Name: adult zebrafish injury models to study the effects of prednisolone in regenerating bone tissue
Uploaded: 2018-10-18T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af en bevilling af den Center i Regenerative behandlinger Dresden ("zebrafisk som en model til at udrede mekanismerne af glukokortikoid induceret knogletab") og desuden et tilskud af Deutsche Forschungsgemeinschaft (Transregio 67, projekt 387653785) til FK. Vi er meget taknemmelige for Jan Kaslin og Avinash Chekuru deres vejledning og bistand på udfører trepanation calvariae og frakturer i knoklet fin stråler. Eksperimenter blev konstrueret, udført og analyseret af KG og FK. FK skrev manuskriptet. Vi vil også gerne takke Katrin Lambert, Nicole Cudak, og andre medlemmer af de Knopf og mærke labs for teknisk bistand og diskussion. Vores tak går også til Marika Fischer og Jitka Michling for fremragende fisk pleje og Henriette Knopf og Josh Currie for korrekturlæsning håndskriftet.

Alle metoder, der beskrives her blev godkendt af Landesdirektion Dresden (tillade numre: AZ 24D-9168.11-1/2008-1, AZ 24-9168.11-1/2011-52, AZ 24-9168.11-1/2013-5, AZ 24-9168.11-1/2013-14, AZ DD24.1-5131/354/87).
1. forberedelse af materialer og løsninger
Bemærk: Prednisolon, ligesom andre glukokortikoider, fører til immunosuppression. Således skal der træffes forholdsregler til at forhindre infektion i behandlede dyr under eksperimentet. Herom, autoklave glas war...

