Name: adult zebrafish injury models to study the effects of prednisolone in regenerating bone tissue
Uploaded: 2018-10-18T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue at JoVE.com

كان يؤيد هذه الدراسة بمنحه مقدمة من مركز "درسدن العلاجات التجدد" ("الزرد كنموذج لكشف آليات فقدان العظام التي يسببها جلوكوكورتيكويد") وعلاوة على ذلك بمنحه قدرها الأوقيانوغرافية الألمانية (ترانسريجيو 67، المشروع 387653785) للمفتاح الخارجي. ونحن ممتنون جداً كاثلين يان وتشيكورو Avinash للتوجيه والمساعدة على أداء trepanation كالفاريا وكسور في أشعة الزعنفة عظمى. تجارب صممت، وتنفيذها وتحليلها من قبل كجم وكيه. FK كتب المخطوطة. كما نود أن نشكر لامبرت كاترين وكوداك نيكول، وأعضاء آخرين من مختبرات نوف والعلامة التجارية للمساعدة التقنية ومناقشة. كما يذهب شكرنا لماريكا فيشر ويتكا ميتشلينج لرعاية الأسماك الممتازة ونوف هنرييت وكوري جوش لتصحيح التجارب المطبعية المخطوط.

وقد أقر جميع الأساليب الموصوفة هنا درسدن لانديسديريكتيون (السماح بالأرقام: "من الألف إلى الياء" د 24-9168.11-1/2008-1، "من الألف إلى الياء" 24-9168.11-1/2011-52، "من الألف إلى الياء" 24-9168.11-1/2013-5، "من الألف إلى الياء" 24-9168.11-1/2013-14، "من الألف إلى الياء" DD24.1--5131/354/87).
1-إعداد مواد وحلول
ملا...

