics-based+metabolic+modeling+reveals+that+fatty+acid+oxidation+(FAO)+controls+endothelial+cell+(EC)+permeability.">Proteomics-based metabolic modeling reveals that fatty acid oxidation (FAO) controls endothelial cell (EC) permeability.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics: MCP. 14, 621-634 (2015).</li><li>Chowdhury, S. R., Djordjevic, J., Albensi, B. C., Fernyhough, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+evaluation+of+substrate-dependent+oxygen+consumption+rates+and+mitochondrial+membrane+potential+by+TMRM+and+safranin+in+cortical+mitochondria.">Simultaneous evaluation of substrate-dependent oxygen consumption rates and mitochondrial membrane potential by TMRM and safranin in cortical mitochondria.</a> Bioscience Reports. 36, e00286 (2015).</li><li>Simonnet, H., Vigneron, A., Pouyss&#233;gur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+Techniques+to+Monitor+Mitochondrial+Oxygen+Consumption.">Conventional Techniques to Monitor Mitochondrial Oxygen Consumption.</a> Methods in Enzymology. 542, 151-161 (2014).</li><li>Mart&#237;nez-Reyes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCA+Cycle+and+Mitochondrial+Membrane+Potential+Are+Necessary+for+Diverse+Biological+Functions.">TCA Cycle and Mitochondrial Membrane Potential Are Necessary for Diverse Biological Functions.</a> Molecular Cell. 61, 199-209 (2016).</li><li>Sukumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Membrane+Potential+Identifies+Cells+with+Enhanced+Stemness+for+Cellular+Therapy.">Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy.</a> Cell Metabolism. 23, 63-76 (2016).</li><li>Wundenberg, T., Grabinski, N., Lin, H., Mayr, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+InsP6-kinases+as+InsP6-dephosphorylating+enzymes+provides+a+new+mechanism+of+cytosolic+InsP6+degradation+driven+by+the+cellular+ATP/ADP+ratio.">Discovery of InsP6-kinases as InsP6-dephosphorylating enzymes provides a new mechanism of cytosolic InsP6 degradation driven by the cellular ATP/ADP ratio.</a> The Biochemical Journal. 462, 173-184 (2014).</li><li>Morciano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+luciferase+probes+to+measure+ATP+in+living+cells+and+animals.">Use of luciferase probes to measure ATP in living cells and animals.</a> Nature Protocols. 12, 1542-1562 (2017).</li><li>Chau, M. D. L., Gao, J., Yang, Q., Wu, Z., Gromada, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+21+regulates+energy+metabolism+by+activating+the+AMPK-SIRT1-PGC-1alpha+pathway.">Fibroblast growth factor 21 regulates energy metabolism by activating the AMPK-SIRT1-PGC-1alpha pathway.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 12553-12558 (2010).</li><li>Lee, K. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+energy+metabolic+and+oncogenic+signaling+pathways+in+triple-negative+breast+cancer+by+a+novel+adenosine+monophosphate-activated+protein+kinase+(AMPK)+activator.">Targeting energy metabolic and oncogenic signaling pathways in triple-negative breast cancer by a novel adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) activator.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286, 39247-39258 (2011).</li><li>Godlewski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-451+Regulates+LKB1/AMPK+Signaling+and+Allows+Adaptation+to+Metabolic+Stress+in+Glioma+Cells.">MicroRNA-451 Regulates LKB1/AMPK Signaling and Allows Adaptation to Metabolic Stress in Glioma Cells.</a> Molecular Cell. 37, 620-632 (2010).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+energy+metabolism+in+cultured+cells,+including+human+pluripotent+stem+cells+and+differentiated+cells.">Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells.</a> Nature Protocols. 7, 1068-1085 (2012).</li><li>Kaplon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+role+for+mitochondrial+gatekeeper+pyruvate+dehydrogenase+in+oncogene-induced+senescence.">A key role for mitochondrial gatekeeper pyruvate dehydrogenase in oncogene-induced senescence.</a> Nature. 498, 109-112 (2013).</li><li>Pardee, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+study+of+the+first-in-class+antimitochondrial+metabolism+agent,+CPI-613,+in+patients+with+advanced+hematologic+malignancies.">A phase I study of the first-in-class antimitochondrial metabolism agent, CPI-613, in patients with advanced hematologic malignancies.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 20, 5255-5264 (2014).</li><li>Stein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defined+metabolic+state+in+pre+B+cells+governs+B-cell+development+and+is+counterbalanced+by+Swiprosin-2/EFhd1.">A defined metabolic state in pre B cells governs B-cell development and is counterbalanced by Swiprosin-2/EFhd1.</a> Cell Death and Differentiation. 24, 1239-1252 (2017).</li><li>Hru&#353;&#225;k, O., Porwit-MacDonald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+expression+patterns+reflecting+genotype+of+acute+leukemias.">Antigen expression patterns reflecting genotype of acute leukemias.</a> Leukemia. 16, 1233-1258 (2002).</li><li>Amin, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Having+a+higher+blast+percentage+in+circulation+than+bone+marrow:+clinical+implications+in+myelodysplastic+syndrome+and+acute+lymphoid+and+myeloid+leukemias.">Having a higher blast percentage in circulation than bone marrow: clinical implications in myelodysplastic syndrome and acute lymphoid and myeloid leukemias.</a> Leukemia. 19, 1567-1572 (2005).</li></ol>

