Name: assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells
Uploaded: 2018-11-21T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells at JoVE.com

Vi vill tacka de tjeckiska pediatriska hematologi centra. Detta arbete var stöds av Grant av hälsoministeriet (NV15-28848A), av hälsoministeriet av Tjeckien, University Hospital Motol, Prag, Tjeckien 00064203 och ministeriet för utbildning, ungdom och sport NPU jag nr. LO1604.

Alla prover erhölls med informed consent av barnens föräldrar eller vårdnadshavare och godkännande av etisk kommitté vid Karlsuniversitetet i Prag, Tjeckien, studien ingen. NV15-28848A.
1. beredning av reagens
<ol><li>Förbereda 500 mL PBS genom upplösning 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4, 1,47 mM KH2PO4, i ddH2O. Justera pH till 7,4 med HCl. Sterilize genom autoklavering.</li>
	<li>Bereda 100 mL RPMI medium: RPMI-1640 medi...

<ol>
	<li>DeBerardinis, R. J., Lum, J. J., Hatzivassiliou, G., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biology+of+Cancer:+Metabolic+Reprogramming+Fuels+Cell+Growth+and+Proliferation.">The Biology of Cancer: Metabolic Reprogramming Fuels Cell Growth and Proliferation.</a> Cell Metabolism. 7, 11-20 (2008).</li><li>Ward, P. S., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Reprogramming:+A+Cancer+Hallmark+Even+Warburg+Did+Not+Anticipate.">Metabolic Reprogramming: A Cancer Hallmark Even Warburg Did Not Anticipate.</a> Cancer Cell. 21, 297-308 (2012).</li><li>Pavlova, N. N., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Emerging+Hallmarks+of+Cancer+Metabolism.">The Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism.</a> Cell Metabolism. 23, 27-47 (2016).</li><li>Wise, D. R., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+addiction:+a+new+therapeutic+target+in+cancer.">Glutamine addiction: a new therapeutic target in cancer.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35, 427-433 (2010).</li><li>Kroemer, G., Pouyssegur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Cell+Metabolism:+Cancer's+Achilles'+Heel.">Tumor Cell Metabolism: Cancer's Achilles' Heel.</a> Cancer Cell. 13, 472-482 (2008).</li><li>Liberti, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Predictive+Model+for+Selective+Targeting+of+the+Warburg+Effect+through+GAPDH+Inhibition+with+a+Natural+Product.">A Predictive Model for Selective Targeting of the Warburg Effect through GAPDH Inhibition with a Natural Product.</a> Cell Metabolism. 26, 648-659 (2017).</li><li>Lundgaard, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+neuronal+glucose+uptake+heralds+activity-dependent+increases+in+cerebral+metabolism.">Direct neuronal glucose uptake heralds activity-dependent increases in cerebral metabolism.</a> Nature Communications. 6, 6807 (2015).</li><li>Hermanova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+inhibition+of+fatty-acid+oxidation+synergistically+enhances+the+effect+of+l-asparaginase+in+childhood+ALL+cells.">Pharmacological inhibition of fatty-acid oxidation synergistically enhances the effect of l-asparaginase in childhood ALL cells.</a> Leukemia. 30, 209-218 (2016).</li><li>Malandrino, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+fatty+acid+oxidation+in+adipocytes+and+macrophages+reduces+lipid-induced+triglyceride+accumulation+and+inflammation.">Enhanced fatty acid oxidation in adipocytes and macrophages reduces lipid-induced triglyceride accumulation and inflammation.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308, E756-E769 (2015).</li><li>Patella, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics-based+metabolic+modeling+reveals+that+fatty+acid+oxidation+(FAO)+controls+endothelial+cell+(EC)+permeability.">Proteomics-based metabolic modeling reveals that fatty acid oxidation (FAO) controls endothelial cell (EC) permeability.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics: MCP. 14, 621-634 (2015).</li><li>Chowdhury, S. R., Djordjevic, J., Albensi, B. C., Fernyhough, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+evaluation+of+substrate-dependent+oxygen+consumption+rates+and+mitochondrial+membrane+potential+by+TMRM+and+safranin+in+cortical+mitochondria.">Simultaneous evaluation of substrate-dependent oxygen consumption rates and mitochondrial membrane potential by TMRM and safranin in cortical mitochondria.</a> Bioscience Reports. 36, e00286 (2015).</li><li>Simonnet, H., Vigneron, A., Pouyss&#233;gur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+Techniques+to+Monitor+Mitochondrial+Oxygen+Consumption.">Conventional Techniques to Monitor Mitochondrial Oxygen Consumption.