<ol>
	<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). 385, (2000).</li><li>Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intubation-based+anesthesia+for+long-term+time-lapse+imaging+of+adult+zebrafish.">Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish.</a> Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).</li><li>Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetic+screening+in+the+zebrafish+embryo.">Chemical genetic screening in the zebrafish embryo.</a> Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).</li><li>Paul, S., Crump, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+on+skeletal+cell+plasticity+from+studying+jawbone+regeneration+in+zebrafish.">Lessons on skeletal cell plasticity from studying jawbone regeneration in zebrafish.</a> Bonekey Reports. 5, 853 (2016).</li><li>Witten, P. E., Harris, M. P., Huysseune, A., Winkler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+teleost+fish+provide+new+insights+into+human+skeletal+diseases.">Small teleost fish provide new insights into human skeletal diseases.</a> Methods in Cell Biology. 138, 321-346 (2017).</li><li>den Uyl, D., Bultink, I. E., Lems, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+glucocorticoid-induced+osteoporosis.">Advances in glucocorticoid-induced osteoporosis.</a> Current Rheumatology Reports. 13 (3), 233-240 (2011).</li><li>Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+high+content,+in+vivo+model+of+glucocorticoid-induced+osteoporosis.">A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis.</a> Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).</li><li>de Vrieze, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prednisolone+induces+osteoporosis-like+phenotype+in+regenerating+zebrafish+scales.">Prednisolone induces osteoporosis-like phenotype in regenerating zebrafish scales.</a> Osteoporosis International. 25 (2), 567-578 (2014).</li><li>Pasqualetti, S., Congiu, T., Banfi, G., Mariotti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alendronate+rescued+osteoporotic+phenotype+in+a+model+of+glucocorticoid-induced+osteoporosis+in+adult+zebrafish+scale.">Alendronate rescued osteoporotic phenotype in a model of glucocorticoid-induced osteoporosis in adult zebrafish scale.</a> International Journal Of Experimental Pathology. 96 (1), 11-20 (2015).</li><li>Geurtzen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Suppressive+and+Bone+Inhibitory+Effects+of+Prednisolone+in+Growing+and+Regenerating+Zebrafish+Tissues.">Immune Suppressive and Bone Inhibitory Effects of Prednisolone in Growing and Regenerating Zebrafish Tissues.</a> Journal of Bone and Mineral Research. , (2017).</li><li>Geurtzen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+osteoblasts+dedifferentiate+in+response+to+traumatic+bone+injury+in+the+zebrafish+fin+and+skull.">Mature osteoblasts dedifferentiate in response to traumatic bone injury in the zebrafish fin and skull.</a> Development. 141 (11), 2225-2234 (2014).</li><li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish.">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> Institute of Laboratory Animal Resources Journal. 53 (2), 192-204 (2012).</li><li>Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf+signaling+instructs+position-dependent+growth+rate+during+zebrafish+fin+regeneration.">Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration.</a> Development. 132, 5173-5183 (2005).</li><li>Hirasawa, T., Kuratani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+vertebrate+skeleton:+morphology,+embryology,+and+development.">Evolution of the vertebrate skeleton: morphology, embryology, and development.</a> Zoological Letters. 1, 2 (2015).</li><li>Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+neuroepithelial-like+and+radial+glia-like+progenitor+cells+in+cerebellar+regeneration.">Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration.</a> Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).</li><li>Knopf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerates+via+Dedifferentiation+of+Osteoblasts+in+the+Zebrafish+Fin.">Regenerates via Dedifferentiation of Osteoblasts in the Zebrafish Fin.</a> Developmental Cell. 20 (5), 713-724 (2011).</li><li>van Eeden, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+somite+formation+and+patterning+in+the+zebrafish,+Danio+rerio.">Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio.</a> Development. 123, 153-164 (1996).</li><li>Walker, M. B., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-color+acid-free+cartilage+and+bone+stain+for+zebrafish+larvae.">A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry. 82 (1), 23-28 (2007).</li><li>Kyritsis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+inflammation+initiates+the+regenerative+response+in+the+adult+zebrafish+brain.">Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain.</a> Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).</li><li>Oppedal, D., Goldsmith, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+screen+to+identify+novel+inhibitors+of+fin+regeneration+in+zebrafish.">A chemical screen to identify novel inhibitors of fin regeneration in zebrafish.</a> Zebrafish. 7 (1), 53-60 (2010).</li><li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish.">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).</li><li>Spoorendonk, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+and+Cyp26b1+are+critical+regulators+of+osteogenesis+in+the+axial+skeleton.">Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton.</a> Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).</li><li>Gioia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chaperone+activity+of+4PBA+ameliorates+the+skeletal+phenotype+of+Chihuahua,+a+zebrafish+model+for+dominant+osteogenesis+imperfecta.">The chaperone activity of 4PBA ameliorates the skeletal phenotype of Chihuahua, a zebrafish model for dominant osteogenesis imperfecta.</a> Human Molecular Genetics. 26 (15), 2897-2911 (2017).</li><li>Fiedler, I. A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severely+impaired+bone+material+quality+in+Chihuahua+zebrafish+resembles+classical+dominant+human+osteogenesis+imperfecta.">Severely impaired bone material quality in Chihuahua zebrafish resembles classical dominant human osteogenesis imperfecta.</a> Journal of Bone and Mineral Research. , (2018).</li><li>Fisher, S., Jagadeeswaran, P., Halpern, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiographic+analysis+of+zebrafish+skeletal+defects.">Radiographic analysis of zebrafish skeletal defects.</a> Developmental Biology. 264 (1), 64-76 (2003).</li><li>Hayes, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+deformity+in+aged+zebrafish+is+accompanied+by+degenerative+changes+to+their+vertebrae+that+resemble+osteoarthritis.">Spinal deformity in aged zebrafish is accompanied by degenerative changes to their vertebrae that resemble osteoarthritis.</a> PLoS One. 8 (9), e75787 (2013).</li><li>Mitchell, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+osteoarthritis+genetics+in+zebrafish.">New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish.</a> Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).</li><li>Fleming, A., Sato, M., Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+in+vivo+screening+for+bone+anabolic+compounds+with+zebrafish.">High-throughput in vivo screening for bone anabolic compounds with zebrafish.</a> Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 823-831 (2005).</li><li>de Vrieze, E., Zethof, J., Schulte-Merker, S., Flik, G., Metz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+osteogenic+compounds+by+an+ex+vivo+sp7:luciferase+zebrafish+scale+assay.">Identification of novel osteogenic compounds by an ex vivo sp7:luciferase zebrafish scale assay.</a> Bone. 74, 106-113 (2015).</li></ol>

Zebrafisk har vist sig nyttig i skelet forskning i mange henseender. Valgte mutanter efterligner aspekter af menneskelig sygdom såsom osteogenesis imperfecta eller slidgigt23,24,25,26,27, og larverne samt skalaer der bruges til identificere knogle anabole stoffer i lille molekyle skærme7,28,</su...