<ol>
	<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). 385, (2000).</li><li>Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intubation-based+anesthesia+for+long-term+time-lapse+imaging+of+adult+zebrafish.">Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish.</a> Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).</li><li>Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetic+screening+in+the+zebrafish+embryo.">Chemical genetic screening in the zebrafish embryo.</a> Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).</li><li>Paul, S., Crump, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+on+skeletal+cell+plasticity+from+studying+jawbone+regeneration+in+zebrafish.">Lessons on skeletal cell plasticity from studying jawbone regeneration in zebrafish.</a> Bonekey Reports. 5, 853 (2016).</li><li>Witten, P. E., Harris, M. P., Huysseune, A., Winkler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+teleost+fish+provide+new+insights+into+human+skeletal+diseases.">Small teleost fish provide new insights into human skeletal diseases.</a> Methods in Cell Biology. 138, 321-346 (2017).</li><li>den Uyl, D., Bultink, I. E., Lems, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+glucocorticoid-induced+osteoporosis.">Advances in glucocorticoid-induced osteoporosis.</a> Current Rheumatology Reports. 13 (3), 233-240 (2011).</li><li>Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+high+content,+in+vivo+model+of+glucocorticoid-induced+osteoporosis.">A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis.</a> Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).</li><li>de Vrieze, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prednisolone+induces+osteoporosis-like+phenotype+in+regenerating+zebrafish+scales.">Prednisolone induces osteoporosis-like phenotype in regenerating zebrafish scales.</a> Osteoporosis International. 25 (2), 567-578 (2014).</li><li>Pasqualetti, S., Congiu, T., Banfi, G., Mariotti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alendronate+rescued+osteoporotic+phenotype+in+a+model+of+glucocorticoid-induced+osteoporosis+in+adult+zebrafish+scale.">Alendronate rescued osteoporotic phenotype in a model of glucocorticoid-induced osteoporosis in adult zebrafish scale.</a> International Journal Of Experimental Pathology. 96 (1), 11-20 (2015).</li><li>Geurtzen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Suppressive+and+Bone+Inhibitory+Effects+of+Prednisolone+in+Growing+and+Regenerating+Zebrafish+Tissues.">Immune Suppressive and Bone Inhibitory Effects of Prednisolone in Growing and Regenerating Zebrafish Tissues.</a> Journal of Bone and Mineral Research. , (2017).</li><li>Geurtzen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+osteoblasts+dedifferentiate+in+response+to+traumatic+bone+injury+in+the+zebrafish+fin+and+skull.">Mature osteoblasts dedifferentiate in response to traumatic bone injury in the zebrafish fin and skull.</a> Development. 141 (11), 2225-2234 (2014).</li><li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish.">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> Institute of Laboratory Animal Resources Journal. 53 (2), 192-204 (2012).</li><li>Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf+signaling+instructs+position-dependent+growth+rate+during+zebrafish+fin+regeneration.">Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration.</a> Development. 132, 5173-5183 (2005).</li><li>Hirasawa, T., Kuratani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+vertebrate+skeleton:+morphology,+embryology,+and+development.">Evolution of the vertebrate skeleton: morphology, embryology, and development.</a> Zoological Letters. 1, 2 (2015).</li><li>Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+neuroepithelial-like+and+radial+glia-like+progenitor+cells+in+cerebellar+regeneration.">Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration.</a> Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).</li><li>Knopf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerates+via+Dedifferentiation+of+Osteoblasts+in+the+Zebrafish+Fin.">Regenerates via Dedifferentiation of Osteoblasts in the Zebrafish Fin.</a> Developmental Cell. 20 (5), 713-724 (2011).</li><li>van Eeden, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+somite+formation+and+patterning+in+the+zebrafish,+Danio+rerio.">Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio.</a> Development. 123, 153-164 (1996).</li><li>Walker, M. B., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-color+acid-free+cartilage+and+bone+stain+for+zebrafish+larvae.">A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry. 82 (1), 23-28 (2007).</li><li>Kyritsis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+inflammation+initiates+the+regenerative+response+in+the+adult+zebrafish+brain.">Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain.</a> Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).</li><li>Oppedal, D., Goldsmith, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+screen+to+identify+novel+inhibitors+of+fin+regeneration+in+zebrafish.">A chemical screen to identify novel inhibitors of fin regeneration in zebrafish.</a> Zebrafish. 7 (1), 53-60 (2010).</li><li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish.">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).</li><li>Spoorendonk, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+and+Cyp26b1+are+critical+regulators+of+osteogenesis+in+the+axial+skeleton.">Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton.</a> Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).</li><li>Gioia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chaperone+activity+of+4PBA+ameliorates+the+skeletal+phenotype+of+Chihuahua,+a+zebrafish+model+for+dominant+osteogenesis+imperfecta.">The chaperone activity of 4PBA ameliorates the skeletal phenotype of Chihuahua, a zebrafish model for dominant osteogenesis imperfecta.</a> Human Molecular Genetics. 26 (15), 2897-2911 (2017).</li><li>Fiedler, I. A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severely+impaired+bone+material+quality+in+Chihuahua+zebrafish+resembles+classical+dominant+human+osteogenesis+imperfecta.">Severely impaired bone material quality in Chihuahua zebrafish resembles classical dominant human osteogenesis imperfecta.</a> Journal of Bone and Mineral Research. , (2018).</li><li>Fisher, S., Jagadeeswaran, P., Halpern, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiographic+analysis+of+zebrafish+skeletal+defects.">Radiographic analysis of zebrafish skeletal defects.</a> Developmental Biology. 264 (1), 64-76 (2003).</li><li>Hayes, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+deformity+in+aged+zebrafish+is+accompanied+by+degenerative+changes+to+their+vertebrae+that+resemble+osteoarthritis.">Spinal deformity in aged zebrafish is accompanied by degenerative changes to their vertebrae that resemble osteoarthritis.</a> PLoS One. 8 (9), e75787 (2013).</li><li>Mitchell, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+osteoarthritis+genetics+in+zebrafish.">New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish.</a> Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).</li><li>Fleming, A., Sato, M., Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+in+vivo+screening+for+bone+anabolic+compounds+with+zebrafish.">High-throughput in vivo screening for bone anabolic compounds with zebrafish.</a> Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 823-831 (2005).</li><li>de Vrieze, E., Zethof, J., Schulte-Merker, S., Flik, G., Metz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+osteogenic+compounds+by+an+ex+vivo+sp7:luciferase+zebrafish+scale+assay.">Identification of novel osteogenic compounds by an ex vivo sp7:luciferase zebrafish scale assay.</a> Bone. 74, 106-113 (2015).</li></ol>

وقد أثبتت الزرد مفيدة في الهيكل العظمى للبحث فيما يتعلق بالعديد. طفرات مختارة تحاكي جوانب أمراض البشرية مثل تكون العظم الناقص أو الفصال العظمى23،24،25،،من2627، واليرقات وكذلك جداول تستخدم تحديد المجمعا...

