Name: assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells
Uploaded: 2018-11-21T13:00:00
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Nos gustaría agradecer a los centros de hematología pediátrica Checa. Este trabajo fue apoyado por la beca del Ministerio de salud (NV15-28848A), Ministerio de salud de la Universidad Hospital Motol, República Checa, Praga, República Checa 00064203 y por el Ministerio de educación, juventud y deportes NPU y nr. LO1604.

Todas las muestras se obtuvieron con la informed consent de los padres o tutores de los niños y la aprobación del Comité de ética de la Universidad de Charles en Praga, República Checa, el estudio no. NV15-28848A.
1. preparación de reactivos
<ol><li>Preparar 500 mL de PBS disolviendo NaCl 137 mM, 2.7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4, 1,47 mM KH2PO4, en Dec2O. ajustar el pH a 7.4 con HCl. esterilizar en autoclave.</li>
	<li>Preparar 100 mL de...

<ol>
	<li>DeBerardinis, R. J., Lum, J. J., Hatzivassiliou, G., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biology+of+Cancer:+Metabolic+Reprogramming+Fuels+Cell+Growth+and+Proliferation.">The Biology of Cancer: Metabolic Reprogramming Fuels Cell Growth and Proliferation.</a> Cell Metabolism. 7, 11-20 (2008).</li><li>Ward, P. S., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Reprogramming:+A+Cancer+Hallmark+Even+Warburg+Did+Not+Anticipate.">Metabolic Reprogramming: A Cancer Hallmark Even Warburg Did Not Anticipate.</a> Cancer Cell. 21, 297-308 (2012).</li><li>Pavlova, N. N., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Emerging+Hallmarks+of+Cancer+Metabolism.">The Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism.</a> Cell Metabolism. 23, 27-47 (2016).</li><li>Wise, D. R., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+addiction:+a+new+therapeutic+target+in+cancer.">Glutamine addiction: a new therapeutic target in cancer.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35, 427-433 (2010).</li><li>Kroemer, G., Pouyssegur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Cell+Metabolism:+Cancer's+Achilles'+Heel.">Tumor Cell Metabolism: Cancer's Achilles' Heel.</a> Cancer Cell. 13, 472-482 (2008).</li><li>Liberti, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Predictive+Model+for+Selective+Targeting+of+the+Warburg+Effect+through+GAPDH+Inhibition+with+a+Natural+Product.">A Predictive Model for Selective Targeting of the Warburg Effect through GAPDH Inhibition with a Natural Product.</a> Cell Metabolism. 26, 648-659 (2017).</li><li>Lundgaard, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+neuronal+glucose+uptake+heralds+activity-dependent+increases+in+cerebral+metabolism.">Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism.</a> Nature Communications. 6, 6807 (2015).</li><li>Hermanova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+inhibition+of+fatty-acid+oxidation+synergistically+enhances+the+effect+of+l-asparaginase+in+childhood+ALL+cells.">Pharmacological inhibition of fatty-acid oxidation synergistically enhances the effect of l-asparaginase in childhood ALL cells.</a> Leukemia. 30, 209-218 (2016).</li><li>Malandrino, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+fatty+acid+oxidation+in+adipocytes+and+macrophages+reduces+lipid-induced+triglyceride+accumulation+and+inflammation.">Enhanced fatty acid oxidation in adipocytes and macrophages reduces lipid-induced triglyceride accumulation and inflammation.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308, E756-E769 (2015).</li><li>Patella, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics-based+metabolic+modeling+reveals+that+fatty+acid+oxidation+(FAO)+controls+endothelial+cell+(EC)+permeability.">Proteomics-based metabolic modeling reveals that fatty acid oxidation (FAO) controls endothelial cell (EC) permeability.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics: MCP. 14, 621-634 (2015).</li><li>Chowdhury, S. R., Djordjevic, J., Albensi, B. C., Fernyhough, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+evaluation+of+substrate-dependent+oxygen+consumption+rates+and+mitochondrial+membrane+potential+by+TMRM+and+safranin+in+cortical+mitochondria.">Simultaneous evaluation of substrate-dependent oxygen consumption rates and mitochondrial membrane potential by TMRM and safranin in cortical mitochondria.</a> Bioscience Reports. 36, e00286 (2015).</li><li>Simonnet, H., Vigneron, A., Pouyss&#233;gur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+Techniques+to+Monitor+Mitochondrial+Oxygen+Consumption.">Conventional Techniques to Monitor Mitochondrial Oxygen Consumption.