Zebrafisk repræsenterer en kraftfuld dyremodel til at studere hvirveldyr udvikling og sygdom. Dette er at de er små dyr, som yngler meget godt og at deres genom er fuldt sekventeret og imødekommenhed over for manipulation1. Andre fordele omfatter muligheden for at udføre fortsatte live imaging på forskellige stadier, herunder i vivo billeddannelse af voksen zebrafisk2, og evnen til at udføre høj overførselshastighed drug skærme i zebrafisk larver3. Desuden zebrafisk besidder en høj regenerative kapacitet i en række organer og væv, herunder knogler, og dermed tjene som et nyttigt system til at studere skelet sygdomme og reparere4,5.
Glukokortikoid-induceret osteoporose (GIO) er en sygdom, der skyldes langvarig behandling med glukokortikoider, for eksempel i forbindelse med autoimmune sygdom behandling såsom astma eller leddegigt. GIO udvikler sig i ca. 30% af glukokortikoid-behandlede patienter og repræsenterer en større sundhed spørgsmål6; Det er derfor vigtigt at undersøge virkningen af immunosuppression på knoglevæv i stor detalje. I de seneste år er blevet udviklet en række forskellige zebrafisk modeller beskæftiger sig med patogenesen af GIO. Glukokortikoid-medieret knogletab er blevet induceret i zebrafisk larver, for eksempel, som førte til identifikation af modsatrettede forbindelser øge knoglemasse i et stof skærmen7. Derudover glukokortikoid induceret knogle hæmmende effekter har været efterlignede i zebrafisk skalerer både in vitro- og i vivo8,9. Disse analyser er meget overbevisende tilgange, især når det kommer til identifikation af roman immunosuppressive og knogle anabolske stoffer. Men de kun delvist tages hensyn til endoskeleton og ikke er blevet udført i forbindelse med regenerativ. Således, de ikke tillader undersøgelse af glukokortikoid-medierede virkninger under hurtige former for voksne, regenerativ knogledannelse.
Vi præsenterer her, en protokol, der gør det muligt for forskere at studere glukokortikoid-medierede virkninger på voksen zebrafisk knogler gennemgår regenerering. Skade modeller omfatter delvis amputation af zebrafisk halefinnen, trepanation af kraniet, samt oprettelsen af fin ray frakturer (figur 1A-1 C), og kombineres med glukokortikoid eksponering via inkubation (figur 1E ). Vi har for nylig brugt en del af denne protokol til at beskrive konsekvenserne af eksponering for Prednisolon, et af almindeligt ordineret kortikosteroid lægemidler, på voksen zebrafisk regenererende fin og kraniet ben10. I zebrafisk fører Prednisolon administration til nedsat osteoblastdannelse spredning, ufuldstændige osteoblastdannelse differentiering og hurtig induktion af apoptose i monocyt/makrofag lineage10. I denne protokol beskrive vi også hvordan frakturer kan indføres i enkelt knoklet fin ray segmenter11, da denne tilgang kan være nyttig, når man studerer glukokortikoid-medierede virkninger på knogle forekommende under fraktur reparation. De metoder, der præsenteres her vil bidrage til yderligere adresse underliggende glukokortikoid virkningsmekanismer i hurtigt regenererende knogle og kan også være ansat i andre indstillinger af systemisk drug administration inden for rammerne af zebrafisk væv revitalisering.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Prednisolone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt forceps</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>BD027R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Braun</td>
			<td>5518059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle (0.3x13 mm)</td>
			<td>BD Beckton Dickinson</td>
			<td>30400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro drill</td>
			<td>Cell Point Scientific</td>
			<td>67-1000</td>
			<td>distributed e.g. by Harvard Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel burrs (0.5 &#181;m diameter)</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>19007-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artemia ssp.</td>
			<td>Sanders</td>
			<td>425GR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette (plastic, Pastette)</td>
			<td>Alpha Labs</td>
			<td>LW4111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin red S powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian blue 8 GX</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16 FA</td>
			<td>with QIMAGING RETIGA-SRV camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX10</td>
			<td>with Olympus DP71 or DP80 camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adult zebrafish injury models to study the effects of prednisolone in regenerating bone tissue