</a> Methods in Enzymology. 542, 151-161 (2014).</li><li>Mart&#237;nez-Reyes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCA+Cycle+and+Mitochondrial+Membrane+Potential+Are+Necessary+for+Diverse+Biological+Functions.">TCA Cycle and Mitochondrial Membrane Potential Are Necessary for Diverse Biological Functions.</a> Molecular Cell. 61, 199-209 (2016).</li><li>Sukumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Membrane+Potential+Identifies+Cells+with+Enhanced+Stemness+for+Cellular+Therapy.">Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy.</a> Cell Metabolism. 23, 63-76 (2016).</li><li>Wundenberg, T., Grabinski, N., Lin, H., Mayr, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+InsP6-kinases+as+InsP6-dephosphorylating+enzymes+provides+a+new+mechanism+of+cytosolic+InsP6+degradation+driven+by+the+cellular+ATP/ADP+ratio.">Discovery of InsP6-kinases as InsP6-dephosphorylating enzymes provides a new mechanism of cytosolic InsP6 degradation driven by the cellular ATP/ADP ratio.</a> The Biochemical Journal. 462, 173-184 (2014).</li><li>Morciano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+luciferase+probes+to+measure+ATP+in+living+cells+and+animals.">Use of luciferase probes to measure ATP in living cells and animals.</a> Nature Protocols. 12, 1542-1562 (2017).</li><li>Chau, M. D. L., Gao, J., Yang, Q., Wu, Z., Gromada, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+21+regulates+energy+metabolism+by+activating+the+AMPK-SIRT1-PGC-1alpha+pathway.">Fibroblast growth factor 21 regulates energy metabolism by activating the AMPK-SIRT1-PGC-1alpha pathway.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 12553-12558 (2010).</li><li>Lee, K. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+energy+metabolic+and+oncogenic+signaling+pathways+in+triple-negative+breast+cancer+by+a+novel+adenosine+monophosphate-activated+protein+kinase+(AMPK)+activator.">Targeting energy metabolic and oncogenic signaling pathways in triple-negative breast cancer by a novel adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) activator.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286, 39247-39258 (2011).</li><li>Godlewski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-451+Regulates+LKB1/AMPK+Signaling+and+Allows+Adaptation+to+Metabolic+Stress+in+Glioma+Cells.">MicroRNA-451 Regulates LKB1/AMPK Signaling and Allows Adaptation to Metabolic Stress in Glioma Cells.</a> Molecular Cell. 37, 620-632 (2010).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+energy+metabolism+in+cultured+cells,+including+human+pluripotent+stem+cells+and+differentiated+cells.">Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells.</a> Nature Protocols. 7, 1068-1085 (2012).</li><li>Kaplon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+role+for+mitochondrial+gatekeeper+pyruvate+dehydrogenase+in+oncogene-induced+senescence.">A key role for mitochondrial gatekeeper pyruvate dehydrogenase in oncogene-induced senescence.</a> Nature. 498, 109-112 (2013).</li><li>Pardee, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+study+of+the+first-in-class+antimitochondrial+metabolism+agent,+CPI-613,+in+patients+with+advanced+hematologic+malignancies.">A phase I study of the first-in-class antimitochondrial metabolism agent, CPI-613, in patients with advanced hematologic malignancies.</a> Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 20, 5255-5264 (2014).</li><li>Stein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defined+metabolic+state+in+pre+B+cells+governs+B-cell+development+and+is+counterbalanced+by+Swiprosin-2/EFhd1.">A defined metabolic state in pre B cells governs B-cell development and is counterbalanced by Swiprosin-2/EFhd1.</a> Cell Death and Differentiation. 24, 1239-1252 (2017).</li><li>Hru&#353;&#225;k, O., Porwit-MacDonald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+expression+patterns+reflecting+genotype+of+acute+leukemias.">Antigen expression patterns reflecting genotype of acute leukemias.</a> Leukemia. 16, 1233-1258 (2002).</li><li>Amin, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Having+a+higher+blast+percentage+in+circulation+than+bone+marrow:+clinical+implications+in+myelodysplastic+syndrome+and+acute+lymphoid+and+myeloid+leukemias.">Having a higher blast percentage in circulation than bone marrow: clinical implications in myelodysplastic syndrome and acute lymphoid and myeloid leukemias.</a> Leukemia. 19, 1567-1572 (2005).</li></ol>