O protocolo acima descrita permite a medição da atividade metabólica avaliada por valores de OCR e ECAR no primários leucêmicas explosões derivadas de pacientes com leucemia linfoblástica aguda (LLA) ou leucemia mieloide aguda (LMA). A vantagem de medição utilizando um analisador de fluxo extracelular é que permite a detecção de perfil metabólico no tempo real nas células vivas. Essencialmente, cada passo no protocolo fornecido pode ser ajustado dependendo do tipo de célula, um planeja estudar. Aqui, vamos...

O perfil metabólico é uma das principais características das células e bioenergética alterada são consideradas uma das marcas de câncer1,2,3. Além disso, alterações na configuração da metabólica poderiam ser usadas no tratamento de câncer pela segmentação vias de transdução de sinal ou maquinaria enzimática de células de câncer a4,5,6. Conhecendo a predisposição metabólica das células cancerosas é, assim, uma vantagem e pode ajudar a melhorar a terapia atual.
Há uma abundância de métodos já estabelecidos que pode avaliar a atividade metabólica das células em cultura. Em relação a glicólise, a absorção de glicose pode ser medida pela rotulagem radioactiva, usando 2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) ou níveis de lactato extracelular mensurados enzimaticamente7,8. Taxa de oxidação de ácidos graxos é outro parâmetro metabólico medido por desvendar rotulado palmitato9,10. Taxa de consumo de oxigênio é um método utilizado para determinar a actividade mitocondrial em células11,12, juntamente com a membrana mitocondrial potencial avaliação13,14, ATP/ADP (adenosina 5 '-trifosfato/adenosina 5 '-difosfato) relação medição15 ou total intracelular ATP medição16. Sinalização de caminhos conhecidos por regulam processos metabólicos pode ser determinada por quantificações de proteínas e pode melhorar a compreensão das medições metabólicas17,18,19.
No entanto, todos esses métodos medem apenas uma ou, no melhor cenário, alguns parâmetros metabólicos em uma amostra simultaneamente. Importante, medição simultânea da taxa de consumo de oxigênio (OCR) e taxa de acidificação do extracelular (ECAR) pode ser alcançada através da análise de fluxo extracelular por, por exemplo, cavalos-marinhos XFp Analyzer. OCR é um indicador da respiração mitocondrial e ECAR resulta principalmente da glicólise (que não podemos ignorar o CO2 produção possivelmente elevando ECAR de células com atividade alta fosforilação oxidativa)20. Até agora, vários tipos de células têm sido estudados usando estes analisadores21,22,23.
Aqui descrevemos o protocolo para a análise de fluxo extracelular primário blastos (células de leucemia derivadas o estágio imaturo hematopoiético) de pacientes de leucemia. O melhor de nosso conhecimento, um protocolo específico para explosões primários não está disponível ainda.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biosera</td>
			<td>FB-1001/100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+) Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8375-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A from Streptomyces sp.</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Base Medium, 100 mL</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103193-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine solution, 200 mM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution, 1 M, pH 7.0-7.6</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE17-1440-02</td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp FluxPak</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103022-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#8482; Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>CB40240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Analyzer XFp</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>S7802A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp Cell Culture Miniplate</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103025-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells

A exigência metabólica das células cancerosas pode influenciar negativamente, sobrevivência e a eficácia do tratamento. Hoje em dia, orientação farmacêutica das vias metabólicas é testado em muitos tipos de tumores. Assim, a caracterização de configuração metabólica de célula de câncer é inevitável fim de direcionar o caminho correto para melhorar o resultado global dos pacientes. Infelizmente, na maioria dos tipos de câncer, as células malignas são muito difíceis de obter em números mais altos e a biópsia do tecido é necessária. A leucemia é uma exceção, onde um número suficiente de células leucêmicas pode ser isolado da medula óssea. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para o isolamento de células leucêmicas da medula óssea de pacientes de leucemia e posterior análise de seu estado metabólico, usando o analisador de fluxo extracelular. Células leucêmicas são isoladas pelo gradiente de densidade, que não afeta a sua viabilidade. O próximo passo de cultivo ajuda a regenerar, assim, o estado metabólico medido é o estado das células em condições ideais. Este protocolo permite alcançar resultados consistentes, bem padronizados, que poderiam ser usados para a terapia personalizada.

A Figura 3 mostra as curvas depois de teste de estresse de glicólise e medições de teste de estresse Mito de células leucêmicas blastos do BCP-ALL (B-precursor aguda linfoblástica leucemia) e pacientes LMA (leucemia mieloide aguda). O cálculo dos parâmetros metabólicos destas medidas também é indicado. 500.000 células por poço foram semeadas e todas as medições foram feitas em hexaplicates.
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Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Aqui nós apresentamos um protocolo para análise de seu estado metabólico e o isolamento de células leucêmicas da medula óssea de pacientes de leucemia. Avaliação do perfil metabólico das células de leucemia primária poderia contribuir para melhor caracterizar a demanda de células primárias e poderia levar a medicina mais personalizada.