Zebrafisk kan regenerere forskellige organer, herunder vedhæng (finner) efter amputation. Dette indebærer regeneration af knogle, som regrows inden for omkring to uger efter skaden. Desuden zebrafisk er stand til at helbrede ben hurtigt efter trepanation af kraniet, og reparere frakturer, der nemt kan indføres i zebrafisk knoklet fin stråler. Disse skade assays repræsenterer muligt eksperimentelle paradigmer at teste effekten af administreret medicin på hurtigt danner knogle. Her, beskriver vi brugen af disse 3 skade modeller og deres kombinerede anvendelse med systemisk glukokortikoid behandling, som udøver knogle hæmmende og immunosuppressive effekter. Vi leverer en arbejdsproces til at forberede immunosuppressiv behandling i voksen zebrafisk, illustrerer, hvordan du udføre fin amputation, trepanation af calvarial knogler, og fin frakturer, og beskrive, hvordan brugen af glukokortikoider påvirker begge knogler danner osteoblaster og celler af monocyt/makrofag afstamning som del af medfødt immunitet i knoglevæv.

Protokollen præsenteres her er blevet brugt gentagne gange til at fremkalde hurtige knogledannelse under regenerering af zebrafisk fin og kraniet10,11,16. I kombination med metoden præsenteres af Prednisolon administration, kan undersøgelser på prednisolons effekter i knogler regenerering forfølges. Eksempelvis kan gennemføres undersøgelser af knogledannelse og mineralisering i at regenere...

Watch this Scientific Journal Video about Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue at JoVE.com

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Voksen zebrafisk skade modeller at studere virkningerne af Prednisolon i regenererende knoglevæv

Her beskriver vi 3 voksne zebrafisk skade modeller og deres kombinerede anvendelse med immunosuppressiv behandling. Vi vejlede om billeddannelse af regenererende væv og afsløre knoglemineralisering deri.