Ovan beskrivna protokollet tillåter för mätning av den metaboliska aktiviteten bedömt OCR och ECAR värden i primära leukemiska Blaster härrör från patienter med akut lymfatisk leukemi (ALL) eller akut myeloisk leukemi (AML). Fördelen med mätning med en extracellulär flux analysator är att det möjliggör upptäckt av metabola profilen i realtid i levande celler. I huvudsak kunde varje steg i enlighet med protokollet justeras beroende på vilken celltyp en planerar att studera. Här, kommer vi att diskutera d...

Den metabola profilen är en av de viktigaste egenskaperna hos celler och förändrad bioenergetik anses nu vara ett av kännetecknen av cancer1,2,3. Dessutom skulle förändringar i metabola setup kunna användas i behandling av cancer genom att rikta cellsmedierade reaktioner eller enzymatisk maskiner cancer celler4,5,6. Att veta den metabola anlag för cancerceller är således en fördel och kan bidra till att förbättra den nuvarande behandlingen.
I området i närheten finns det gott om redan etablerade metoder som kan bedöma den metaboliska aktiviteten av celler i kultur. Angående glykolys, kan glukosupptag mätas av radioaktiva märkningen, med 2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) eller extracellulära laktat nivåer mätt enzymatiskt7,8. Fettsyra är oxidation en annan metabolisk parameter mätt med isotopically märkta palmitat9,10. Syre materialåtgången är en metod som ofta används för att bestämma mitokondriell aktivitet i cellerna11,12, tillsammans med den mitokondriella membranet potentiella utvärdering13,14, ATP/ADP (adenosin 5 '-trifosfat/5′-adenosindifosfat) baserat på mätning15 eller totalt intracellulära ATP mätning16. Signalering vägar kända för att reglera metabola processer kunde fastställas av protein kvantifieringar och kan förbättra förståelsen av metabola mätningar17,18,19.
Men alla dessa metoder mäter endast en eller, i bästa fall, några metabola parametrar i en prov samtidigt. Ännu viktigare, kan samtidig mätning av syre materialåtgången (OCR) och extracellulära försurning rate (ECAR) uppnås genom den extracellulära flux analysen av, till exempel Seahorse XFp Analyzer. OCR är en indikator på mitokondriell respiration och ECAR är huvudsakligen en följd av glykolys (vi inte kan ignorera CO2 produktion möjligen upphöja ECAR celler med hög oxidativ fosforylering aktivitet)20. Hittills har har olika celltyper studerats med hjälp av dessa analysatorer21,22,23.
Här beskriver vi protokollet för extracellulära flux analys av primära Blaster (leukemiceller från omogna hematopoetiska scenen) från leukemipatienter med. Till bäst av vår kunskap är ett visst protokoll för primära Blaster inte tillgänglig ännu.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biosera</td>
			<td>FB-1001/100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+) Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8375-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A from Streptomyces sp.</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Base Medium, 100 mL</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103193-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine solution, 200 mM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution, 1 M, pH 7.0-7.6</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE17-1440-02</td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp FluxPak</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103022-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#8482; Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>CB40240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Analyzer XFp</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>S7802A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFp Cell Culture Miniplate</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>103025-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells

Den metabola kraven av cancerceller kan negativt påverka överlevnad och behandlingseffektivitet. Nuförtiden, är farmaceutiska inriktningen av metaboliska vägar testad i många typer av tumörer. Karakterisering av cancer cell metabola setup är alltså oundvikliga för att rikta den rätta vägen för att förbättra det totala resultatet av patienter. Tyvärr i de flesta cancerformer, elakartade cellerna är ganska svårt att få i högre siffror och vävnad biopsi krävs. Leukemi är ett undantag, där ett tillräckligt antal leukemic celler kan isoleras från benmärgen. Här, ger vi ett detaljerat protokoll för isolering av leukemiska celler från benmärg leukemi patienter och efterföljande analys av deras metaboliska tillstånd att använda extracellulära flux analyzer. Leukemiska celler isoleras av täthetlutningen, som inte påverkar deras livskraft. Nästa odling steg hjälper dem att regenerera, således den metabola stat mätt är densamma av celler i optimala förhållanden. Detta protokoll tillåter att uppnå konsekvent, väl standardiserade resultat, som skulle kunna användas för personlig terapin.