الزرد تمثل نموذجا حيوان قوية لدراسة التنمية الفقاريات والمرض. وهذا يرجع إلى أن هم الحيوانات الصغيرة التي تتكاثر في شكل جيد للغاية وأن على الجينوم التسلسل الكامل وقابلة للتلاعب1. وتشمل المزايا الأخرى خيار القيام بتصوير العيش المتواصل في مراحل مختلفة، بما في ذلك التصوير في فيفو الزرد الكبار2، والقدرة على أداء شاشات المخدرات عالية الإنتاجية في الزرد اليرقات3. بالإضافة إلى ذلك، الزرد تملك قدرة التجدد عالية في مجموعة متنوعة من الأجهزة والأنسجة بما في ذلك العظام، وهكذا تكون بمثابة نظام مفيد لدراسة أمراض الهيكل العظمى وإصلاح4،5.
مرض ترقق العظام التي يسببها جلوكوكورتيكويد (جيو) الذي ينجم عن العلاج الطويل الأجل مع الكورتيزون، على سبيل المثال أثناء علاج أمراض المناعة الذاتية مثل الربو أو التهاب المفاصل. يطور في حوالي 30% مرضى معاملة جلوكوكورتيكويد جيو ويمثل مشكلة صحية رئيسية6؛ ولذلك، من المهم للتحقق من أثر الكبت المناعي في أنسجة العظام في قدر كبير من التفصيل. وقد وضعت مجموعة متنوعة من نماذج الزرد التي تتعامل مع الآلية المرضية لجيو في السنوات الأخيرة. وقد حملت فقدان العظام جلوكوكورتيكويد بوساطة في الزرد اليرقات، على سبيل المثال، مما أدى إلى تحديد هوية المركبات تكييف زيادة كتلة العظام في شاشة المخدرات7. وعلاوة على ذلك، قد تم تحاكي الآثار المثبطة التي يسببها جلوكوكورتيكويد العظام في جداول الزرد في المختبر و في فيفو8،9. هذه الاختبارات مقنعة جداً النهج، ولا سيما عندما يتعلق الأمر بتحديد هوية الرواية العقاقير المنشطة المثبطة للمناعة والعظام. بيد أنها جزئيا فقط تأخذ في الاعتبار اندوسكيليتون وقد لا أجريت في سياق التجدد. وهكذا، أنها لا تتيح تحقيق الآثار بوساطة جلوكوكورتيكويد خلال طرق سريعة لتكوين العظام الكبار، والتجدد.
نقدم هنا، بروتوكول تمكن الباحثين لدراسة آثار جلوكوكورتيكويد بوساطة على عظام الكبار الزرد تمر بالتجدد. نماذج الإصابة تشمل بتر جزئي زعنفة والذيلية الزرد، trepanation الجمجمة، وكذلك إنشاء الكسور رأي زعنفة (الشكل 1Aج-1)، وهي جنبا إلى جنب مع جلوكوكورتيكويد التعرض عن طريق الحضانة (الشكل 1E ). أننا استخدمت مؤخرا جزءا من هذا البروتوكول لوصف النتائج المترتبة على التعرض البردنيزولون، واحد من الأدوية القشرية توصف عادة، على الكبار الزرد تجديد زعنفة والجمجمة العظم10. في الزرد، الإدارة البردنيزولون يؤدي إلى انتشار osteoblast انخفاض، والتمايز osteoblast غير مكتملة والاستقراء السريع للمبرمج في نسب الوحيدات/بلعم10. في هذا البروتوكول، كما يصف لنا كيف يمكن إدخال الكسور في زعنفة عظمى وحيدة رأي قطاعات11، هذا النهج قد تكون مفيدة عند دراسة الآثار بوساطة جلوكوكورتيكويد على العظام التي تحدث أثناء تصليح الكسر. الأساليب المقدمة هنا سيساعد على مواصلة معالجة الأساسية لآليات العمل جلوكوكورتيكويد في سرعة تجديد العظام، ويجوز أيضا في أماكن أخرى من إدارة المخدرات الجهازية في السياق تجديد الأنسجة الزرد.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Prednisolone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt forceps</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>BD027R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Braun</td>
			<td>5518059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle (0.3x13 mm)</td>
			<td>BD Beckton Dickinson</td>
			<td>30400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro drill</td>
			<td>Cell Point Scientific</td>
			<td>67-1000</td>
			<td>distributed e.g. by Harvard Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel burrs (0.5 &#181;m diameter)</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>19007-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artemia ssp.</td>
			<td>Sanders</td>
			<td>425GR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette (plastic, Pastette)</td>
			<td>Alpha Labs</td>
			<td>LW4111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin red S powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian blue 8 GX</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16 FA</td>
			<td>with QIMAGING RETIGA-SRV camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX10</td>
			<td>with Olympus DP71 or DP80 camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adult zebrafish injury models to study the effects of prednisolone in regenerating bone tissue