</a> Methods in Enzymology. 542, 151-161 (2014).</li><li>Mart&#237;nez-Reyes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCA+Cycle+and+Mitochondrial+Membrane+Potential+Are+Necessary+for+Diverse+Biological+Functions.">TCA Cycle and Mitochondrial Membrane Potential Are Necessary for Diverse Biological Functions.</a> Molecular Cell. 61, 199-209 (2016).</li><li>Sukumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Membrane+Potential+Identifies+Cells+with+Enhanced+Stemness+for+Cellular+Therapy.">Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy.</a> Cell Metabolism. 23, 63-76 (2016).</li><li>Wundenberg, T., Grabinski, N., Lin, H., Mayr, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+InsP6-kinases+as+InsP6-dephosphorylating+enzymes+provides+a+new+mechanism+of+cytosolic+InsP6+degradation+driven+by+the+cellular+ATP/ADP+ratio.">Discovery of InsP6-kinases as InsP6-dephosphorylating enzymes provides a new mechanism of cytosolic InsP6 degradation driven by the cellular ATP/ADP ratio.</a> The Biochemical Journal. 462, 173-184 (2014).</li><li>Morciano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+luciferase+probes+to+measure+ATP+in+living+cells+and+animals.">Use of luciferase probes to measure ATP in living cells and animals.</a> Nature Protocols. 12, 1542-1562 (2017).</li><li>Chau, M. D. L., Gao, J., Yang, Q., Wu, Z., Gromada, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+21+regulates+energy+metabolism+by+activating+the+AMPK-SIRT1-PGC-1alpha+pathway.">Fibroblast growth factor 21 regulates energy metabolism by activating the AMPK-SIRT1-PGC-1alpha pathway.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 12553-12558 (2010).</li><li>Lee, K. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+energy+metabolic+and+oncogenic+signaling+pathways+in+triple-negative+breast+cancer+by+a+novel+adenosine+monophosphate-activated+protein+kinase+(AMPK)+activator.">Targeting energy metabolic and oncogenic signaling pathways in triple-negative breast cancer by a novel adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) activator.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286, 39247-39258 (2011).</li><li>Godlewski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-451+Regulates+LKB1/AMPK+Signaling+and+Allows+Adaptation+to+Metabolic+Stress+in+Glioma+Cells.">MicroRNA-451 Regulates LKB1/AMPK Signaling and Allows Adaptation to Metabolic Stress in Glioma Cells.</a> Molecular Cell. 37, 620-632 (2010).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+energy+metabolism+in+cultured+cells,+including+human+pluripotent+stem+cells+and+differentiated+cells.">Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells.</a> Nature Protocols. 7, 1068-1085 (2012).</li><li>Kaplon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+role+for+mitochondrial+gatekeeper+pyruvate+dehydrogenase+in+oncogene-induced+senescence.">A key role for mitochondrial gatekeeper pyruvate dehydrogenase in oncogene-induced senescence.</a> Nature. 498, 109-112 (2013).</li><li>Pardee, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+study+of+the+first-in-class+antimitochondrial+metabolism+agent,+CPI-613,+in+patients+with+advanced+hematologic+malignancies.">A phase I study of the first-in-class antimitochondrial metabolism agent, CPI-613, in patients with advanced hematologic malignancies.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 20, 5255-5264 (2014).</li><li>Stein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defined+metabolic+state+in+pre+B+cells+governs+B-cell+development+and+is+counterbalanced+by+Swiprosin-2/EFhd1.">A defined metabolic state in pre B cells governs B-cell development and is counterbalanced by Swiprosin-2/EFhd1.</a> Cell Death and Differentiation. 24, 1239-1252 (2017).</li><li>Hru&#353;&#225;k, O., Porwit-MacDonald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+expression+patterns+reflecting+genotype+of+acute+leukemias.">Antigen expression patterns reflecting genotype of acute leukemias.</a> Leukemia. 16, 1233-1258 (2002).</li><li>Amin, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Having+a+higher+blast+percentage+in+circulation+than+bone+marrow:+clinical+implications+in+myelodysplastic+syndrome+and+acute+lymphoid+and+myeloid+leukemias.">Having a higher blast percentage in circulation than bone marrow: clinical implications in myelodysplastic syndrome and acute lymphoid and myeloid leukemias.</a> Leukemia. 19, 1567-1572 (2005).</li></ol>