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål inden for immunsuppressiv terapeutisk intervention til undersøgelse af lægemidlers negative virkninger på vævsregenerering, især i knogler. Den største fordel ved denne teknik er, at det kombinerer tidligere modeller af zebrafisk knogle regenerering med systemisk stof eksponering ved nedsænkning af den sårede zebrafisk i stof suppleret fiskevand. Før proceduren påbegyndes, autoklave en aluminiumsfolie dækket 600 milliliter bægerglas pr Zebrafisk og et passende antal glasflasker fiskevand til forsøget og forberede immunsuppressive stof i eksperimentelle kontrol løsninger af interesse.For en amputation skade, bruge stumpe kraftvipper til omhyggeligt at placere en bedøvet zebrafisk på sin laterale side på det omvendte låg på en 100 millimeter petriskål og bruge en skalpel til at sekælere 50% af finnen. Derefter sættes fisken i et autoklaveret bægerglas med 300 milliliter fiskevand suppleret med passende eksperimentelt middel, og dæk bægerglasset med folie for at forhindre zebrafisk i at undslippe. For at fremkalde en fin fraktur skade, placere en bedøvet Zebrafisk på sin laterale side i en 100 millimeter agarose belagt petriskål under en dissekere mikroskop og skubbe en injektion nål lidt ind i en knoklet fin ray segment, indtil en revne vises.Det er vigtigt at indføre ikke for mange frakturer i finnen, fordi dette i høj grad kan forringe stabiliteten. Fisken overføres derefter til et autoklaveret bægerglas med 300 milliliter fiskevand suppleret med det relevante forsøgsmiddel. For at generere en calvarial kraniet skade, holde en bedøvet Zebrafisk i oprejst position, så calvarial knogler er let visualiseres under en dissektion mikroskop.Placer en roterende mikro boremaskine udstyret med en 500 mikrometer borebit over midten af frontal knoglen og forsigtigt røre ved knoglen til at producere et hul på størrelse med mikro boret burr. Det er afgørende ikke at flytte boret side om side, mens der produceres skaden og til at stoppe straks, når modstanden af vævet falder. Ellers vil hjernen blive beskadiget.Derefter sættes fisken i et autoklaveret bægerglas med 300 milliliter fiskevand suppleret med det relevante forsøgsmiddel. Skift vandet i bægeret dagligt ved at overføre zebrafisk og fiskevandet til en passende midlertidig beholder og genopfylde bægeret med frisk lægemiddel suppleret fiskevand. Brug derefter et fiskenet til at returnere zebrafisken til bægeret.For behandlinger, der varer op til to dage i alt, må zebrafisken ikke fodres. Under længere eksperimenter fodres zebrafisken med 0,5 til en milliliter udklækket Artemia SSP hver anden dag. For fin skade analyse, høste bøden og bruge fine kraftbecer til at gribe finnen på den ene kant af stumpen.Brug et andet par vicesser til at få fat i den modsatte stumpkant og tryk let på vævet på bunden af skålen, som indeholder kolde 4% PFA i 10 til 20 sekunder. Gentag fin udfladning efter behov. Finnen skal nu ligge fladt uden curling.Ved langtidsprøveopbevaring efter fiksering vaskes vævet med tre 20 minutters PBS-vask og en opstigende methanolserie. Prøverne kan derefter opbevares i 100% methanol ved minus 20 grader Celsius. For Alizarin Red farvning, rehydrere methanol lagrede prøver i en faldende methanol serie efterfulgt af to 20 minutter vasker i PBS og en fem minutters vask i deioniseret vand.Efter den sidste vask tilsættes Alizarin Rød opløsning til prøvevævet, og prøven inkuberes ved stuetemperatur med rokkende i den relevante farvningsperiode. For at rydde prøverne, behandles vævet med den faldende 1% kaliumhydroxid glycerol serie. Derefter opbevares prøverne i en en til en 0,1% kaliumhydroxid til 80% glycerol opløsning og montere væv med 80% glycerol til at forestille sig.For Calcein farvning, inkubere op til tre zebrafisk samtidigt i 100 millimeter Calcein opløsning i 20 minutter i et glas bæger dækket med aluminiumsfolie. I slutningen af inkubationen, overføre zebrafisk til en beholder med fiskevand og lad fiskene svømme kort, før du overfører dem til en ny beholder med fiskevand. Efter 20 minutter i det andet bægerglas til at erhverve levende billeder af fin regenererer, placere en bedøvet zebrafisk på en agarose belagt petriskål og billede finnen ved stereo mikroskopi.For at erhverve billeder af de regenererende kranieknogler skal du placere zebrafisken oprejst i en svamp og afbilde kraniet ved fluorescensmikroskopi. Behandling med Prednisolon, svarende til andre glukokortikoider, fører til en samlet hæmning af fin regenerering, herunder knogledannelse som påvist af Alizarin Red farvning af fast halefinnevæv. Tilsvarende, stoffet har forsinkende effekt på calvarial kraniet skade lukning.På grund af immunsuppression kan reducerede makrofagnumre også påvises ved immunhistokkemi på frosne vævssektioner, som det fremgår af brugen af anti-mCherry og anti-GFP antistoffarvning og transgene MPEG-1 mCherry krydset med Osterix NGFP Zebrafisk på zebrafiskkraniets vævsprøver fra Prednisolone-behandlede dyr. Mens du forsøger disse procedurer er det vigtigt at minimere variabiliteten i knoglen regenerering hastighed ved at udføre skaden essays i en meget reproducerbar måde. Det er også afgørende at enkelt hus Zebrafisk i autoklavede bægerglas indeholdende autoklaveret fiskevand for at undgå mikrobiel infektion.Denne protokol vil bidrage til yderligere at løse de underliggende mekanismer for glukokortikoid handling. For eksempel, i forbindelse med glukokortikoid induceret osteoporose og kan også tilpasses til brug af andre lægemidler og andre zebrafisk knogle.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Nyre Regeneration i Adult Zebrafisk af Gentamicin induceret skade

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Mekanisk karskade i zebrafisk embryoner

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Anvendelse af Teton System til Undersøgelse molekylære mekanismer for zebrafisk Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

Protokoller til analyse af rolle Paneth Celler i Regenerating de murine Tarm hjælp Betinget<em&gt; Cre-lox</em&gt; Musemodeller

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a ...

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Kombinerer Intravital fluorescerende mikroskopi (IVFM) med genetiske modeller at studere Engraftment dynamikken i hæmatopoietisk celler til knoglemarven nicher

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Opbygning Finite Element Modeller til undersøgelse Zebrafisk Jaw Biomekanik

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging af transgene genekspression i Individuel Retinal progenitorer i kimære zebrafisk embryoner til Studieinformationen Cell Nonautonomous påvirkninger

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Histologiske analyser af akut alkoholisk leverskader i sebrafisk

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion og immunfluorescent farvning af champignon krop og fotoreceptor neuroner i voksen Drosophila melanogaster hjerner

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...