الزرد قادرون على تجديد الأجهزة المختلفة، بما في ذلك الملاحق (زعانف) بعد بتر الأطراف. وهذا ينطوي على تجديد العظام، والتي ريجرووس خلال أسبوعين تقريبا بعد الإصابة. وعلاوة على ذلك، الزرد قادرون على شفاء العظام سريعاً بعد تريبانيشن الجمجمة، وإصلاح الكسور التي يمكن إدخالها بسهولة إلى أشعة الزعنفة عظمى الزرد. تمثل هذه فحوصات الإصابة ممكن نماذج تجريبية لاختبار تأثير المخدرات التي تدار على سرعة تشكيل العظام. هنا، نحن تصف استخدام هذه النماذج إصابة 3 واستخدامها مجتمعة مع العلاج جلوكوكورتيكويد المنهجية، التي تمارس الآثار المثبطة وكآبته العظام. نحن توفير سير عمل حول كيفية التحضير للمعالجة المثبطة للمناعة في الزرد الكبار وتوضح كيفية إجراء البتر زعنفة، تريبانيشن كالفاريال العظام والكسور زعنفة، ووصف كيف يؤثر استخدام الكورتيزون كلا تشكيل العظام خلايا الاوستيوبلاستس وخلايا لنسب الوحيدات/بلعم كجزء من الحصانة الفطرية في أنسجة العظام.

وقد استخدم البروتوكول المعروضة هنا مرارا وتكرارا للحث على تكوين العظام السريع أثناء التجديد الزرد زعنفة والجمجمة10،،من1116. في تركيبة مع الأسلوب الذي عرضت الإدارة البردنيزولون، يمكن متابعة الدراسات المتعلقة بالآثار في ?...

Watch this Scientific Journal Video about Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue at JoVE.com

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

نماذج الإصابة الزرد الكبار دراسة آثار البردنيزولون في تجديد أنسجة العظام

هنا، نحن تصف 3 نماذج الإصابة الزرد الكبار واستخدامها مجتمعة مع العلاج بالعقاقير المثبطة للمناعة. نقدم التوجيه على تصوير لتجديد الأنسجة وكشف تمعدن العظام فيه.