El protocolo anteriormente descrito permite la medición de la actividad metabólica determinada por valores de OCR y ECAR en ráfagas leucémicas primarias derivadas de pacientes con leucemia linfoblástica aguda (LLA) o leucemia mieloide aguda (AML). La ventaja de la medida usando un analizador de flujo extracelular es que permite la detección de perfil metabólico en el tiempo real en las células vivas. Esencialmente, cada paso en el protocolo proporcionado podría ajustarse dependiendo del tipo de célula se planea...

El perfil metabólico es una de las principales características de las células y alteración bioenergética se consideran uno de los sellos del cáncer1,2,3. Además, cambios en la configuración de metabólica podrían utilizarse en el tratamiento del cáncer, dirigiéndose a vías de transducción de señal o maquinaria enzimática de las células de cáncer4,5,6. Sabiendo la predisposición metabólica de las células cancerosas es una ventaja y puede ayudar a mejorar la terapia actual.
Hay un montón de métodos ya establecidos que puede evaluar la actividad metabólica de las células en cultivo. Con respecto a la glucólisis, la captación de glucosa puede medirse mediante el etiquetado radiactivo, utilizando 2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) o niveles de lactato extracelular medición enzimáticamente7,8. Tasa de oxidación de ácidos grasos es otro parámetro metabólico medido por palmitato marcado isotópicamente9,10. Tasa de consumo de oxígeno es un método ampliamente utilizado para la determinación de la actividad mitocondrial en células11,12, junto con la membrana mitocondrial potencial evaluación13,14, ATP/ADP (adenosina 5-difosfato de adenosina-trifosfato/5′) relación medida15 o total intracelular ATP medida16. Vías que regulan procesos metabólicos de señalización podría ser determinado por cuantificaciones de proteína y puede mejorar la comprensión de las mediciones metabólicas17,18,19.
Sin embargo, todos estos métodos de medir sólo uno o, en el mejor escenario, algunos parámetros metabólicos en una muestra al mismo tiempo. Lo importante, medición simultánea de la tasa de consumo de oxígeno (OCR) y la tasa de acidificación extracelular (ECAR) puede lograrse mediante el análisis de flujo extracelular por, por ejemplo, analizador de XFp de Caballito de mar. OCR es un indicador de la respiración mitocondrial y ECAR es principalmente el resultado de la glicolisis (que no podemos ignorar la producción de CO2 elevar posiblemente ECAR de células con actividad de fosforilación oxidativa alta)20. Hasta ahora, se han estudiado diversos tipos celulares usando estos analizadores21,22,23.
Aquí describimos el protocolo para el análisis de flujo extracelular de primarias blastos (células de leucemia derivadas de la etapa hematopoyética inmadura) de pacientes con leucemia. A lo mejor de nuestro conocimiento, un protocolo específico para ráfagas primarios no está disponible todavía.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biosera</td>
			<td>FB-1001/100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+) Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8375-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A from Streptomyces sp.</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Base Medium, 100 mL</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103193-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine solution, 200 mM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution, 1 M, pH 7.0-7.6</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE17-1440-02</td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp FluxPak</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103022-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#8482; Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>CB40240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Analyzer XFp</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>S7802A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp Cell Culture Miniplate</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103025-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells

