Name: assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells
Uploaded: 2018-11-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить Чешской центров детской гематологии. Эта работа была поддерживается грант Министерства здравоохранения (NV15-28848A), министерством здравоохранения, Чешская Республика, Университет больница Мотол, Прага, Чешская Республика 00064203 и министерства образования, молодежи и спорта НПУ nr. LO1604.

Все образцы были получены с informed consent родителей или опекунов детей и утверждения этического Комитета Карлова университета в Праге, Чешская Республика, исследование нет. NV15-28848A.
1. Подготовка реагентов
<ol><li>Подготовка 500 мл PBS, растворяя 137 мм NaCl, 2,7 мм KCl, 4,3 мм Na2HPO4...

<ol>
	<li>DeBerardinis, R. J., Lum, J. J., Hatzivassiliou, G., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biology+of+Cancer:+Metabolic+Reprogramming+Fuels+Cell+Growth+and+Proliferation.">The Biology of Cancer: Metabolic Reprogramming Fuels Cell Growth and Proliferation.</a> Cell Metabolism. 7, 11-20 (2008).</li><li>Ward, P. S., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Reprogramming:+A+Cancer+Hallmark+Even+Warburg+Did+Not+Anticipate.">Metabolic Reprogramming: A Cancer Hallmark Even Warburg Did Not Anticipate.</a> Cancer Cell. 21, 297-308 (2012).</li><li>Pavlova, N. N., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Emerging+Hallmarks+of+Cancer+Metabolism.">The Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism.</a> Cell Metabolism. 23, 27-47 (2016).</li><li>Wise, D. R., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+addiction:+a+new+therapeutic+target+in+cancer.">Glutamine addiction: a new therapeutic target in cancer.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35, 427-433 (2010).</li><li>Kroemer, G., Pouyssegur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Cell+Metabolism:+Cancer's+Achilles'+Heel.">Tumor Cell Metabolism: Cancer's Achilles' Heel.</a> Cancer Cell. 13, 472-482 (2008).</li><li>Liberti, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Predictive+Model+for+Selective+Targeting+of+the+Warburg+Effect+through+GAPDH+Inhibition+with+a+Natural+Product.">A Predictive Model for Selective Targeting of the Warburg Effect through GAPDH Inhibition with a Natural Product.</a> Cell Metabolism. 26, 648-659 (2017).</li><li>Lundgaard, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+neuronal+glucose+uptake+heralds+activity-dependent+increases+in+cerebral+metabolism.">Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism.</a> Nature Communications. 6, 6807 (2015).</li><li>Hermanova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+inhibition+of+fatty-acid+oxidation+synergistically+enhances+the+effect+of+l-asparaginase+in+childhood+ALL+cells.">Pharmacological inhibition of fatty-acid oxidation synergistically enhances the effect of l-asparaginase in childhood ALL cells.</a> Leukemia. 30, 209-218 (2016).</li><li>Malandrino, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+fatty+acid+oxidation+in+adipocytes+and+macrophages+reduces+lipid-induced+triglyceride+accumulation+and+inflammation.">Enhanced fatty acid oxidation in adipocytes and macrophages reduces lipid-induced triglyceride accumulation and inflammation.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308, E756-E769 (2015).</li><li>Patella, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics-based+metabolic+modeling+reveals+that+fatty+acid+oxidation+(FAO)+controls+endothelial+cell+(EC)+permeability.">Proteomics-based metabolic modeling reveals that fatty acid oxidation (FAO) controls endothelial cell (EC) permeability.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics: MCP. 14, 621-634 (2015).</li><li>Chowdhury, S. R., Djordjevic, J., Albensi, B. C., Fernyhough, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+evaluation+of+substrate-dependent+oxygen+consumption+rates+and+mitochondrial+membrane+potential+by+TMRM+and+safranin+in+cortical+mitochondria.">Simultaneous evaluation of substrate-dependent oxygen consumption rates and mitochondrial membrane potential by TMRM and safranin in cortical mitochondria.</a> Bioscience Reports. 36, e00286 (2015).</li><li>Simonnet, H., Vigneron, A., Pouyss&#233;gur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+Techniques+to+Monitor+Mitochondrial+Oxygen+Consumption.">Conventional Techniques to Monitor Mitochondrial Oxygen Consumption.</a> Methods in Enzymology. 