Avaliação do perfil metabólico das células de leucemia primária

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave sobre a configuração da via metabólica em células de leucemia. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a medição do metabolismo das células primárias de leucemia em tempo real em células vivas. Comece diluindo uma amostra de medula óssea obtida de um paciente com leucemia na PBS em uma proporção de um para um.Cuidadosamente, camada seis mililitros da amostra de medula óssea diluída sobre seis mililitros de gradiente de densidade recém-preparado em um tubo cônico de 15 mililitros e separar as células por centrifugação gradiente de densidade. Use um pipet Pasteur para transferir cuidadosamente a camada de interface das células mononucleares para um novo tubo cônico de 50 mililitros contendo cinco mililitros de PBS para uma lavagem de centrifugação. Em seguida, resuspenque a pelota de célula mononuclear em dois mililitros de PBS estéreis para contar.Diluir as células para três vezes 10 às sete células por concentração mililitro. E adicione um mililitro de células a cada um dos dois frascos T75 contendo 20 mililitros de meio RPMI para uma incubação de 16 a 24 horas a 37 graus Celsius e 5%de CO2. Enquanto isso, para preparar as placas para análise de fluxo extracelular, adicione 12,5 microliters de solução adesiva celular em cada poço de duas, oito placas de analisador de fluxo extracelular.Após 20 minutos, aspire o adesivo da célula e lave cada poço duas vezes com 200 microliters de água estéril por lavagem. Após a segunda lavagem, deixe as placas no capô até que os poços estejam secos. E coloque o cartucho de sensor de cabeça para baixo no banco do laboratório.Separe a placa de utilidade e o cartucho do sensor do analisador de fluxo. E encha cada poço da placa de utilidade com 200 microliters de calibrante e cada fosso ao redor dos poços com 400 microliters de calibrante. Devolva o cartucho do sensor para a placa de utilidade que agora contém o calibrador e coloque o conjunto do cartucho em uma incubadora umidificada de 37 graus Celsius sem CO2 durante a noite.Em seguida, ligue o analisador de fluxo extracelular e deixe aquecer a 37 graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, transfira as células do frasco para tubos cônicos de 50 mililitros para centrifugação. E resuspense as pelotas em um mililitro do meio experimental apropriado para contar.Resuspensar as células em quatro vezes 10 para as seis células em 400 microliters de concentração média experimental. E adicione 50 microliters de células em poços B a G da placa analisadora de fluxo. E 180 microliters do meio experimental em poços A e H como poços de controle de fundo.Após a centrifugação lentamente e cuidadosamente adicione 130 microlitros do meio experimental aos poços B através de G.E confirme visualmente a adesão estável das células ao fundo de cada poço sob o microscópio. Em seguida, retorne a placa de análise de fluxo para a incubadora umidificada de 37 graus Celsius sem CO2 por 30 minutos. 20 minutos antes do término da incubação, carregue os compostos nas portas injetoras apropriadas do cartucho de acordo com o protocolo experimental, conforme indicado na tabela.Em seguida, configure o programa de análise de fluxo extracelular apropriado. Inicie o programa e substitua a placa calibrante pela placa de ensaio quando solicitado. Em um teste de estresse de glicolise, apenas o meio basal é usado para que as células sejam privadas de nutrientes.O primeiro parâmetro obtido é a acidificação basal que deve refletir a quantidade de glicose armazenada nas células. Após a primeira injeção, a taxa de acidificação extracelular é aumentada à medida que as células utilizam a glicose e podem fermentar a glicose para lactato. A oligomicina A na segunda injeção inibe a synthase ATP e, portanto, direciona as células a produzir ATP principalmente por uma glicolise causando uma elevação adicional da taxa de acidificação extracelular.Enquanto a injeção de 2-Deoxy-D-glicose inibe completamente a glicólise e a taxa de acidificação extracelular cai. No teste de estresse mito celular, um meio suplementado com glutamina e glicose é usado para que as células não sejam privadas de todos os nutrientes. O parâmetro de respiração basal reflete seu estado metabólico basal.Após a primeira injeção com oligomicina A, as células inibem a respiração mitocondrial e mudam para glicólise que é representada como uma diminuição na taxa de consumo de oxigênio. A segunda e terceira injeções de FCCP, no entanto, desacoplar a produção de ATP da respiração para que as células agora consumam oxigênio a uma taxa máxima. E a taxa de consumo de oxigênio sobe para seu maior valor.A última injeção da mistura rotenona e antimicina A inibe completamente a respiração mitocondrial diminuindo a taxa de consumo de oxigênio para quase zero. Ao tentar este procedimento, é importante avaliar a porcentagem de explosões na amostra para garantir que os parâmetros metabólicos dos leucemias sejam medidos apenas. Ao implementar esse método, é preciso aplicar uma otimização cuidadosa às condições de cultivo e à normalização dos dados.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Pesquisa do câncer

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Fluxo Cytometry para estimar leucemia células-tronco na leucemia mieloide aguda primária e no paciente-derivada-xenografts, diagnóstico e segue até

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Rapid Generation of Primary Murine Melanocyte and Fibroblast Cultures

Geração rápida de culturas de melanócitos e fibroblastos de Murina primária

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Análise Citométrica de fluxo de espécies reativas de oxigênio mitocondrial em células tronco e progenitoras hematopoiéticas Murinas e leucemia acionada por MLL-AF9

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

Fraccionamento subcelular de células crônicas primárias de leucemia linfocítica para monitorar o tráfico de proteínas nucleares/citoplasmáticas

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

Duas abordagens citométricas de fluxo de detecção de superfície de ligante NKG2D para distinguir células-tronco de subpopulações a granel em leucemia mielóide aguda

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

Transplante Intra-Peritoneal na Geração de Leucemia Mielóide Aguda em Camundongos

There is an unmet need for novel therapies to treat acute myeloid leukemia (AML) and the associated relapse that involves persistent leukemia stem cells ...

Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model

Avaliação das Toxicidades Associadas às Células T do Receptor de Antígeno Quimérico Usando um Modelo de Xenoenxerto de Camundongo Derivado de Pacientes com Leucemia Linfoblástica Aguda

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy has emerged as a powerful tool for the treatment of multiple types of CD19+ malignancies, which has led to ...