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التدخل العلاجي المثبط للمناعة لدراسة الآثار السلبية للأدوية على تجديد الأنسجة ، على وجه الخصوص ، في العظام. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يجمع بين النماذج السابقة لتجديد عظم حمار وحشي مع التعرض للمخدرات النظامية عن طريق غمر حمار وحشي مصاب في مياه السمك المكملة للمخدرات. قبل البدء في الإجراء، وأتمتة واحد رقائق الألومنيوم غطت 600 milliliter beaker لكل حمار وحشي وعدد مناسب من الزجاجات من مياه السمك للتجربة وإعداد الدواء المثبط للمناعة في حلول المكافحة التجريبية من الفائدة.للإصابة ببتر، استخدم ملقط حادة لوضع بعناية حمار وحشي مُجَدَّد على جانبه الجانبي على غطاء معكوس من طبق بيتري عيار 100 ملليمتر واستخدم مشرطًا لإعادة 50٪ من الزعنفة. ثم ضع السمكة في منقار autoclaved يحتوي على 300 ملليلتر من ماء السمك تكمل مع وكيل تجريبي مناسب وتغطية الكدر مع احباط لمنع هروب حمار وحشي. للحث على إصابة كسر زعنفة، ضع حمار وحشي مُغدَّر على جانبه الجانبي في طبق بيتري مغلف من 100 ملليمتر تحت مجهر تشريح ودفع إبرة حقن قليلاً في جزء من أشعة الزعنفة العظمية حتى يظهر صدع.من المهم إدخال كسور كثيرة في الزعنفة لأن هذا قد يضعف الاستقرار إلى حد كبير. ثم نقل الأسماك إلى القارض الذي يحتوي على 300 ملليلتر من ماء السمك تكملة مع العامل التجريبي المناسب. لتوليد إصابة الجمجمة الكالفاري، عقد حمار وحشي تخدير في وضع مستقيم بحيث يتم تصور عظام العجلية بسهولة تحت مجهر تشريح.ضع مثقاب صغير دوار مجهز بت حفر 500 ميكرومتر فوق مركز العظم الأمامي والمس العظام بلطف لإنتاج ثقب في حجم حفر صغيرة. من المهم عدم تحريك الحفر بشكلٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍٍّيّ أثناء إنتاج الإصابة والتوقّف فورًا عند المقاومة التي تسقطها الأنسجة. وإلا، فإن الدماغ سوف يتلف.ثم ضع السمكة في منقار ذاتي التكفا يحتوي على 300 ملليلتر من ماء السمك مع إضافة عامل التجارب المناسبة. تغيير المياه في القارور يوميا عن طريق نقل حمار وحشي ومياه السمك إلى حاوية مؤقتة مناسبة وإعادة ملء الكأس مع المخدرات الطازجة مكملة مياه السمك. ثم استخدام شبكة السمك لإعادة حمار وحشي إلى منقارها.للعلاجات التي تستمر لمدة تصل إلى يومين، لا تطعم حمار وحشي. خلال التجارب الطويلة، قم بإطعام سمك الحمار الوحشي بـ 0.5 إلى ملليلتر واحد من ARTEmia SSP المفقوس كل يومين. لتحليل إصابات الزعنفة، حصاد الغرامة واستخدام ملقط غرامة لفهم زعنفة في حافة واحدة من جذع.استخدام زوج الثاني من ملقط للاستيلاء على حافة جذع المعاكس واضغط قليلا على الأنسجة على الجزء السفلي من الطبق الذي يحتوي على البارد 4٪ PFA لمدة 10 إلى 20 ثانية. كرر تسطيح الزعنفة حسب الضرورة. يجب أن تضع الزعنفة الآن مسطحة دون الشباك.لتخزين عينة طويلة الأجل بعد التثبيت، وغسل الأنسجة مع ثلاثة 20 دقيقة برنامج تلفزيوني يغسل وسلسلة الميثانول التصاعدي. ويمكن بعد ذلك تخزين العينات في 100٪ الميثانول في ناقص 20 درجة مئوية. بالنسبة للتلوين الأحمر Alizarin، rehydrate الميثانول عينات مخزنة في سلسلة الميثانول تنازلي تليها اثنين من يغسل 20 دقيقة في برنامج تلفزيوني وواحد خمس دقائق غسل في الماء الأيونية.بعد الغسيل الأخير، أضف محلول Alizarin Red إلى عينة الأنسجة وحضن العينة في درجة حرارة الغرفة مع هزاز لفترة التلطخ المناسبة. لمسح العينات، علاج الأنسجة مع انخفاض 1٪ سلسلة هيدروكسيد البوتاسيوم الغليسيرول. ثم تخزين العينات في واحد إلى واحد 0.1٪ هيدروكسيد البوتاسيوم إلى 80٪ محلول الجلسرين وجبل الأنسجة مع 80٪ الجلسرين لتخيل.لالطين Calcein، احتضان ما يصل إلى ثلاثة حمار وحشي في وقت واحد في 100 ملليمتر من محلول Calcein لمدة 20 دقيقة في كوب زجاجي مغطى برقائق الألومنيوم. في نهاية الحضانة، نقل الحمار الوحشي إلى وعاء من ماء السمك والسماح للأسماك السباحة لفترة وجيزة قبل نقلها إلى حاوية جديدة من مياه السمك. بعد 20 دقيقة في الكوبر الثاني للحصول على صور حية من تجديد الزعانف ، ضع حمار وحشي تخدير على طبق بيتري مغلفة من agarose وصورة الزعنفة عن طريق المجهر ستيريو.للحصول على صور لعظام الجمجمة المتجددة، ضع سمك الحمار الوحشي منتصبًا في إسفنجة وصور الجمجمة عن طريق المجهر المفلور. العلاج مع بريدنيزولون، على غرار غيرها من جلوكوكورتيكويدات، يؤدي إلى تثبيط شامل لتجديد الزعنفة بما في ذلك تكوين العظام كما تم الكشف عنها من قبل تلطيخ Alizarin الأحمر من الأنسجة الزعنفة السدية الثابتة. وبالمثل ، فإن الدواء له تأثير تأخير على إغلاق إصابة الجمجمة الكالفارية.بسبب كبت المناعة، يمكن أيضًا اكتشاف أعداد الضامة المنخفضة بواسطة الكيمياء المناعية على أقسام الأنسجة المجمدة كما يتضح من استخدام الأجسام المضادة لـ mCherry والأجسام المضادة لـ GFP التي تلطيخ وصبغة MPEG-1 mChergenic المعدلة وراثياً مع أوستريكس إن إف زيرابفيش على عينات أنسجة الجمجمة للحمار الوحشي من الحيوانات المعالجة بريدنيزولون. أثناء محاولة هذه الإجراءات من المهم تقليل التباين في سرعة تجديد العظام عن طريق تنفيذ المقالات إصابة بطريقة قابلة للاستنساخ للغاية. ومن الأهمية بمكان أيضا أن منزل واحد حمار وحشي في الكواب التي تحتوي على autoclaved المياه الأسماك من أجل تجنب العدوى الميكروبية.وسيساعد هذا البروتوكول على مواصلة معالجة الآليات الأساسية لعمل جلوكورتيكويد. على سبيل المثال، في سياق جلوككورتيكود الناجمة عن هشاشة العظام ويمكن أيضا أن تتكيف مع استخدام أدوية أخرى وغيرها من عظم حمار وحشي.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