El requerimiento metabólico de las células cancerosas puede influir negativamente la supervivencia y la eficacia del tratamiento. En la actualidad, dirigidos a farmacéuticos de vías metabólicas se prueban en muchos tipos de tumores. Así, caracterización de configuración metabólica de célula de cáncer es inevitable con el fin de orientar el camino correcto para mejorar el resultado global de los pacientes. Lamentablemente, en la mayoría de los cánceres, las células malignas son muy difíciles de obtener en números más altos y se requiere la biopsia de tejido. La leucemia es una excepción, donde un número suficiente de células leucémicas puede ser aislado de la médula ósea. Presentamos un protocolo detallado para el aislamiento de las células leucémicas de pacientes de leucemia la médula ósea y posterior análisis de su estado metabólico utilizando analizador de flujo extracelular. Las células leucémicas están aisladas por gradiente de densidad, que no afecta su viabilidad. El siguiente paso de cultivo ayuda a regenerar, por lo tanto el estado metabólico medido es el estado de las células en óptimas condiciones. Este protocolo permite obtener resultados consistentes y bien estandarizados, que podrían ser utilizados para la terapia personalizada.

La figura 3 muestra las curvas después de prueba de tensión de la glucólisis y las mediciones de prueba de estrés celular Mito de ráfagas leucémicas del BCP-ALL (de células B precursoras leucemia linfoblástica aguda) y pacientes AML (leucemia mieloide aguda). También se indica el cálculo de los parámetros metabólicos de estas mediciones. fueron sembradas 500.000 células por pozo y todas las mediciones se hicieron en hexaplicates.
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Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Aquí presentamos un protocolo para el aislamiento de las células leucémicas de pacientes de leucemia la médula ósea y análisis de su estado metabólico. Evaluación del perfil metabólico de las células leucémicas primarias podría ayudar a caracterizar mejor la demanda de células primarias y podría conducir a la medicina más personalizada.