Figur 3 visar kurvorna efter glykolys stresstest och Cell Mito stresstest mätningar av leukemiska Blaster från BCP-ALL (B-cell prekursor akut lymfatisk leukemi) och AML (akut myeloisk leukemi) patienter. Beräkning av metabola parametrar från dessa mätningar är också indicerat. 500 000 celler per brunn var seedad och alla mätningar utfördes i hexaplicates.
I stresstestet glykolys används en...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells at JoVE.com

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Här presenterar vi ett protokoll för isolering av leukemiska celler från benmärg leukemi patienter och analys av deras metaboliska tillstånd. Bedömning av den metabola profilen av primära leukemiceller kan bidra till att bättre karaktärisera efterfrågan av primära celler och leda till mer personlig medicin.

Bedömning av den metabola profilen av primära leukemiceller

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Denna metod kan hjälpa till att svara på viktiga frågor angående metabolisk väg setup i leukemiceller. Den största fördelen med denna teknik är att det möjliggör mätning av metabolismen av primära leukemiceller i realtid i levande celler. Börja med att späda ut ett benmärgsprov som erhållits från en leukemi patient i PBS på en en till ett förhållande.Försiktigt, lager sex milliliter av det utspädda benmärgsprovet över sex milliliter av nyberedda densitetsgradientmedium i ett koniskt rör på 15 milliliter och separera cellerna genom densitetsgradientcentrifugation. Använd en Pasteur pipet för att noggrant överföra gränssnittsskiktet av mononukleära celler till ett nytt koniskt rör på 50 milliliter som innehåller fem milliliter PBS för en centrifugationstvätt. Sedan, återanvända mononukleära cell pelleten i två milliliter av steril PBS för räkning.Späd cellerna till en tre gånger 10 till de sju cellerna per milliliter koncentration. Och tillsätt en milliliter celler till var och en av två T75 kolvar som innehåller 20 milliliter RPMI medium för en 16 till 24 timmars inkubation vid 37 grader Celsius och 5%CO2. Under tiden för att förbereda plattorna för extracellulär flux analys, tillsätt 12,5 mikroliter av celllimlösning i varje brunn av två, åtta väl extracellulära flux analysatorplattor.Efter 20 minuter, aspirera cellen lim och tvätta varje brunn två gånger med 200 mikroliter sterilt vatten per tvätt. Efter den andra tvätten, lämna plattorna i huven tills brunnarna är torra. Och placera sensorpatronen upp och ner på labbbänken.Separera nyttoplattan och sensorpatronen för flussanalysatorn. Och fyll varje brunn av verktyget plattan med 200 mikroliter av calibrant och varje vallgrav runt utsidan av brunnarna med 400 mikroliter av calibrant. Returnera sensorpatronen till bruksplattan som nu innehåller kalibraren och placera patronenheten i en befuktad 37 grader Celsius inkubator utan CO2 över natten.Slå sedan på extracellulär fluxanalysator och låt den värma till 37 grader Celsius över natten. Nästa morgon, överför cellerna från kolven till 50 milliliter koniska rör för centrifugeringen. Och resuspend pellets i en milliliter av lämpligt experimentellt medium för räkning.Resuspend cellerna på fyra gånger 10 till de sex cellerna i 400 mikroliter av experimentell medelkoncentration. Och tillsätt 50 mikroliter celler i brunnar B genom G av fluxanalysatorplattan. Och 180 mikroliter av experimentmediet i brunnarna A och H som bakgrundskontroll brunnarna.Efter centrifugeringen långsamt och försiktigt lägga 130 mikroliter av det experimentella mediet till brunnar B genom G.And visuellt bekräfta stabil följsamhet av cellerna till botten av varje brunn under mikroskopet. Sedan tillbaka flux analysplattan till den befuktade 37 grader Celsius inkubator utan CO2 i 30 minuter. 20 minuter före inkubationens, lasta i föreningarna i de lämpliga injektorportarna på cylinderampullen enligt försöksprotokollet enligt vad som anges i tabellen.Ställ sedan in lämpligt extracellulärt fluxanalysprogram. Starta programmet och sätt tillbaka calibrantplattan med analysplattan när du uppmanas till detta. I ett glykolys stresstest används endast basalt medium så att cellerna berövas näringsämnen.Den första parametern som erhålls är den basala försurningen som bör återspegla mängden glukos som lagras i celler. Efter den första injektionen ökas den extracellulära försurningsgraden eftersom cellerna utnyttjar glukosen och kan jäsa glukosen till laktat. Den oligomalcin A i den andra injektionen hämmar ATP-syntas och därmed styr cellerna att producera ATP främst genom en glykolys orsakar ytterligare förhöjning av extracellulära försurningshastigheten.Medan injektionen av 2-Deoxy-D-glukos helt hämmar glykolys och den extracellulära försurningshastigheten sjunker. I cellen mito stresstest, ett medium kompletteras med glutamin och glukos används så att cellerna inte berövas alla näringsämnen. Parametern för basal andning återspeglar deras basala metaboliska tillstånd.Efter den första injektionen med oligomalcin A hämmar cellerna mitokondriell respiration och växlar till glykolys som representeras som en minskning av syreförbrukningshastigheten. Den andra och tredje injektioner av FCCP dock koppla bort ATP produktionen från andningen så att cellerna nu förbrukar syre på en maximal takt. Och syreförbrukningen stiger till sitt högsta värde.Den sista injektionen av rotenon och antimycin A blandningen hämmar helt mitokondriell andning minskar syreförbrukningen till nästan noll. Medan du försöker detta förfarande, Det är viktigt att bedöma andelen blaster i provet för att säkerställa att de metaboliska parametrarna för leukemiablasts endast mäts. Vid implementering av denna metod måste en noggrann optimering tillämpas på odlingsförhållanden och data normalisering.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