542, 151-161 (2014).</li><li>Mart&#237;nez-Reyes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCA+Cycle+and+Mitochondrial+Membrane+Potential+Are+Necessary+for+Diverse+Biological+Functions.">TCA Cycle and Mitochondrial Membrane Potential Are Necessary for Diverse Biological Functions.</a> Molecular Cell. 61, 199-209 (2016).</li><li>Sukumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Membrane+Potential+Identifies+Cells+with+Enhanced+Stemness+for+Cellular+Therapy.">Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy.</a> Cell Metabolism. 23, 63-76 (2016).</li><li>Wundenberg, T., Grabinski, N., Lin, H., Mayr, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+InsP6-kinases+as+InsP6-dephosphorylating+enzymes+provides+a+new+mechanism+of+cytosolic+InsP6+degradation+driven+by+the+cellular+ATP/ADP+ratio.">Discovery of InsP6-kinases as InsP6-dephosphorylating enzymes provides a new mechanism of cytosolic InsP6 degradation driven by the cellular ATP/ADP ratio.</a> The Biochemical Journal. 462, 173-184 (2014).</li><li>Morciano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+luciferase+probes+to+measure+ATP+in+living+cells+and+animals.">Use of luciferase probes to measure ATP in living cells and animals.</a> Nature Protocols. 12, 1542-1562 (2017).</li><li>Chau, M. D. L., Gao, J., Yang, Q., Wu, Z., Gromada, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+21+regulates+energy+metabolism+by+activating+the+AMPK-SIRT1-PGC-1alpha+pathway.">Fibroblast growth factor 21 regulates energy metabolism by activating the AMPK-SIRT1-PGC-1alpha pathway.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 12553-12558 (2010).</li><li>Lee, K. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+energy+metabolic+and+oncogenic+signaling+pathways+in+triple-negative+breast+cancer+by+a+novel+adenosine+monophosphate-activated+protein+kinase+(AMPK)+activator.">Targeting energy metabolic and oncogenic signaling pathways in triple-negative breast cancer by a novel adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) activator.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286, 39247-39258 (2011).</li><li>Godlewski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-451+Regulates+LKB1/AMPK+Signaling+and+Allows+Adaptation+to+Metabolic+Stress+in+Glioma+Cells.">MicroRNA-451 Regulates LKB1/AMPK Signaling and Allows Adaptation to Metabolic Stress in Glioma Cells.</a> Molecular Cell. 37, 620-632 (2010).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+energy+metabolism+in+cultured+cells,+including+human+pluripotent+stem+cells+and+differentiated+cells.">Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells.</a> Nature Protocols. 7, 1068-1085 (2012).</li><li>Kaplon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+role+for+mitochondrial+gatekeeper+pyruvate+dehydrogenase+in+oncogene-induced+senescence.">A key role for mitochondrial gatekeeper pyruvate dehydrogenase in oncogene-induced senescence.</a> Nature. 498, 109-112 (2013).</li><li>Pardee, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+study+of+the+first-in-class+antimitochondrial+metabolism+agent,+CPI-613,+in+patients+with+advanced+hematologic+malignancies.">A phase I study of the first-in-class antimitochondrial metabolism agent, CPI-613, in patients with advanced hematologic malignancies.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 20, 5255-5264 (2014).</li><li>Stein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defined+metabolic+state+in+pre+B+cells+governs+B-cell+development+and+is+counterbalanced+by+Swiprosin-2/EFhd1.">A defined metabolic state in pre B cells governs B-cell development and is counterbalanced by Swiprosin-2/EFhd1.</a> Cell Death and Differentiation. 24, 1239-1252 (2017).</li><li>Hru&#353;&#225;k, O., Porwit-MacDonald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+expression+patterns+reflecting+genotype+of+acute+leukemias.">Antigen expression patterns reflecting genotype of acute leukemias.</a> Leukemia. 16, 1233-1258 (2002).</li><li>Amin, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Having+a+higher+blast+percentage+in+circulation+than+bone+marrow:+clinical+implications+in+myelodysplastic+syndrome+and+acute+lymphoid+and+myeloid+leukemias.">Having a higher blast percentage in circulation than bone marrow: clinical implications in myelodysplastic syndrome and acute lymphoid and myeloid leukemias.</a> Leukemia. 19, 1567-1572 (2005).</li></ol>