Evaluación del perfil metabólico de las células leucémicas primarias

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave con respecto a la configuración de la vía metabólica en las células de la leucemia. La principal ventaja de esta técnica es que permite medir el metabolismo de las células primarias de leucemia en tiempo real en células vivas. Comience diluyendo una muestra de médula ósea obtenida de un paciente con leucemia en PBS en una proporción de uno a uno.Con cuidado, capa seis mililitros de la muestra de médula ósea diluida sobre seis mililitros de medio de gradiente de densidad recién preparado en un tubo cónico de 15 mililitros y separar las células por centrifugación de gradiente de densidad. Utilice una pipeta Pasteur para transferir cuidadosamente la capa de interfaz de las células mononucleares a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros que contenga cinco mililitros de PBS para un lavado de centrifugación. Luego, resuspendir el pellet de célula mononuclear en dos mililitros de PBS estéril para el conteo.Diluir las células a tres veces 10 a las siete células por mililitro de concentración. Y añadir un mililitro de células a cada uno de los dos matraces T75 que contienen 20 mililitros de medio RPMI para una incubación de 16 a 24 horas a 37 grados Celsius y 5%CO2. Mientras tanto, para preparar las placas para el análisis de flujo extracelular, agregue 12,5 microlitros de solución adhesiva celular en cada pozo de dos, ocho placas de analizador de flujo extracelular bien.Después de 20 minutos, aspirar el adhesivo celular y lavar cada pozo dos veces con 200 microlitros de agua estéril por lavado. Después del segundo lavado, deje las placas en el capó hasta que los pozos estén secos. Y coloque el cartucho del sensor boca abajo en el banco del laboratorio.Separe la placa de servicio y el cartucho del sensor del analizador de flujo. Y llene cada pozo de la placa de utilidad con 200 microlitros de calibrador y cada foso alrededor del exterior de los pozos con 400 microlitros de calibrador. Vuelva a colocar el cartucho del sensor en la placa de utilidad que ahora contiene el calibrador y coloque el conjunto del cartucho en una incubadora humidificada de 37 grados Centígrados sin CO2 durante la noche.A continuación, encienda el analizador de flujo extracelular y déjelo calentar a 37 grados Celsius durante la noche. A la mañana siguiente, transfiera las células del matraz a tubos cónicos de 50 mililitros para centrifugación. Y resuspender los pellets en un mililitro del medio experimental apropiado para el conteo.Resuspender las células a cuatro veces 10 a las seis células en 400 microlitros de concentración media experimental. Y agregue 50 microlitros de células en los pozos B a G de la placa del analizador de flujo. Y 180 microlitros del medio experimental en pozos A y H como los pozos de control de fondo.Después de la centrifugación lenta y cuidadosamente añadir 130 microlitros del medio experimental a pozos B a través de G.Y confirmar visualmente la adherencia estable de las células a la parte inferior de cada pozo bajo el microscopio. A continuación, devuelva la placa de análisis de flujo a la incubadora humidificada de 37 grados Centígrados sin CO2 durante 30 minutos. 20 minutos antes del final de la incubación, cargue los compuestos en los puertos de inyector apropiados del cartucho de acuerdo con el protocolo experimental como se indica en la tabla.A continuación, configure el programa de análisis de flujo extracelular adecuado. Inicie el programa y sustituya la placa calibrante por la placa de ensayo cuando se le solicite. En una prueba de estrés de glucólisis, sólo se utiliza medio basal para que las células se ven privadas de nutrientes.El primer parámetro obtenido es la acidificación basal que debe reflejar la cantidad de glucosa almacenada en las células. Después de la primera inyección, la tasa de acidificación extracelular aumenta a medida que las células utilizan la glucosa y pueden fermentar la glucosa para lactato. La oligomicina A en la segunda inyección inhibe ATP sintasa y por lo tanto dirige a las células a producir ATP principalmente por una glucólisis causando una mayor elevación de la tasa de acidificación extracelular.Mientras que la inyección de 2-Deoxy-D-glucose inhibe completamente la glucólisis y la tasa de acidificación extracelular disminuye. En la prueba de estrés mito celular, se utiliza un medio complementado con glutamina y glucosa para que las células no se priven de todos los nutrientes. El parámetro de respiración basal refleja su estado metabólico basal.Después de la primera inyección con oligomicina A, las células inhiben la respiración mitocondrial y cambian a la glucólisis que se representa como una disminución en la tasa de consumo de oxígeno. La segunda y tercera inyecciones de FCCP, sin embargo, desacopla la producción de ATP de la respiración para que las células ahora consuman oxígeno a un ritmo máximo. Y la tasa de consumo de oxígeno sube a su valor más alto.La última inyección de la mezcla de rotenona y antimicina A inhibe completamente la respiración mitocondrial disminuyendo la tasa de consumo de oxígeno a casi cero. Al intentar este procedimiento, es importante evaluar el porcentaje de explosiones en la muestra para asegurarse de que los parámetros metabólicos de los leucemiablasts sólo se miden. Al implementar este método, se debe aplicar una optimización cuidadosa a las condiciones de cultivo y a la normalización de los datos.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Investigación

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Preparación y análisis metabólico de 3 dimensiones del esferoide co-cultivos de células de cáncer de páncreas y fibroblastos

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Citometría de flujo para estimar las células madre de leucemia la leucemia mieloide aguda primaria y el paciente-derivado-xenoinjertos, diagnóstico y seguimiento hasta

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Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

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Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

Fraccionamiento subcelular de células de leucemia linfocítica crónica primaria para monitorear el tráfico de proteínas nucleares/citoplasmáticas

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

Dos Enfoques Citométricos De Flujo De La Detección De Superficie Del Ligando NKG2D Para Distinguir Las Células Madre De Las Subpoblaciones A Granel En La Leucemia Mieloide Aguda

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

Trasplante intraperitoneal para la generación de leucemia mieloide aguda en ratones

There is an unmet need for novel therapies to treat acute myeloid leukemia (AML) and the associated relapse that involves persistent leukemia stem cells ...

Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model

Evaluación de los efectos tóxicos asociados a las células T del receptor de antígeno quimérico mediante un modelo de ratón de xenoinjerto derivado de pacientes con leucemia linfoblástica aguda

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy has emerged as a powerful tool for the treatment of multiple types of CD19+ malignancies, which has led to ...