التجديد الكلى في اسماك الزرد الكبار قبل جنتاميسين المستحثة الإصابات

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

إصابة سفينة الميكانيكية في الزرد الأجنة

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

استخدام نظام تيتون لدراسة الآليات الجزيئية لتجديد الزرد

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

بروتوكولات لتحليل دور خلايا بانيت في التجديد في الأمعاء الفئران باستخدام شرطي<em&gt; جنة المساواة العرقية، السلمون المدخن</em&gt; ماوس نماذج

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a ...

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

الجمع بين الفحص المجهري نيون إينترافيتال (إيففم) مع النماذج الوراثية لدراسة ديناميات Engraftment الخلايا المكونة للدم لمنافذ نخاع العظام

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

بناء نماذج العناصر المحدودة المعنية بالتحقيق في الزرد الفك الميكانيكا الحيوية

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

في فيفو التصوير التعبير المعدلة وراثيا الجينات في الفرد الشبكية الأسلاف في الجنين اسماك الزرد همي لدراسة الخلية التأثيرات Nonautonomous

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

التحاليل النسيجية لإصابات الكبد الكحولية الحادة في الزرد

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

تصوير لايف من ماوس الثانوي باليت فيوجن

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

تشريح وتلطيخ إيممونوفلوريسسينت للفطر الجسم وعلم الخلايا العصبية في أدمغة البالغين melanogaster المورفولوجية

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...