Описанные выше протокол позволяет для измерения метаболической активности, оцениваются значения OCR и ECAR в первичной лейкозных взрывов, полученных от пациентов с острым лимфобластным лейкозом (все) или острый миелоидный лейкоз (ОМЛ). Преимуществом измерений с помощью анализатора внекл?...

Метаболические профиль является одной из основных характеристик клеток и изменены биоэнергетики сейчас считаются одним из отличительных признаков рака1,2,3. Кроме того изменения в метаболические установки может использоваться в лечении рака ориентации сигнальных путей или ферментативный машины раковых клеток4,5,6. Зная метаболических предрасположенность раковых клеток таким образом преимущество и может помочь улучшить текущий терапии.
Существует большое количество уже установленных методов, которые можно оценить метаболическую активность клеток в культуре. Что касается гликолиза, поглощение глюкозы может быть измерено радиоактивных маркировки, с использованием 2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) или внеклеточная лактат уровнях измеряется ферментативно7,8. Скорость окисления жирных кислот — еще один метаболических параметр измеряется гетерогенны помечены пальмитата9,10. Скорость потребления кислорода — это метод, широко используется для определения митохондриальной активности клеток11,12, вместе с митохондриальной мембраны потенциал оценки13,14, СПС/ADP (аденозин 5 ′ трифосфата/5′ аденозиндифосфат) соотношение измерения15 или полная внутриклеточных СПС измерения16. Сигнальные пути, известный регулировать обменные процессы может определяться белок количественной и может улучшить понимание метаболических измерения17,18,19.
Однако все эти методы измерения только один, или в лучший сценарий, несколько метаболических параметров в одном образец одновременно. Важно отметить, что одновременное измерение скорости потребления кислорода (OCR) и внеклеточной подкисления (ECAR) может быть достигнуто путем анализа внеклеточного потока анализатором, например, морской конек XFp. OCR является показателем митохондриальное дыхание и ECAR является главным образом результатом гликолиз (мы не можем игнорировать CO2 производства возможно подъемные ECAR клеток с высоким Оксидативное фосфорилирование активности)20. До настоящего времени были изучены различные типы клеток с помощью этих анализаторов21,,2223.
Здесь мы описываем протокол для анализа внеклеточного поток первичного взрывов (лейкозных клеток, полученных от стадии незрелых гемопоэтических) от больных лейкемией. В меру наших знаний отдельный протокол для первичного взрывов пока недоступна.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biosera</td>
			<td>FB-1001/100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+) Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8375-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A from Streptomyces sp.</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Base Medium, 100 mL</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103193-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine solution, 200 mM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution, 1 M, pH 7.0-7.6</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE17-1440-02</td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp FluxPak</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103022-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#8482; Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>CB40240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Analyzer XFp</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>S7802A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp Cell Culture Miniplate</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103025-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells

Метаболические требования раковых клеток может негативно повлиять на выживание и эффективности лечения. В настоящее время фармацевтических ориентации метаболических испытания во многих типах опухолей. Таким образом характеристика раковых клеток метаболические установки является неизбежным для правильный путь для улучшения общего итога пациентов. К сожалению в большинстве случаев рака, злокачественные клетки являются довольно трудно получить в большем количестве и биопсия тканей не требуется. Лейкемия является исключение, где достаточное количество лейкозных клеток могут быть изолированы от костного мозга. Здесь мы предоставляем подробный протокол для изоляции лейкозных клеток из костного мозга пациентов лейкемии и последующего анализа их метаболического состояния с использованием анализатора внеклеточного потока. Лейкозных клеток, изолируются градиент плотности, которая не влияет на их жизнеспособность. Следующий шаг культивирования помогает им восстанавливать, таким образом измеряется метаболических государство является состояние клеток в оптимальных условиях. Этот протокол позволяет добиться последовательного, хорошо стандартизованных результатов, которые могут быть использованы для персонализированной терапии.

Рисунок 3 показывает кривые после гликолиз стресс-тестирования и измерения стресс-тест ячейка Mito лейкозных взрывов от BCP-ALL (клетки B прекурсоров острый лимфобластный лейкоз) и AML (острый миелобластный лейкоз) пациентов. Указывается также расчет метабол?...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells at JoVE.com

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Здесь мы представляем протокол для изоляции лейкозных клеток из костного мозга пациентов лейкемии и анализ состояния их метаболизма. Оценка метаболических профиля первичных лейкозных клеток может помочь лучше охарактеризовать требование начальной клеток и может способствовать более персонализированной медицины.

Оценка метаболических профиля первичных лейкозных клеток

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, касающиеся метаболических установки пути в клетках лейкемии. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет измерять метаболизм первичных клеток лейкемии в режиме реального времени в живых клетках. Начните с разбавления образца костного мозга, полученного от больного лейкемией в PBS в соотношении один к одному.Осторожно, слой шесть миллилитров разбавленного образца костного мозга более шести миллилитров свежеприготовленной плотности градиента среды в 15 миллилитров конической трубки и отделить клетки по плотности градиентной центрифугации. Используйте трубу Pasteur, чтобы тщательно перенести интерфейсный слой моноядерных ячеек в новую коническую трубку диаметром 50 миллилитров, содержащую пять миллилитров PBS для центробежной стирки. Затем, повторное распределение моноядерных гранул клеток в двух миллилитров стерильных PBS для подсчета.Разбавить клетки в три раза от 10 до семи клеток на миллилитр концентрации. И добавить один миллилитр клеток к каждой из двух колб T75, содержащих 20 миллилитров RPMI среды для 16 до 24 часов инкубации при 37 градусов по Цельсию и 5%CO2. Между тем, чтобы подготовить пластины для внеклеточного анализа потока, добавьте 12,5 микролитров клеточного клея раствора в каждую колодец из двух, восьми хорошо внеклеточных пластин анализатора потока.Через 20 минут, аспирировать клей клетки и мыть каждый хорошо два раза с 200 микролитров стерильной воды на стирку. После второй стирки оставьте тарелки в капюшоне до тех пор, пока колодцы не высохнут. И поместите сенсорный картридж вверх дном на лабораторную скамейку.Разделив утилиту пластины и сенсорный картридж анализатора потока. И заполнить каждый колодец утилиты пластины с 200 микролитров калибранта и каждый ров вокруг внешней стороны скважин с 400 микролитров калибранта. Верните картридж датчика на утилиту пластины, которая в настоящее время содержит калибрант и поместите сборку картриджа в увлажненной 37 градусов по Цельсию инкубатор без CO2 ночь.Затем включите экстраклеточный анализатор потока и дайте ему прогреться до 37 градусов по Цельсию на ночь. На следующее утро перенесите клетки из колбы в 50 миллилитровых конических труб для центрифугации. И повторно посовечите гранулы в один миллилитр соответствующей экспериментальной среды для подсчета.Повторное течение клеток в четыре раза от 10 до шести клеток в 400 микролитров экспериментальной средней концентрации. И добавьте 50 микролитров клеток в скважины B через G пластины анализатора потока. И 180 микролитров экспериментальной среды в скважины А и Н в качестве фоновых контрольных скважин.После центрифугации медленно и осторожно добавляйте 130 микролитров экспериментальной среды к скважинам B через G.И визуально подтверждайте стабильную приверженность клеток дну каждой скважины под микроскопом. Затем верните тарелку анализа потока в увлажненные 37 градусов по Цельсию инкубатор без CO2 в течение 30 минут. За 20 минут до окончания инкубации загрузите соединения в соответствующие инжекторные порты картриджа в соответствии с экспериментальным протоколом, указанным в таблице.Затем навелит соответствующую внеклеточную программу анализа потока. Запустите программу и замените тарелку с анализом по запросу. В стресс-тесте гликолиза используется только базальная среда, чтобы клетки были лишены питательных веществ.Первым полученным параметром является базальное подкисление, которое должно отражать количество глюкозы, хранящейся в клетках. После первой инъекции, внеклеточной скорости подкисления увеличивается, как клетки используют глюкозу и может брожения глюкозы для лактата. Олигомицин А во второй инъекции подавляет синтазу АТФ и, таким образом, направляет клетки на производство АТФ главным образом путем гликолиза, вызывая дальнейшее повышение уровня внеклеточного подкисления.В то время как инъекция 2-Deoxy-D-глюкозы полностью подавляет гликолиз и внеклеточной скорости подкисления падает. В клеточном стресс-тесте мито используется среда, дополненная глутамином и глюкозой, чтобы клетки не были лишены всех питательных веществ. Параметр базального дыхания отражает их базальное метаболическое состояние.После первой инъекции олигомицином А клетки подавляют митохондриальное дыхание и переключаются на гликолиз, который представлен как снижение скорости потребления кислорода. Вторая и третья инъекции FCCP однако, отсоединяют производство АТФ от дыхания, так что клетки теперь потребляют кислород с максимальной скоростью. И уровень потребления кислорода возрастает до самого высокого значения.Последняя инъекция ротенона и антимицина Смесь полностью подавляет митохондриальное дыхание, снижая скорость потребления кислорода почти до нуля. При попытке этой процедуры, важно оценить процент взрывов в образце, чтобы убедиться, что метаболические параметры лейкемии только измеряются. При внедрении этого метода тщательная оптимизация должна применяться к условиям выращивания и нормализации данных.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