Ett detaljerat protokoll för att karakterisera Murine C1498 cellinje och dess associerade leukemi musmodell

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Förberedelse och metabola haltbestämning av 3-dimensionell sfäroid samtidig kulturer av pankreascancer celler och fibroblaster

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Beredning av primär akut lymfatisk leukemiceller i olika cellcykelns faser av Centrifugal Elutriation

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flödescytometri för att uppskatta leukemi stamceller i primär akut myeloisk leukemi och i Patient-härrör-xenograft, vid diagnos och följa upp

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Rapid Generation of Primary Murine Melanocyte and Fibroblast Cultures

Snabb generering av primär murina melanocyte och fibroblast kulturer

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Flödescytometrisk analys av mitokondriella reaktiva syreradikaler i murina hematopoietiska Stem och progenitorceller och MLL-AF9 driven leukemi

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells to Monitor Nuclear/Cytoplasmic Protein Trafficking

Subcellulär fraktionering av primära kroniska Lymfocytiska leukemiceller för att övervaka nukleär/Cytoplasmatisk protein handel

Nuclear export of macromolecules is often deregulated in cancer cells. Tumor suppressor proteins, such as p53, can be rendered inactive due to aberrant ...

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

Två flödescytometriska metoder för NKG2D Ligand Ytdetektering för att skilja stamceller från bulkunderpopulationer i akut myeloisk leukemi

Within the same patient, absence of NKG2D ligands (NKG2DL) surface expression was shown to distinguish leukemic subpopulations with stem cell properties ...

Intra-Peritoneal Transplantation for Generating Acute Myeloid Leukemia in Mice

Intraperitoneal transplantation för att generera akut myeloisk leukemi hos möss

There is an unmet need for novel therapies to treat acute myeloid leukemia (AML) and the associated relapse that involves persistent leukemia stem cells ...

Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model

Bedömning av chimär antigenreceptor T-cellassocierad toxicitet med hjälp av en akut lymfoblastisk leukemi patient-härledd xenograftmusmodell

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy has emerged as a powerful tool for the treatment of multiple types of CD19+ malignancies, which has led to ...