Подробный протокол Характеризуя клеточной линии мышиной C1498 и его модель Associated Лейкоз Mouse

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Подготовка и метаболических Assay 3-мерной сфероида Сопредседатель культур клеток поджелудочной железы и фибробластов

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Подготовка первичных острый лимфобластный лейкоз клеток в разных клеточного цикла этапов, центробежные сцеживания

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Проточная цитометрия оценить стволовых клеток лейкемии в первичных острый миелолейкоз и пациент производные ксенотрасплантатов, диагностики и последующей вверх

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Rapid Generation of Primary Murine Melanocyte and Fibroblast Cultures

Быстрое поколение первичных культур Мурин Меланоцит и Фибробласт

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Поток Цитометрический анализ митохондриальных реактивных видов кислорода в Мурин гематопоитических стволовых и прародителей клеток и MLL-AF9 Driven лейкемии

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

Субклеточная фракция первичных клеток хронического лимфоцитарного лейкоза для мониторинга торговли ядерным/цитоплазмическим ибелением

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

Два проточных цитометрических подхода к обнаружению поверхности лигандов NKG2D для отличия стволовых клеток от объемных субпопуляций при остром миелоидном лейкозе

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

Внутрибрюшинная трансплантация при возникновении острого миелоидного лейкоза у мышей

There is an unmet need for novel therapies to treat acute myeloid leukemia (AML) and the associated relapse that involves persistent leukemia stem cells ...

Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model

Оценка токсичности, ассоциированной с Т-клетками химерного антигенного рецептора, с использованием мышиной модели ксенотрансплантата пациента с острым лимфобластным лейкозом

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy has emerged as a powerful tool for the treatment of multiple types of CD19+ malignancies, which has led to ...